Summary
אנו מתארים פרוטוקול עבור ויזואליזציה של אינסולין אקסוציטוזה ב איים שלמים באמצעות pHluorin, חלבון פלואורסצנטי ירוק pH-רגיש. איים מבודדים נגועים עם אדנו קידוד pHluorin מצמידים את שלפוחית מטען neuropeptide Y. דבר זה מאפשר הזיהוי של אינסולין גרגר פיוז'ן אירועים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.
Abstract
הפרשת אינסולין ממלא תפקיד מרכזי הומאוסטזיס גלוקוז בתנאים רגילים פיזיולוגיים כמו גם כמו מחלה. לגישות ללמוד אקסוציטוזה גרגר אינסולין שאו להשתמש אלקטרופיזיולוגיה או מיקרוסקופ מצמידים את הביטוי של עיתונאים פלורסנט. עם זאת רוב שיטות אלה מוטבו עבור שורות תאים המשובטים או לדרוש בריא לנגרהנס. לעומת זאת, השיטה המובאת כאן מאפשר הדמיה בזמן אמת של אינסולין אקסוציטוזה גרגר ב לנגרהנס ללא פגע. ב פרוטוקול זה, נתאר תחילה זיהום נגיפי של איים מבודדים הלבלב עם אדנו מקודד רגיש pH חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), pHluorin, מצמידים neuropeptide Y (NPY). שנית, אנו מתארים את קונאפוקלית הדמיה של איים קטנים חמישה ימים לאחר זיהום נגיפי, וכיצד לעקוב גרגר הפרשת אינסולין. בקצרה, איים נגועים מונחת על coverslip על חדר הדמיה, עם תמונה תחת זקוף לסריקת לייזר קונפוקלי במיקרוסקופ תוך כדי להיות perfused ללא הרף עם פתרון חוץ-תאית שמכילה גירויים שונים. תמונות קונאפוקלית פורש 50 מיקרומטר של איון נרכשים כמו בצילום מואץ הקלטות באמצעות סורק מהיר-תהודה. היתוך גרעיני של אינסולין בגרגרים עם קרום פלזמה ניתן בעקבות לאורך זמן. הליך זה גם מאפשר בדיקה סוללה של גירויים בניסוי יחיד תואם גם העכבר וגם איונים האנושית, יכול להיות משולב עם צבעים שונים עבור הדמיה תפקודית (למשל, ממברנה סידן פוטנציאליים או cytosolic צבע).
Introduction
האינסולין המיוצר על ידי תאי ביתא הלבלב איון, וזה המפתח מווסת של מטבוליזם של גלוקוז1. מוות או תפקוד לקוי של תאי הבטא מפריע גלוקוז הומאוסטזיס ומוביל סוכרת2. אינסולין ארוזה בגרגרים ליבה צפופה שפורסמו ב Ca2 +-אופן התלויים3. שחקרתי כמה אינסולין גרגר אקסוציטוזה מוסדר חיוני להבין באופן מלא את מה קובע את הפרשת האינסולין, פותח דרכים חדשות לזיהוי מטרות טיפולית חדשנית לטיפול בסוכרת.
אינסולין אקסוציטוזה נחקרה בהרחבה שימוש בגישות אלקטרופיזיולוגיות, כגון מידות קיבול הממברנה, וגישות מיקרוסקופיים בשילוב עם מולקולות פלורסנט. מידות קיבול הממברנה יש רזולוציה טמפורלית טובים ומאפשרים הקלטות תא בודד. עם זאת, שינויים קיבוליות שישקפו את השינוי השטח נטו של התא ולא ללכוד אירועים בודדים פיוז'ן או להבדיל אינסולין פיוז'ן גרגר אחרים שלפוחית הפרשה ללא אינסולין3. גישות מיקרוסקופיים, כגון השתקפות פנימית שני הפוטונים או סכום מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (TIRF) בשילוב עם הגששים פלורסנט וחלבונים מטען שלפוחית, לספק פרטים נוספים. טכניקות אלה ללכוד אירועים exocytotic יחיד, גם בשלבים שלפני, פוסט-exocytotic והוא יכול לשמש ללימוד דפוסי exocytotic באוכלוסיות של תאים3.
כתבים פלורסנט יכולה להיות משלושה סוגים: 1) חוץ-תאית, cytoplasmic 2) או 3) vesicular. 1) הכתבים חוץ-תאית, המשדרים קוטבי (למשל, dextrans, sulforhodamine B (SRB), לוציפר צהוב, pyranine) זה יכול להיות מוצג דרך חצרו חוץ-תאית4. השימוש של המשדרים קוטבי מאפשר החקירה של הנקבובית פיוז'ן בקרב אוכלוסיה של תאים ו לוכדת מבנים המערכת שונים כגון כלי דם. עם זאת, הם אינם מדווחים על התנהגות מטען שלפוחית. 2) הכתבים cytoplasmic, פלורסנט הגששים מצמידים חלבוני ממברנה-הקשורים פנים הציטופלסמה, מעורבים עגינה והוצאה אקסוציטוזה. דוגמאות כוללות את בני מסיסים N- ethylmaleimide רגיש גורם מצורף חלבון קולטן (מוקש) משפחת בהן השתמשו בהצלחה במדעי המוח ללמוד שחרור נוירוטרנסמיטר5. חלבונים כאלה יש שותפים איגוד מרובים ואינם אינסולין-גרגר ספציפיים. 3) הכתבים vesicular, פלורסנט הגששים התמזגו חלבונים מטען vesicular לאפשר חקירת התנהגות ספציפית מטען שלפוחית. אינסולין-גרגר מטען מסוים חלבונים כוללים אינסולין, c-פפטיד, איון מפוליפפטיד עמילואיד NPY בין היתר6,7. NPY רק נוכח אינסולין המכיל גרגירים, שיתוף שוחרר עם אינסולין, שהופך אותו שותף מצוין כתב פלורסנט8.
היתוך גרעיני של שונה פלורסנט חלבונים כדי NPY כבר מועסקים בעבר לחקור היבטים שונים של אקסוציטוזה תאים נוירואנדוקריניים, כגון הדרישה של synaptotagmin ספציפיים איזופורמים9,10 וכיצד זמן-קורס של שחרור תלוי על שלד התא של אקטין צולבות הקישור חוטים שרירן II11,12. במחקר זה, בחרנו pHluorin כמו הכתבת פלורסנט, אשר GFP ששונה זה הלא-פלורסנט-רמת ה-pH חומצי בתוך ליבה צפופה בגרגרים אך הופך פלורסנט במאור פנים עם חשיפה ה-pH נייטרלי חוץ-תאית13. אינסולין בוגרת בגרגרים יש pH חומצי של מתחת 5.5. ברגע גרגר ולספות עם קרום פלזמה, פותח, את מטענה חשופים חוץ-תאי ה-pH נייטרלי של 7.4, המאפשר השימוש pHluorin ה-pH רגיש חלבונים בתור כתבת7,14.
לאור האופי הרגיש pH של pHluorin ואת הביטוי סלקטיבי של NPY ב אינסולין בגרגרים, הבונה פיוז'ן NPY-pHluorin ניתן ללמוד מאפיינים שונים של אינסולין גרגר אקסוציטוזה. מסירה ויראלי של הבונה פיוז'ן מבטיחה יעילות גבוהה תרביות תאים ועובד על ראשי תאי הבטא או שורות תאים, כמו גם על איים מבודדים. שיטה זו יכולה לשמש גם כקו מנחה ללמוד אקסוציטוזה בכל סוג תא אחר עם שלפוחית המכילה NPY. זה יכול גם להיות משולב עם כל דגם העכבר מהונדס ללמוד על ההשפעות של תנאים מסוימים (נפילות, ביטוי, וכו ') על אקסוציטוזה. טכניקה זו שימש בעבר כדי לאפיין יכולות דפוסי הפרשת האינסולין גרגר באוכלוסיות תאי בטא אנושיים איונים15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ועדת האתיקה בעלי חיים של אוניברסיטת מיאמי אישר את כל הניסויים.
1. נגיפי זיהום של שלם מבודד אנושית או העכבר לנגרהנס
- איון תרבות: להכין את המדיה תרבות איון: קונוט רפואי מחקר מעבדות (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS ו 2 מ מגלוטמין.
- האדם לנגרהנס מתקבלים מתוכנית משולב איון הפצה (NIDDK, NIH). עם ההגעה, העברה של איים קטנים (~ 500 איון מקבילות) עד 35 מ מ הלא-תרביות רקמה מטופלים צלחות פטרי עם 2 מ"ל CMRL תרבות המדיה ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% / 95% CO 2 /O 2 עבור 24 שעות לפני זיהום ויראלי. לנגרהנס
- העכבר ניתן לבודד בעקבות פרוטוקולים שנקבעו קודם 16. בעקבות בידוד, תרבות ~ 200 איון להן מקבילות ב- 35 מ מ הלא-תרביות רקמה מטופלים צלחות פטרי עם 2 מ"ל CMRL תרבות המדיה ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% / 95% CO 2 /O 2 עבור 24 שעות לפני זיהום ויראלי.
הערה: הימנע משימוש העכברים הטרנסגניים עם כתבים GFP או YFP הביע על איים קטנים כדי למנוע קרינה פלואורסצנטית חפיפה עם NPY-pHluorin.
- וירוס הכנה
הערה: פיוז'ן NPY-pHluorin היה משובטים לתוך וקטור pcDNA3 10, subcloned לתוך וקטור adenoviral לייצור adenoviral [אדנו serotype 5 (DE1/E3)] על ידי אדנו רקומביננטי החברה הייצור. הווירוס היה aliquoted ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס. המניה ויראלי מסופק על ידי החברה ב titers של 10 12 13 10 חלקיקים נגיפיים (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).- במבחנה איון זיהום, שימוש 10 6 PFU/mL, והתוצאה ריבוי משוער של זיהום (MOI) של בסביבות 2 (ראה דיון לפרטים)
- נגיפית של לנגרהנס
התראה: עבודה עם adenoviruses מחייב נהלי אבטחה ברמה 2 (BSL2) והסמכה. בדוק עם הקצין אבטחה מוסדיים הדרכה והדרכה על הליכים BSL2.- להכין אדם/עכבר איונים כמתואר לעיל-
- להוסיף 5-10 µL של וירוס מניות כל צלחת פטרי 35 מ מ המכיל האדם/עכבר איים ב- mL 2 אמצעי התרבות CMRL (עם 10% FBS ו 2 מ מגלוטמין).
הערה: להתאים את עוצמת הקול של הנגיף נעשה בהתאם כייל נגיפי כפי שנמסרו על ידי גליון הנתונים של החברה. - תרבות של איים ב המכיל וירוס מדיה-37 °C/5% CO 2 עבור ה 24
- לאחר 24 שעות, תשאף התקשורת המכיל וירוס ולהחליף עם 2 מ"ל CMRL תרבות מדיה (עם 10% FBS ו 2 מ מגלוטמין).
- תרבות של איים קטנים 4-6 ימים-37 °C/5% CO 2, החלפת המדיה כל 3 ימים.
- לאחר 4 - 6 ימים של culturing, לצפות בסביבות 30% של תאים איון נגועה. ניתן להשתמש איונים לניסויים הדמיה בשידור חי-
2. קונאפוקלית הדמיה של נגוע איים
הערה: עיין טבלה של חומרים עבור החומרים והציוד הנדרש עבור הדמיה קונפוקלי.
- ריאגנט והכנה הגדרת הניסוי
- להכין פתרון חוץ-תאית: להוסיף 125 מ"מ NaCl, מ מ 5.9 אשלגן כלורי, מ"מ 2.56 CaCl 2, 1 מ MgCl 2, 25 מ מ HEPES, BSA 0.1%, pH 7.4, סטרילי מסונן.
הערה: מאגר זה מוגש בדרך כלל ללא גלוקוז, ניתן לאחסן ב 4 ° C עד חודש. גלוקוז נוספת ביום של הניסוי כדי להגיע את הריכוז הסופי הרצוי.- הכן הבזליים גלוקוז (3 מ"מ) בינוני: להוסיף µL 75 של 2 מ' מניות גלוקוז 50 מ של פתרון חוץ-תאית.
- Hyperglycemic (16 מ מ) בינוני: להוסיף 400 µL של 2 מ' מניות גלוקוז 50 מ של פתרון חוץ-תאית
- לדלל כל גירוי נוסף (למשל, אשלגן כלורי או אדנוזין טריפוספט (ATP)) בתמיסה חוץ-תאית, המכילה גלוקוז 3 מ מ.
- לפני תחילת הניסוי, pretreat על coverslips עם פולי-D-ליזין על-ידי הוספת 30 µL של פולי-D-ליזין פתרון (1 מ"ג/מ"ל) coverslip עבור 1 h ושטיפה ביסודיות עם H 2 O.
הערה: coverslips זכוכית אקרילית-ליזין מצופה ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר עד 6 חודשים. - לפחות שעה לפני הניסוי, באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, להעביר את איונים 35 מ מ פטרי המכילות פתרון חוץ-תאית עם גלוקוז 3 מ מ. לשמור ע ב CO של 37 ° C ו- 5%-2-
הערה: אם יש צורך, ניתן שכותרתו קרום פלזמה בשלב זה. להוספת תווית קרום פלזמה, להוסיף 2 מיקרומטר di-8-ANEPP לצבוע הפתרון חוץ-תאית עם גלוקוז 3 מ מ. דגירה של איים בפתרון צבע עבור h 1-37 °C/5% CO 2. יכול להיות שמחים לצבוע קרום פלזמה-488 ננומטר וזוהה על 620 nm. - דקות לפני תחילת הניסוי, לצרף את coverslip לחדר ההדמיה על ידי איטום זה עם גריז סיליקון ואקום. לתקן לחדר ההדמיה פלטפורמת הדמיה. באמצעות פיפטה, במקום 20-30 איים על אזור פולי-D-ליזין-יחס של coverslip ולתת איונים לדבוק פני השטח במשך 20 דקות
הערה: חשוב לא לתת את coverslip להתייבש לחלוטין כדי למנוע נזק איון. - בזמן איים קטנים הם והקפדה coverslip, להכין את המערכת זלוף בשטיפת זה ביסודיות עם מים. הוספת כל פתרון לערוץ אחר: גלוקוז 3 מ מ (ערוץ 1), מ מ 16 גלוקוז (ערוץ 2), גלוקוז 16 מ מ עם 100 מיקרומטר 3-איזובוטיל-1-methylxanthine (IBMX) ו- 10 מיקרומטר forskolin (ערוץ 3), 25 מ מ אשלגן כלורי גלוקוז 3 מ מ (ערוץ 4), 10 מיקרומטר ATP ב- 3 מ מ (גלוקוז ערוץ 5). להסיר את כל הבועות של המערכת על ידי פתיחת כל ערוץ בנפרד ולתת את זרימת פתרון לכמה דקות, וודא כי הזרם עקבית (0.5 mL/min), הצנרת לא דולף.
- להתחבר החימום פתרון בתוך שורה הצינור לשקע זלוף ולהתאים את הטמפרטורה של מאגר outflowing המשמש 37 מעלות צלזיוס.
- להכין את השאיבה. להסיר את כל הבועות מהמערכת, וודא כי הזרם עקבית, הצנרת לא דולף.
- , ברגע איים קטנים לדבוק פני השטח coverslip, בעדינות למלא תא הדמיה עם הפתרון חוץ-תאית המכילה גלוקוז 3 מ מ. להימנע לשטוף את איונים מהמשטח של coverslip.
- למיקום פלטפורמת הדמיה עם איונים לבמה מיקרוסקופ ולחבר אותה מערכת זלוף, השאיבה.
- התור על הזרם, כל הזמן perfuse של איים עם הפתרון חוץ-תאית דור 3. המערכת מוכן כעת לדימות קונפוקלי.
- להכין פתרון חוץ-תאית: להוסיף 125 מ"מ NaCl, מ מ 5.9 אשלגן כלורי, מ"מ 2.56 CaCl 2, 1 מ MgCl 2, 25 מ מ HEPES, BSA 0.1%, pH 7.4, סטרילי מסונן.
- הדמיה קונאפוקלית
- לאתר של איים בשדה מיקרוסקופ הגדלה נמוכה יותר. ברגע ממוקדת של איים קטנים, לעבור מטרות הגדלה גבוהה יותר (לדוגמה, המטרה של טבילה במים X 63 (63 X / 0.9 NA)).
- פתח את הרכישה באמצעות תוכנה (טבלה של חומרים) ולהפעיל את מצב סורק תהודה.
- לבחור את מצב הדמיה XYZT ולהגדיר את ההגדרות הרכישה כדלקמן:
- להפוך-ארגון לייזר ו- 488 ננומטר לייזר קו ולהתאים את עוצמת הלייזר כדי 50% עבור עירור pHluorin.
- לאסוף פליטה-505-555 nm.
- לבחור רזולוציה של 512 x 512 פיקסלים. הקש " Live " כפתור כדי להתחיל הדמיה לכוונן את רמות רווח (רווח טיפוסי הוא בסביבות 600 V).
- להגדיר את begin ו- end z-המחסנית של: להתמקד בחלק העליון איון ובחרו " בגין " ולעבור האחרון המטוס יכול להיות ממוקד ובחרו " סיום ". השתמש בגודל z-צעד של 5 מיקרומטר. התוכנה יחשב באופן אוטומטי את מספר מטוסים קונפוקלי.
- להגדיר את מרווח הזמן עבור רכישת כל ערימה-z קרוב-1.5-2 s ובחר את האפשרות " לרכוש עד הפסיק " עבור הדמיה רציף.
- העיתונות " להתחיל " כפתור initialize.
- שימוש בפרוטוקולים גירוי שונות לזירוז גרגר אקסוציטוזה מאת פרפוזיה של איים עם הגירויים הרצוי. פרוטוקולים גירוי יכול להיות מותאם אישית כדי להתאים את תכלית מדעית הרצויה (ראו להלן).
- גירוי פרוטוקולים
הערה: כל פרוטוקול גירוי, להתחיל בהקלטת לפחות 2 דקות של איון רקע פעילות במהלך זלוף קבוע עם פתרון חוץ-תאית המכילה גלוקוז 3 מ מ. Perfuse עם תמריץ עבור תקופת הזמן הרצוי. ניתן להתאים אישית את הסדר של ממריצים, משך הזמן של גירוי, כמו גם משך הקלטות כדי להתאים למטרות מדעיות הרצוי. הקפידו לשטוף איונים ביסודיות עם פתרון חוץ-תאית המכילה גלוקוז 3 מ מ לפני שמתחילים עם גירוי חדש. להלן למצוא את הפרוטוקולים גירוי מדגם שנוצלו להדגים את היכולות שיטה.- Stimulate עם אמוניום כלוריד (NH 4 Cl) כפקד חיובי עבור pHluorin pH רגישות ויעילות זיהום ויראלי ( איור 3): גלוקוז 3 מ מ (2 דקות) → 50 מ מ NH 4 קלרנית (2 דקות), גלוקוז 3 מ מ → גלוקוז 3 מ מ (2 דקות)
הערה: ב- NH-4 פתרון קלרנית, להחליף את NaCl על בסיס equimolar. - Stimulate אינסולין גרגר אקסוציטוזה על ידי הגדלת ריכוז הגלוקוז ( איור 5, איור 6): גלוקוז 3 מ מ (2 דקות) → מ מ 16 גלוקוז (15-30 דקות) → גלוקוז 3 מ מ (2 דקות
הערה: כדי לראות מספר התפרצויות של פעילות, perfuse של איים באופן רציף עם הפתרון 16 גרם לפחות 15 דקות
הערה: על מנת להגדיל את העקביות של הפרשה תגובות 17, משתמשים יכולים להוסיף הרמת-מחנה סוכנים (100 מיקרומטר IBMX ו- 10 מיקרומטר forskolin) לפתרונות דור 3 והן 16 גרם. אפשרות זו אינה משנה את דפוסי הטמפורלי של הפרשת גרגר. לפרטים נוספים ראו 15 ודיון..
- Stimulate עם אמוניום כלוריד (NH 4 Cl) כפקד חיובי עבור pHluorin pH רגישות ויעילות זיהום ויראלי ( איור 3): גלוקוז 3 מ מ (2 דקות) → 50 מ מ NH 4 קלרנית (2 דקות), גלוקוז 3 מ מ → גלוקוז 3 מ מ (2 דקות)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זרימת העבודה כולו של הטכניקה מוצג באיור1. בקצרה, עכבר או איונים האנושי להיות נגוע אדנו קידוד NPY-pHluorin, עם תמונה, לאחר כמה ימים בתרבות, תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. כמו גרגרי נתיך עם קרום פלזמה, פתוח, עלייה פלורסצנטיות נצפית, ניתן לכמת (איור 1). כדי לקבוע אם NPY-pHluorin הוא אכן כלי מתאים כדי לפקח על דינמיקה גרגר אינסולין, איים נגועים היו immunostained עם נוגדנים נגד ה-GFP, איון שונים ההורמונים אינסולין, סומטוסטטין או גלוקגון. רוב התאים לבטא NPY-pHluorin (GFP חיובי) היו תאי הבטא כפי שהם הביעו אינסולין (~ 90%; איור 2A, 2B). רק מספר תאי אלפא גלוקגון-חיובית או תאי דלתא somatostatin חיובי היו GFP שכותרתו (איור 2B). חשוב, בתאים נגועים, פיוז'ן NPY colocalized עם אינסולין (מקדם המתאם של פירסון של 0.61 ± 0.04 עבור ה-GFP, אינסולין לעומת 0.21 ± 0.05 GFP, גלוקגון ו- 0.07 ± 0.01 GFP, סומטוסטטין).
להדגים את pHluorin הוא חיישן ה-pH יעיל, כמו הגדלת דרגת החומציות תאיים עם 50 מ"מ NH4Cl הביא > 500% עלייה זריחה תאיים (איור 3 א, 3B, 1 וידאו). ה-pH בתוך גרגר גודלת על פיוז'ן עם קרום פלזמה, הפתח של הנקבובית פיוז'ן, בגרגרים המכיל NPY-pHluorin לנראה על תנאים המעודדים אקסוציטוזה אינסולין כמו קרום דפולריזציה עם אשלגן כלורי (איור 4, וידאו 2).
אירועי הפרשה בודד בתאי בטא בתוך איים שלמים, ניתן לאבחן עם הדמיה בצילום מואץ קונאפוקלית של איים NPY-pHluorin נגוע. אלו מתרחשים בתגובה ישירה ממברנה דפולריזציה עם אשלגן כלורי או מספר אחר פיזיולוגיות לגירויים (איור 4 , איור 7, ראה להלן). ירידה בריכוז הגלוקוז חוץ-תאי הבסיס (3 מ מ), הוא ציין פעילות הפרשה הקטנה. עם זאת, גרגר פיוז'ן עם קרום פלזמה מופעלת בתגובה לגירוי עם גלוקוז גבוהות (16 מ מ) (איור 5A, וידאו 3). על ידי הצבת את ROIs בגדלים שונים, בתחומים שונים, ניתן להשוות את התגובה קינטיקה של גרגרי הפרשה עם זה של תאים בודדים או קבוצות של תאים בסמיכות (אשכול) (איור 5B). סוג זה של ניתוח פעילה בקביעת זה: 1) אירועי הפרשה בודדים הם מאוד מסונכרן, מופרשים תוך כמה שניות מן התגובה הממוצע תא, ויוצרים בתאי בטא 2) בסמיכות אשכולות פונקציונלי של פעילות מסונכרנת.
הפרשת האינסולין בגוף מתרחשת באופן פועמת. מגרה איונים NPY-pHluorin-נגוע עם ריכוז גלוקוז גבוהות עבור תקופות ממושכות (15-20 דקות) הולידה מספר פולסים (או התפרצויות) של הפרשת (איור 6, 4 וידאו). במהלך כל דופק, בגרגרים בודדים נתיך עם קרום פלזמה באופן מסונכרן כפי שמוצג לפני (איור 5). התפרצויות של פעילות הפרשה ניתן לראות כל 3-4 דקות.
ארעי עולה זריחה ב- NPY-pHluorin גם יכול להיות שנצפו המכיל גרגרי בתגובה אגוניסט purinergic ATP (10 מיקרומטר) או של אצטילכולין מוסקריניים אגוניסט (אחח, 10 מיקרומטר) (איור 7), אשר שניהם ידועים תכשירים של הפרשה של אינסולין, ב איים אנושי. כצפוי, דפולריזציה קרום עם אשלגן כלורי (30 מ מ) מופעלות גם אינסולין גרגר אקסוציטוזה (איור 5). גירויים מספר ניתן ליישם הכנת איון אותו כל עוד איונים נשטפים טוב בין גירויים. הקפד לשנות את הסדר של היישום כאשר חוזרים על הניסוי.
איור 1. ערכת הממחישות את הבדיקה שפותחה. אדנו מקודד GFP רגיש pH (pHluorin) מצמידים NPY היו המיוצר, נעשה שימוש כדי להדביק העכבר או לנגרהנס אנושי. ארבעה עד שישה ימים לאחר ההדבקה, ע היו מניחים על coverslip ולא עם תמונה תחת זקוף לסריקת לייזר קונפוקלי במיקרוסקופ. הבונה NPY-pHluorin מתבטא בגרגרים אינסולין בתאי בטא. קרינה פלואורסצנטית שלה הוא מתרצה ב pH חומצי של אינסולין בוגרת בגרגרים אבל הופך להיות בהיר על גרגר פיוז'ן עם קרום פלזמה, חשיפה חוץ-תאי ה-pH נייטרלי של 7.4.
באיור 2. לבנות NPY פיוז'ן מתבטאת בגרגרים אינסולין. (א) תמונות קונאפוקלית של איים אנושי שלם נגועים עם NPY-pHluorin, immunostained עבור ה-GFP (ירוק), אינסולין (פאנל שמאלי, אדום), סומטוסטטין (באמצע, אדום) או גלוקגון (נכון, אדום). גרעינים תא מוצגים בכחול (דאפי המסומנות). גודל ברים = 10 מיקרומטר. (B) כימות של השבר של GFP-חיוביות תאים המכילים גם אינסולין (Ins), סומטוסטטין (סומה) או גלוקגון (Glu). האם להציג SEMs זאת אומרת ±, n = 5 איים קטנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. NPY-pHluorin הוא יעיל pH חיישן. (א) הקרנה מקסימלי של תמונות קונאפוקלית של איון העכבר נגוע NPY-pHluorin פתרון חוץ-תאית המכילה גלוקוז 3 מ מ לפני (החלונית העליונה, דור 3) בנוכחות 50 מ"מ NH4לקלרנית (לוח נמוכה יותר). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) למעקב אחר מציג את השינוי בעוצמת רשע קרינה פלואורסצנטית (יחידות שרירותיות) ב איון כל שנגזרות NH4קו מקווקו Cl. מציין NH4Cl היישום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. מכשור לשמירת גרנולות המכילות NPY-pHluorin להיות גלוי פעם במרעום עם קרום פלזמה ופתוח. Isletsinfected האנושי עם אדנו NPY-pHluorin היו incubatאד עם קרום פלזמה לצבוע di-8-ANEPP (אדום). איון גירוי עם אשלגן כלורי (30 מ מ) מופעלות מראה פתאומי וחולף של גרגרי פלורסנט על פני התא (מוצג בצבע ירוק). תמונות קונאפוקלית של תאים בתוך איון אנושי, מקרינים לפני התגובה exocytotic (t = 0), במהלך (t = s 3-9) ואחרי (t = 12 s). ניגודיות הותאם להסיר רקע ירוק זריחה. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. גלוקוז גבוהות מפעילה NPY-pHluorin פיוז'ן עם קרום פלזמה. (א) הקרנה מקסימלי של תמונות קונאפוקלית של איון אנושי שלם נגוע NPY-pHluorin בריכוז הגלוקוז הבזליים (גלוקוז דור 3-3 מ מ, עזב את החלונית) או גלוקוז גבוהות (גלוקוז 16 גרם - 16 מ מ, לוח נכון). פתרונות חוץ-תאית הכיל את המחנה גיוס סוכנים forskolin ו- IBMX (לפרטים, ראה פרוטוקול). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) עקבות מראה שינויים בעוצמות קרינה פלואורסצנטית רשע (יחידות שרירותיות) בערוץ ירוק ב ROIs ממוקמים סביב אירועים הפרשה בודד (רד, גרגר), תאים (ירוק) או תא אשכולות (כחול). גלוקוז גבוהות הוחלה על 5 דקות לאחר ~ 2.5 דקות ב 3g. קרינה פלואורסצנטית הערכים היו מנורמל לערך פלורסצנטיות הראשונית (בסיסית). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6. הפרשה האירועים מפיקים דיסקרטית פולסים של הפרשת על גלוקוז גבוהות. עקבות מציג שינויים מתכוונת עוצמת קרינה פלואורסצנטית (יחידות שרירותיות) ROIs להציב בסביבת תאים שונים בתוך איון אנושי שלם במהלך גירוי ממושך עם גלוקוז 16 מ מ. כל צבע מייצג תא יחיד. פרץ של פעילות הפרשה ניתן לראות כל 3-4 דקות אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7. NPY-pHluorin פיוז'ן עם קרום פלזמה המופעלת על-ידי ידוע תכשירים של הפרשת האינסולין. עקבות מראה שינויים בעוצמת רשע קרינה פלואורסצנטית (יחידות שרירותיות) ROIs ממוקמים סביב אירועים בודדים הפרשה בתאים בתוך איונים אנושי שלם שנגזרות אשלגן כלורי (30 מ מ), ATP (10 מיקרומטר), גלוקוז גבוהות (16G, 16 מ מ), אצטילכולין (אחח, 10 מיקרומטר). אשלגן כלורי ו- ATP הוחלו ירידה בריכוז הגלוקוז הבזליים (3 מ"מ). קווים שחורים להראות את גרגר הממוצע, קווים אפורים משקפים ערכים SEM. עקבות ירוקים מראים תגובת התא המתאים. סרגל זמן אופקי (2 דקות) חל על כל גרפים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
וידאו 1. NPY-pHluorin אדנו ביעילות להדביק תאי איון ושינויים pH הגיוני.
העכבר איונים נדבקו ארבעה ימים עם אדנו קידוד NPY-pHluorin. איים נגועים היו מניחים על coverslip, רכוב על תא הדמיה. להגברת החומציות תאיים, איים קטנים היו perfused עם 50 מ"מ NH4Cl להוסיף לתמיסה חוץ-תאית המכילה גלוקוז 3 מ מ. ניתן לראות גידול מהיר וחזק של זריחה על NH4Cl היישום. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. הסרט מהירות = 5 fps. משך הזמן הכולל של הסרט הוא 90 ס' אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
וידאו 2. מכשור לשמירת גרנולות המכילות NPY-pHluorin הופכים לגלויים ברגע במרעום עם קרום פלזמה ופתוח.
איונים האנושית נגוע אדנו NPY-pHluorin היו מודגרות עם קרום פלזמה צבע di-8-ANEPP. איון גירוי עם אשלגן כלורי (30 מ מ) מופעלות מראה פתאומי וחולף של גרגרי פלורסנט על פני התא. הקרנה מקסימלי של מטוסים קונאפוקלית מוצג. ניגודיות הותאם להסיר רקע ירוק זריחה. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. הסרט מהירות = 5 fps. משך הזמן הכולל של הסרט הוא 60 ס' אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
וידאו 3. אקסוציטוזה מפעילים גלוקוז גבוהות של גרגרי המכיל NPY-pHluorin.
פיוז'ן של גרגרי המכיל NPY-pHluorin מופעלת בתגובה לגירוי עם גלוקוז גבוהות (16 מ מ). בריכוז הגלוקוז חוץ-תאי הבסיס (3 מ מ), הוא ציין פעילות הפרשה הקטנה. עם זאת, על גלוקוז גבוהה, בגרגרים אינסולין transiently מופיעים בחלק קרום הפלזמה של תאים שונים איון באופן מסונכרן. גלוקוז גבוהות הוחלה לאחר ~ 2.5 דקות ב 3g (16 גרם תווית מופיע). הקרנה מקסימלי של מטוסים קונאפוקלית מוצג. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. הסרט מהירות = 10 fps. משך הזמן הכולל של הסרט היא מינימלית 7 אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
וידאו 4. גירוי ממושך עם גלוקוז גבוהות מפעילה מספר התפרצויות אקסוציטוזה.
גירוי ממושך עם גלוקוז גבוהות הולידה מספר פולסים של הפרשת איונים, שבמהלכו גרגרי transiently להופיע. פולסים של פעילות הפרשה ניתן לראות כל ~ מטוס קונאפוקלית 3-4 דקות של איון אנושי מוצג. ערכת מדומה הוחל על עוצמת קרינה פלואורסצנטית. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. הסרט מהירות = 30 fps. משך הזמן הכולל של הסרט הוא 20 דקות אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתב יד זה מתאר טכניקה יכול לשמש כדי להמחיש אקסוציטוזה של גרגרי אינסולין בתאי בטא בתוך לנגרהנס ללא פגע על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. היא משתמשת NPY-pHluorin כמו הכתבת פלורסנט משובטים לתוך אדנו כדי להבטיח יעילות של תרביות תאים גבוהה.
למרות השיטה היה יעיל ביותר בידיים שלנו, זה עשוי לדרוש מספר שינויים התלויים בעיקר שני פרמטרים: 1) האיכות של איון, והכנה 2) כייל של מניות ויראלי עם אופטימיזציה של זיהום תנאים. לפני זיהום ויראלי של איים קטנים, לאפשר הכנת איון להתאושש בידוד ותחבורה מתח בין לילה ב 37 º C. בדוק המורפולוגיה איון תחת מיקרוסקופ אור לאורך כל התקופה זיהום/ביטוי ולבדוק סימנים של הכדאיות ירד כגון תאים בולטות מן השטח איון או נוכחות של חמצן בתאים (כהה יותר תאים) איילט מרכז18 . כל מניה ויראלי עשוי להשתנות יעילות כייל נוגדנים ולדלקת. הקפד לכוונן את עוצמת הקול של הנגיף נעשה בהתאם כייל את נגיפי ואת הזמן של תרבות לפני וזמינותו מיקרוסקופ. השלב הקריטי ביותר הוא אופטימיזציה של התנאים זיהום (למשל, מספר נגיפים, תרבות זמן לפני assay) כך מספיק של הכתב בא לידי ביטוי, תקינות איון ואת ההיענות נשמרים. בשעת מיטוב פרוטוקול זיהום, ועם כל אצווה ויראלי חדש, לאסוף כמה איים קטנים בנקודות זמן שונות ולבדוק אם אקסוציטוזה יכול להיות elicited עם אשלגן כלורי (30 מ מ) ו/או גלוקוז גבוהות (16 מ מ). מצאנו כי וזמינותו עובד עדיף תאי איון להישאר בריא, גלוקוז מגיב כאשר למשרד הפנים הוא נמוך (בסביבות 2) ואת הזמן תרבות מורחב (בסביבות 5 ימים) כדי להגדיל את רמות הביטוי של הבונה פיוז'ן. התוצאות שלנו עולים בקנה אחד עם מחקר קודם מראה כי הביטוי יעיל של ג'ין מוצרים כדאי תושג בריכוזים נמוכים transfecting של וקטור adenoviral תוך שמירה על תפקוד איון19.
הטכניקה יש, עם זאת, מספר מגבלות. אחת היא כי באמצעות NPY-pHluorin ככתב, בגרגרים לא ניתן לאבחן לפני במרעום עם קרום פלזמה ופותח הנקבוביות פיוז'ן. ללמוד אינסולין גרגר סחר במקום אקסוציטוזה, אדנו קידוד NPY-eGFP ניתן להשתמש במקום זאת. מגבלה נוספת היא כי במידה נמוכה יותר, NPY-pHluorin ניתן לפלח כך ללא אינסולין המכיל גרגירים. עם זאת, רוב התאים היו נגועים NPY-pHluorin הביע גם אינסולין ופחות מ-10% של גלוקגון תאי ביטא או סומטוסטטין. אכן, התלות גלוקוז של הפרשת גרגר, דפוס פועמת, לוקליזציה שיתוף עם אינסולין, יצוין כי ביותר הפרשה אירועים מייצגים שחרור המטענים בגרגרים אינסולין. כדי להבטיח פיקוח על אינסולין אקסוציטוזה מתרחש, וזמינותו צריכה להתבצע תחת תנאים המעודדים הפרשה של אינסולין (למשל, גלוקוז גבוהות). ובכל זאת, כדי לשפר את ייחודה של הביטוי תאי בטא, NPY-pHluorin ניתן לשים תחת השליטה של מקדם סלקטיבי יותר כגון האמרגן אינסולין חולדה. מגבלה נוספת של הטכניקה היא שזה דורש ביטוי של חלבונים אקסוגני של אינסולין בגרגרים, אשר ניתן perturb שלהם להן ו/או התנהגות20. זה צריך לקחת בחשבון בעת לפרש את התוצאות של הניסויים, במידת האפשר, המסקנות לאמת באמצעות חלבונים מטענים אחרים גרגר אינסולין (למשל, C-פפטיד, איון מפוליפפטיד עמילואיד) ככתבים.
פרוטוקול זה גם ממליצה כולל הרמת-מחנה סוכנים (IBMX ו forskolin) פלאטין את ההשפעות של גלוקוז גבוהות על אינסולין גרגר אקסוציטוזה. פרוטוקול גירוי זה מחקה את ההפעלה של מסלולים הגברה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית (המופעלות על-ידי incretins או paracrine של מולקולות איתות עצבי) זה פלאטין הפרשת האינסולין על ידי הגדלת מחנה בתאי בטא בלבלב. יחד עם זאת, בהיעדר מחנה גיוס סוכנים, גלוקוז גבוהות (16 מ מ) מעורר גם גרגר אקסוציטוזה אך מספר האירועים הפרשה שנצפה הוא נמוך. גרגרי עדיין מופיעות בפרצים דיסקרטית, מסונכרנים עם תגובת תא הממוצע, להראות דומה פרץ תקופות: מין 1.4-6.6 גלוקוז גבוהות בתוספת IBMX/forskolin לעומת 1.5-10 דקות של גלוקוז גבוהות לבד.
וזמינותו המתוארים כאן היא משמעותית ביחס שיטות קיימות לה מספיק רזולוציה יכולות להמחיש פיוז'ן יחיד אירועים בזמן אמת בתאי בטא בתוך איים שלמים. למשל, הוא חשף את הסינכרון גבוהה עם אינסולין אשר מתפרסמים בגרגרים איונים אנושי על גירוי גלוקוז. יתר על כן, אם איונים מחוברים היטב coverslip, הם יכולים לדימות לתקופות ממושכות (לפחות 15-20 דקות). זה שימש כדי להראות כי ב איונים האנושי אקסוציטוזה מתרחשת בפרצים שונות המופיעות בתקופות דומות לאלו של הפרשת האינסולין פועמת ויוו . הבדיקה מאפשרת גם לבדיקת השפעת גירויים מספר על אקסוציטוזה אינסולין באמצעות מאתר או אדם איונים. יתר על כן, כי הוא אינו דורש דיסוציאציה תא איון כמו שיטות אחרות, ניתן להחיל אותה ללמוד את אופן הפעולה של תאי בטא אוכלוסיות בתוך איון. אכן, הבחנו כי תאי הבטא שכנות טופס אשכולות של ~ 5-10 תאים שבהם פעילות מסונכרן. תאי הבטא מהאשכול אותו הם ביחד כנראה על ידי ערוצי צומת הפער עשוי connexin 3621. תגובתם מסונכרן ממחיש את קישוריות תאי בטא חיונית הפרשת אינסולין תקין22.
בעתיד, טכניקה זו יכול להיות משולב עם אחרים צבעי פלורסנט הדמיה תפקודית להציג באופן חזותי בזמן אמת כמה שינויים cytosolic סידן או פוטנציאל ממברנה, למשל, לתאם עם גרגר אקסוציטוזה בתאי בטא. בפרט, pH רגיש אדום פלואורסצנטי חלבונים חדשים הופכים להיות זמינים14,23 , יכול להיות דבוקה NPY או חלבונים מטענים אחרים אינסולין גרגר, ניתן להשתמש צבעי ירוק עבור הדמיה תפקודית. יתר על כן, טכניקה זו יכול להיות משולב עם דגם העכבר ויוו הדמיה של איים vascularized מושתלים לתוך התא הקדמי של העין העכבר24. איונים יכול להיות נגוע adenoviruses 48-72 שעות לפני השתלת לתוך העין. עכברים לקוי מערכת החיסון אמור לשמש אם האדם איונים מושתלים. באמצעות מודל זה, הדפוס המרחבי subcellular של הפרשת האינסולין גרגר ישויך עם כלי דם סידור25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שיש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
המחברים תודה מרשה Boulina מ- DRI הדמיה מתקן הליבה לעזרה עם המיקרוסקופים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים 1K01DK111757-01 (יא), F31668418 (מ מ), R01 DK111538, R33 ES025673, R56 DK084321 (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
References
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
- Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
- Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
- Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
- Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478 (2011).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
- Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
- Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
- Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801 (2015).
- Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632 (2015).
- Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
- Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
- Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
- Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target? Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
- Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).
