Summary
우리는 pHluorin, pH에 민감한 녹색 형광 단백질을 사용 하 여 그대로 독도에 인슐린 exocytosis의 시각화를 위한 프로토콜을 설명 합니다. 격리 된 독도 소포 화물 neuropeptide Y에 결합 하는 pHluorin를 인코딩 하는 아 데 노 바이러스와 감염 됩니다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 인슐린과 립 퓨전 이벤트의 검출에 대 한 수 있습니다.
Abstract
인슐린 분 비 뿐만 질병에서 정상적인 생리 적인 조건 하에서 포도 당 항상성에서 중심 역할을 한다. 전기 생리학 또는 현미경 형광 기자 들의 표현에 결합 하거나 사용 하는 인슐린과 립 exocytosis 공부를 현재 접근. 그러나 이러한 기술의 대부분 클론 세포 라인에 대 한 최적화 되었습니다 또는 췌 장 독도 해리 요구. 대조적으로, 여기에 제시 된 방법 그대로 췌 장 독도에 인슐린과 립 exocytosis의 실시간으로 시각화 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 먼저 인코딩하는 pH에 민감한 녹색 형광 단백질 (GFP), pHluorin, neuropeptide Y (NPY)에 결합 된 아 데 노 바이러스와 격리 된 췌 장 독도의 바이러스 성 감염을 설명 합니다. 둘째, 우리는 confocal 이미징 독도의 5 일 후에 바이러스 성 감염 및 인슐린과 립 분 비를 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 간단히, 감염 된 독도 이미징 챔버에 coverslip에 배치 되며 지속적으로 다양 한 자극을 포함 하는 extracellular 솔루션과 끼얹는다 되 하는 동안 똑바로 레이저 검사 confocal 현미경 아래 몇 군데. 공초점 이미지는 섬의 50 µ m에 걸친 빠른 공명 스캐너를 사용 하 여 시간 경과 녹음으로 획득 됩니다. 시간이 지남에 따라 인슐린과 립 원형질 막으로 융합을 다음 수 있습니다. 이 절차 또한 단일 실험에서 자극의 배터리를 테스트 가능, 마우스와 인간의 독도 이며 기능적인 화상 진 찰 (예를 들어, 막 잠재력 또는 cytosolic 칼슘 염료)에 대 한 다양 한 염료와 결합 될 수 있다.
Introduction
인슐린은 췌 장의 작은 섬의 베타 세포에 의해 생산 하 고 포도 당 물질 대사1의 키 레 귤 레이 터 이다. 죽음 또는 베타 세포의 기능 장애 포도 당 항상성을 방해 하 고 당뇨병2리드. 인슐린은 캘리포니아2 +에서 출시 된 코어 조밀한과 립에 포장-종속 방식3. 인슐린과 립 exocytosis 규제 어떻게 elucidating 완벽 하 게 이해 어떤 인슐린 분 비를 결정 하 고 당뇨병의 치료에 대 한 새로운 치료 대상의 식별에 대 한 새로운 경로 열 며 필수적 이다.
인슐린 exocytosis는 광범위 하 게 연구 되었습니다 형광 분자와 함께에서 막 커패시턴스 측정 등 미세한 접근 electrophysiological 접근을 사용 하 여. 막 커패시턴스 측정 좋은 시간적 해상도 있고 단일 셀 레코딩을 허용. 그러나, 커패시턴스에 변경 셀의 net 표면 변화를 반영 고 할 하지 개별 퓨전 이벤트를 캡처 또는 다른 비 인슐린 분 비 소포3에서 인슐린과 립 퓨전을 구별. 형광 프로브 및 소포 화물 단백질와 함께 2 광자 또는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 등 미세한 방법을 추가 정보를 제공합니다. 이러한 기술은 단일 exocytotic 이벤트 및 사전 및 사후 exocytotic 단계를 캡처하고 셀3의 인구에 있는 exocytotic 패턴을 공부 하 고 사용할 수 있습니다.
형광 기자 세 가지 유형의 수: 1) extracellular, 2) 세포질, 또는 3) 나노미터. 1) extracellular 기자는 extracellular 환경4를 통해 소개 될 수 있는 폴라 추적기 (예를 들어, dextrans, sulforhodamine B (연료 부스터), 루시퍼 노란색, pyranine). 폴라 추적기를 사용 하 여 셀의 인구에는 퓨전의 조사 가능 하며 혈관 등 다양 한 세포 구조를 캡처합니다. 그러나, 그들은 소포 화물 동작에 보고 하지 않습니다. 2) 세포질 기자는 세포질 얼굴과 도킹 및 exocytosis에 참여 막 관련 단백질에 결합 하는 형광 프로브. 예는 신경 전달 물질 방출5공부에 대 한 신경 과학에서 성공적으로 사용 된 성 N-ethylmaleimide-민감한 요소 첨부 단백질 수용 체 (무) 가족 구성원을 포함 합니다. 이러한 여러 바인딩 파트너는 단백질과 인슐린과 립 하지 않습니다 특정. 3) 기공을 기자는 화물 전용 기 행동의 조사에 대 한 허용 하는 기공을 화물 단백질을 융합 하는 형광 프로브. 인슐린과 립 특정 화물 단백질 등이 인슐린, c-펩 티 드, 작은 섬 녹말 체 폴 리 펩 티 NPY 등6,7. NPY는 인슐린과 립, 포함에 이며 공동 출시, 인슐린과 형광 기자8에 대 한 우수한 파트너 만들기.
Exocytosis 신경 내 분 비 세포, 특정 synaptotagmin isoforms9,10 의 요구 등의 다양 한 측면을 연구 NPY 다른 형광 단백질의 융합 이전 고용 방법 방출의 시간-과정에 따라 다릅니다 말라 골격 myosin II11,12. 이 연구에서 우리는 비 형광은 수정 된 GFP가 형광 기자로 pHluorin를 선택 고밀도 코어 내부 산 성 pH에서과 립 하지만 된다 중립 extracellular pH13에 노출 되 면 밝은 형광. 성숙한 인슐린과 립 산 성 pH를 5.5 아래 있다. 일단은 립 원형질 막 및 열립니다 퓨즈, 그것의 화물 수 기자로 서 pH에 민감한 단백질 pHluorin 사용 하 여7,147.4의 extracellular 중립 pH에 노출 됩니다.
PH 민감한 성격의 pHluorin 그리고 인슐린과 립에 있는 NPY의 선택적 식에 비추어 NPY pHluorin 퓨전 구문 인슐린과 립 exocytosis의 다양 한 속성을 공부를 사용할 수 있습니다. 융해 구성의 바이러스 배달 높은 transfection 효율을 보장 하 고 고립 된 섬에 뿐만 아니라 기본 베타 셀 또는 셀 라인에 작동 합니다. 이 방법은 exocytosis NPY 포함 된 소포와 다른 세포 유형에서 공부에 대 한 지침으로 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 exocytosis에 어떤 유전자 변형 마우스 모델 연구 특정 조건 (knockdowns, overexpression, 등)의 효과를 결합할 수 있습니다. 이 기술은 이전 인간의 독도15베타 세포 인구에서 인슐린과 립 분 비의 공간 및 시간 패턴을 특성화 하기 위해 사용 되었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
마이애미 대학의 동물 윤리 위원회는 모든 실험을 승인 했습니다.
1. 바이러스 성 감염의 그대로 고립 된 인간 또는 마우스 췌 장 독도
- 섬 문화: 섬 문화 미디어 준비: Connaught 의료 연구 실험실 (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS 및 2 m L-글루타민.
- 인간 췌 장 독도 통합 섬 배포 프로그램 (NIDDK, NIH)에서 얻을 수 있습니다. 도착 시 전송는 독도 (~ 500 섬 등가물) 35 m m 비-조직 문화 취급 37 ° C에서 2 mL CMRL 문화 미디어, 바이러스 성 감염 하기 전에 24 시간을 위한 5%/95% CO 2 /O 2 접시.
- 마우스 췌 장 독도 이전 설립된 프로토콜 16 다음 격리 될 수 있습니다. 절연, 다음 문화 ~ 200 섬 등가물에 35 m m 비-조직 문화 취급 37 ° C에서 2 mL CMRL 문화 미디어, 바이러스 성 감염 하기 전에 24 시간을 위한 5%/95% CO 2 /O 2 접시.
참고: NPY pHluorin와 형광 중복을 피하기 위해 독도 GFP 또는 YFP 기자 들과 유전자 변형 마우스를 사용 하지 마십시오.
- 바이러스 준비
참고: NPY pHluorin 퓨전 pcDNA3 벡터 10으로 복제 되었고 adenoviral 생산 adenoviral vector에 subcloned [아 데 노비 루스 serotype 5 (DE1/E3)] 재조합 아 데 노 바이러스에 의해 제조 회사입니다. 바이러스는 aliquoted 및-80 ° c.에 저장 바이러스 성 재고 10 titers에서 회사에 의해 제공 됩니다 12 10 13 바이러스 성 입자 (~ 3 × 10 10-3 x 10 11 PFU).- 에 대 한 생체 외에서 섬, 사용 10 6 PFU/mL, 감염 (MOI)의 대략적인 다양성의 약 2 (자세한 토론 참조) 결과
- 췌 장 독도의 바이러스 성 감염
주의: 작업 adenoviruses Biosafety 수준 2 (BSL2) 절차와 인증을 요구 한다. 지도와 BSL2 절차에 대 한 교육 기관 Biosafety 장교와 확인 하십시오.- 위에서 설명한 대로 인간/마우스 독도 준비.
- 추가 5-10 µ L 재고 바이러스의 인간/마우스 독도 CMRL 문화 미디어의 (10 %FBS 2 mM L-글루타민) 2 mL에 포함 된 각 35 mm 페 트리 접시.
참고: 바이러스 titer에 따라 사용 하는 회사 데이터 시트에서 제공 하는 바이러스의 볼륨 조절. - 포함 하는 바이러스에서 독도 문화 24 h. 위해 37 °C/5% CO 2 미디어
- 후 24 h 발음 바이러스 포함 된 미디어 및 (와 함께 10 %FBS 2 mM L-글루타민) 2 mL CMRL 문화 미디어 바꿉니다.
- 4-6 일 37 °C/5% CO 2, 대체 미디어 매 3 일에는 독도 문화.
- 후 4-6 일 경작의 기대 주위 감염 되는 작은 섬 세포의 30%. 독도 라이브 이미징 실험에 사용할 수 있습니다.
2. Confocal 이미징의 감염 독도
참고: confocal 영상에 필요한 장비와 재료에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오.
- 시 약 준비 및 실험적인 체제
- 준비 extracellular 솔루션: pH 7.4, 살 균 필터링 추가 125 mM NaCl, 5.9 m m KCl, 2.56 m m CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25mm HEPES, 0.1 %BSA.
참고:이 버퍼는 일반적으로 포도 당 없이 준비 하 고 최대 1 개월 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 포도 당 원하는 최종 농도 도달 하는 실험의 날에 추가 됩니다.- 준비 기저 포도 (3mm) 매체: extracellular 솔루션 50 mL에 2 M 포도 당 재고의 75 µ L을 추가.
- Hyperglycemic (16mm) 매체: extracellular 솔루션 50 mL에 2 M 포도 당 재고의 400 µ L를 추가
- 3mm 포도 당을 포함 하는 extracellular 해결책에 어떤 추가 자극 (예를 들어, KCl 또는 아데노신 3 인산 염 (ATP)) 희석.
- 실험을 시작 하기 전에 1 h coverslip를 폴 리-D-리 솔루션 (1 mg/mL)의 30 µ L을 추가 하 고 철저 하 게 H 2 o.와 그것을 rinsing 하 여 폴 리-D-리와 coverslips을 pretreat
참고: 폴 리 코팅 coverslips 저장할 수 있습니다 실 온에서 6 개월까지. - 1 mL 피 펫을 사용 하 여 실험 하기 전에 적어도 1 시간 35 mm 페 트리 접시 3 mM 포도 당을 세포 외 솔루션을 포함 하는 독도 전송 합니다. 37 ° C, 5% CO 2에 독도 유지.
참고: 필요한 경우, 원형질 막이이 단계에서 표시 수 있습니다. 원형질 막에 레이블을, 3 mM 포도 당을 세포 외 솔루션 2 µ M 디-8-ANEPP 염료를 추가 합니다. 37 °C/5% CO 2에서 1 시간을 위한 염료 해결책에서 독도 품 어. 488에서 원형질 막 염료를 흥분 수 nm와 620에서 nm. - 분 실험을 시작 하기 전에 부착는 coverslip 이미징 챔버를 진공 실리콘 그리스와 씰링 합니다. 이미징 플랫폼 이미징 챔버를 수정 합니다. 20 분에 대 한 표면에는 독도 준수 coverslip의 폴 리 D Lysine 치료 영역에 20-30 독도 배치를 피 펫을 사용 하 여
참고: 그것은 중요 coverslip 섬 손상을 피하기 위하여 완전히 건조 하 게 하지 않습니다. - 는 독도 coverslip 준수는 하는 동안 철저 하 게 물으로 헹 궈 서 관류 시스템을 준비 합니다. 다른 채널에 추가 하는 각 솔루션: 3 mM 포도 당 (1 채널), 16 mM 포도 당 (2 채널), 16 mM 포도 당 100 µ M 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)와 10 µ M 산림 (채널 3), 3 mM 포도 당 (채널 4), 3 mM 포도 당 (에서 10 µ M ATP에에서 25 m m KCl 채널 5)입니다. 각 채널을 개별적으로 열고 몇 분 동안 솔루션 흐름을 보내는 여 시스템에서 모든 거품을 제거 하 고 흐름 일관 (0.5 mL/min) 이며 튜브 유출 되지 않습니다 있는지 확인 하십시오.
- 관류 콘센트 튜브에 단일 인라인 솔루션 히터를 연결 하 고 37 outflowing 버퍼의 온도 조정 ° c.
- 흡입 펌프를 준비합니다. 시스템에서 모든 거품을 제거 하 고 흐름은 일관 되 고 튜브 유출 되지 않습니다 있는지 확인 하십시오.
- 는 독도 coverslip 표면에 고착 되 면 부드럽게 채워 이미징 챔버를 3 mM 포도 당을 포함 하는 세포 외 솔루션. 독도 coverslip의 표면에서 세척 하지 마십시오.
- 현미경 단계에 독도와 이미징 플랫폼을 배치 하 고 관류 시스템 및 흡입 펌프에 연결.
- 차례 흐름에 그리고 끊임없이 perfuse 3 세대 extracellular 솔루션 독도. 시스템은 이제 confocal 영상에 대 한 준비.
- 준비 extracellular 솔루션: pH 7.4, 살 균 필터링 추가 125 mM NaCl, 5.9 m m KCl, 2.56 m m CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25mm HEPES, 0.1 %BSA.
- Confocal 영상
- 낮은 확대와 함께 현미경 분야에는 독도 찾습니다. 일단는 독도에 초점, 더 높은 확대 목표 전환 (예를 들어, 63 X 물 침수 목표 (63 X / 0.9 없음)).
- 소프트웨어 (테이블의 재료)를 사용 하 여 인수를 열고 공명 스캐너 모드 활성화.
- XYZT 영상 모드를 선택 하 고 인수 설정을 다음과 같이 구성:
- 설정에 아르곤 레이저와 488 nm 레이저 라인과 레이저 파워 pHluorin 여기에 대 한 50%를 조정.
- 505-555 nm에 방출 수집.
- 는 512 x 512 픽셀의 해상도 선택합니다. 보도 " 라이브 " 이미징 시작 (일반적인 이득은 약 600 V) 이득 레벨을 조정할을.
- 설정 시작 및 z 스택의 끝:는 섬 위에 집중 하 고 선택 " 시작 " 마지막 집중 될 수 있는 선택 평면 이동 " 끝 ". 5 µ m의 z 단계 크기를 사용 합니다. 소프트웨어 자동으로 confocal 비행기의 수를 계산 합니다.
- 1.5-2 s에 가까운 각 z 스택의 인수에 대 한 시간 간격을 설정 하 고 옵션 선택 " 멈출 때까지 취득 " 연속 이미징.
- 보도 " 시작 " ini 버튼tialize.
- 다양 한 자극 프로토콜을 사용 하 여 원하는 자극으로 독도 perfusing 하 여과 립 exocytosis를 유도. 자극 프로토콜 원하는 과학적 목적 (아래 참조)에 맞게 사용자 지정할 수 있습니다.
- 자극 프로토콜
참고: 3 mM 포도 당을 포함 하는 extracellular 솔루션과 지속적인 관류 동안 섬 배경 활동의 적어도 2 분을 기록 하 여 시작 하는 모든 자극 프로토콜에서. 원하는 기간에 대 한 자극 제와 perfuse. 각성제의 순서, 자극의 지속 시간 녹음 기간 원하는 과학적 목적에 맞게 사용자 지정할 수 있습니다. 새로운 자극을 시작 하기 전에 3 mM 포도 당을 포함 하는 extracellular 솔루션과 독도 씻어 있는지 확인 하십시오. 아래 샘플 자극 프로토콜 메서드 기능을 보여 주기 위해 사용 되었습니다을 찾아.- PHluorin pH 감도 및 바이러스 감염 효율 ( 그림 3)에 대 한 긍정적인 제어로 염화 암모늄 (NH 4 Cl)와
- Stimulate: 3 mM 포도 당 (2 분) → 50mm NH 4 Cl (2 분)에 3 mM 포도 당 → 포도 당 3 m m (2 분)
참고: NH에서 4 Cl 솔루션, 아데닌 기초에 NaCl을 대체. - Stimulate ( 그림 5 및 그림 6) 포도 당 농도 증가 시켜 인슐린과 립 exocytosis: 3 mM 포도 당 (2 분) → 16 m m 포도 당 (15-30 분) → 3 m m 포도 당 (2 분
참고: 적어도 15 분에 대 한 16 G 솔루션으로 지속적으로 독도 perfuse 활동의 몇몇 파열을 보려면
참고: 분 비 응답 17의 일관성을 증가 하기 위하여 사용자가 3g와 16 G 솔루션 캠프 모금 에이전트 (100 µ M IBMX 및 10 µ M 산림)를 추가할 수 있습니다. 이 립 분 비의 시간적 패턴을 변경 하지 않습니다. 내용은 15와 토론을 참조 하십시오.
- Stimulate: 3 mM 포도 당 (2 분) → 50mm NH 4 Cl (2 분)에 3 mM 포도 당 → 포도 당 3 m m (2 분)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
기술의 전체 워크플로 그림 1에 표시 됩니다. 간단히, 마우스 또는 인간의 독도 수 NPY pHluorin 인코딩 하는 아 데 노 바이러스에 감염 되며 문화, confocal 현미경 아래에서 몇 일 후 몇 군데. 과 립 원형질 막 및 오픈 퓨즈, 형광 증가 관찰 고 측정할 수 있습니다 (그림 1). NPY pHluorin 실제로 인슐린과 립 역학을 모니터링 하는 데 적합 한 도구 인지 확인, 감염 된 독도 GFP와 다른 섬 호르몬 인슐린, somatostatin 또는 글 루카 곤에 대하여 항 체와 immunostained 했다. 대부분의 세포 표현 NPY-pHluorin (GFP 긍정적인) 베타 세포 했다 그들은 또한 인슐린을 표현 (~ 90%; 그림 2A, 2B). 몇 글 루카 곤-긍정적인 알파 세포 또는 somatostatin 긍정적인 델타 세포 GFP 표시 (그림 2B) 했다. 감염 된 세포, 인슐린 (GFP와 0.21 ± 0.05 GFP와 글 루카 곤 및 0.07 ± 0.01 GFP 및 somatostatin 대 인슐린 0.61 ± 0.04의 Pearson의 상관 계수)와 colocalized NPY 퓨전에서 중요 한 것은.
우리는 pHluorin는 효과적인 pH 센서 시연 50mm NH4세포내 pH를 증가으로 Cl 결과 > (그림 3A, 3B, 비디오 1) 세포내 형광에 500% 증가. NPY pHluorin를 포함 하는 립 막 도발은 KCl (그림과 같은 인슐린 exocytosis를 자극 하는 조건에 따라 표시 되는 퓨전 원형질 막과 융합 숨 구멍의 오프닝에는 립 내부의 pH 증가 4, 비디오 2).
그대로 독도 내 베타 세포에서 분 비 이벤트를 단일 NPY pHluorin 감염 독도의 confocal 시간 경과 영상으로 구상 될 수 있다. 이러한 직접 막 도발은 KCl 또는 다른 여러 가지 생리 적 자극 (그림 4 및 그림 7, 아래 참조)에 발생 합니다. 기저 세포 외 포도 당 농도 (3mm)에 작은 분 비 활동 관찰 됩니다. 그러나, 플라즈마 막으로과 립 퓨전 높은 포도 당 (16mm) (그림 5A, 비디오 3)와 자극에 대 한 응답에서 트리거됩니다. 다른 크기를 가진 ROIs를 배치 하 여, 다른 지역에서 개별 셀 또는 셀 근접 (클러스터) (그림 5B)의 그룹의 분 비과 립의 응답 속도 비교할 수 있습니다. 이러한 유형의 분석을 사용 하는 결정: 1)는 개별 분 비 이벤트 매우 동기화 하 고 분 비 평균 세포 반응에서 몇 초 이내 및 근접에서 2) 베타 세포 기능 클러스터 동기화 된 활동의 형성.
신체에서 인슐린 분 비는 타악기 방식으로 발생합니다. 장기간 (15-20 분) (그림 6, 비디오 4) 분 비의 여러 펄스 (또는 파열) 상승 했다에 대 한 높은 포도 당 농도와 NPY pHluorin 감염 독도 자극. 각 펄스 동안 개별과 립 (그림 5) 전에 같이 동기화 된 패션에 플라즈마 막으로 퓨즈. 분 비 활동의 파열 될 수 있습니다 볼 수 모든 3-4 분.
과도 NPY-pHluorin 포함과 립 또한 purinergic 주 작동 근 ATP에 대 한 응답에서 관찰 될 수 있는 형광에 증가 (10 µ M) 또는 muscarinic 주 작동 근 아 세 틸 콜린 (ACh, 10 µ M) 둘 다의 자극으로 알려져 있다 (그림 7), 인슐린 분 비 인간의 독도입니다. 예상 했던 대로, KCl (30mm)와 막 도발은 인슐린과 립 exocytosis (그림 5)를 실행. 여러 자극으로는 독도 자극 사이 잘 씻어 같은 섬 준비에 적용할 수 있습니다. 실험을 반복 하는 경우 응용 프로그램의 순서를 변경할 수 있는지 확인 합니다.
그림 1입니다. 분석 결과 설명 하는 구조 개발. NPY를 결합 하는 pH에 민감한 GFP (pHluorin)를 인코딩하는 아 데 노 바이러스 생산과 마우스 또는 인간의 췌 장 독도 감염 하는 데 사용 했다. 감염 후 4 ~ 6 일에 독도 coverslip에 배치 되었고 수직 레이저 검사 confocal 현미경 아래 몇 군데. NPY pHluorin 구조는 베타 세포에서 인슐린과 립에 표현 된다. 그것의 형광 성숙한 인슐린 알갱이의 산 성 pH에서 침묵 이다 하지만 립 퓨전 원형질 막 및 7.4의 extracellular 중립 pH에 노출 시 밝은.
그림 2입니다. 인슐린과 립 표현 된 NPY 퓨전 구성. (A) 그대로 인간의 독도의 공초점 이미지 감염 된 NPY-pHluorin, immunostained GFP (녹색) 및 인슐린 (왼쪽된 패널, 빨간색), somatostatin (중간, 빨간색) 또는 글 루카 곤 (오른쪽, 빨간색). 세포 핵 블루 (DAPI 표시)에 표시 됩니다. 스케일 바 = 10 µ m. (B) 또한 인슐린 (Ins), somatostatin (소마) 또는 글 루카 곤 (Glu)를 포함 하는 GFP-긍정적인 세포의 일부분의 정량화. 표시 된 평균 ± SEMs, n = 5 독도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. NPY pHluorin 효과적인 pH 센서 이다. 3mm (상단 패널, 3 세대) 전에 포도 당을 포함 하는 세포 외 솔루션에서 NPY pHluorin 감염 마우스 섬의 공초점 이미지의 (A) 최대 투영 및 50 mM NH4Cl (하단 패널)의 존재. 눈금 막대 = 100 µ m. (B) 평균 형광 강도 (임의의 단위) NH4cl. 파선 선 유도 전체 섬에 있는 변화를 보여주는 추적 NH4Cl 응용 프로그램을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 일단 그들은 원형질 막 및 오픈 퓨즈 NPY pHluorin를 포함 하는 립 표시 되. NPY pHluorin 아 데 노 바이러스와 인간 isletsinfected가 했다 incubat플라즈마 막으로에 드 디-8-ANEPP (레드) 염료. KCl (30mm)와 섬 자극 (녹색에서 표시) 셀 표면에 형광 알갱이의 급격 하 고 과도 모양이 트리거됩니다. 인간의 섬 내의 셀의 공초점 이미지 exocytotic 응답 앞에 표시 됩니다 (t = 0), 동안 (t = 3-9 s) 후 (t = 12 s). 대비 배경 녹색 형광을 제거 하려면 조정 되었다. 눈금 막대 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5입니다. 높은 포도 당 유발 플라즈마 막으로 NPY pHluorin 퓨전. (A) 그대로 인간의 섬 기저 포도 당 농도 (3 세대-3 m m 포도 당, 왼쪽 패널) 또는 높은 혈당 (포도 당 16 G-16 m m, 오른쪽 패널)에서 NPY pHluorin 감염의 공초점 이미지 최대 투영 Extracellular 솔루션 포함 에이전트 산림 및 IBMX (자세한 내용은 프로토콜 참조)을 모금 하는 캠프. 눈금 막대 = 10 µ m. (B) 세포 (녹색) 또는 셀 클러스터 (블루) 추적 ROIs에서 녹색 채널에 평균 형광 강도 (임의의 단위)에 변화를 보여주는 단일 분 비 이벤트 (레드과 립), 주위에 배치. 높은 포도 당 5 분 후 적용 ~ 3 세대에서 2.5 분. 형광 값 초기 형광 값 (초기 계획)을 정상화 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6입니다. 분 비 이벤트 생성 시 높은 포도 당 분 비의 개별 펄스. 추적에 있는 변화를 보여주는 ROIs 16 m m 포도 당으로 지속적인된 자극 동안 그대로 인간의 섬 내의 다른 셀 주위에 배치에 형광 강도 (임의의 단위)을 의미 합니다. 각 개별 셀을 나타냅니다. 분 비 활동의 파열 될 수 있습니다 볼 수 모든 3-4 분 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7입니다. NPY pHluorin 퓨전 플라즈마 막으로 알려진 자극의 인슐린 분 비에 의해 트리거됩니다. 추적 ROIs 의미 형광 강도 (임의의 단위) 변화를 보여주는 개별 분 비 이벤트 KCl (30 m m), ATP에 의해 유도 된 그대로 인간의 독도 내 셀 주위에 배치 (10 µ M), 높은 혈당 (16 G, 16 m m)과 아 세 틸 콜린 (Ach, 10 µ M). KCl과 ATP 기저 포도 당 농도 (3mm)에 적용 했다. 블랙 라인 표시 평균과 립 및 회색 라인 sem의 값을 반영 합니다. 녹색 추적 해당 세포 응답을 표시합니다. 수평 시간 규모 (2 분) 모든 그래프에 적용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
1 비디오입니다. NPY pHluorin 아 데 노비 루스 효율적으로 감염 섬 세포와 감각 pH 변화.
마우스 독도 4 일 동안 인코딩 NPY pHluorin 아 데 노비 루스 감염 되었습니다. 감염 된 독도 coverslip에 배치 하 고 이미징 챔버에 장착 했다. 세포내 pH를 증가 하는 독도 50mm NH43 mM 포도 당을 포함 하는 세포 외 솔루션에 추가 하는 Cl 끼얹는다 했다. NH4Cl 응용 프로그램에 따라 형광에 빠르고 강한 증가 볼 수 있습니다. 눈금 막대 = 100 µ m. 영화 속도 = 5 fps. 영화의 총 기간은 90 s. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼입니다. (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 2입니다. 일단 그들은 원형질 막 및 오픈 퓨즈 NPY pHluorin를 포함 하는 립 표시 된다.
인간의 독도 NPY pHluorin 아 데 노비 루스 감염 했다 플라즈마 멤브레인 염료 디-8-ANEPP와 함께 알을 품을. KCl (30mm)와 섬 자극 세포 표면에 형광 알갱이의 급격 하 고 과도 모양이 트리거됩니다. Confocal 비행기의 최대 투영 표시 됩니다. 대비 배경 녹색 형광을 제거 하려면 조정 되었다. 눈금 막대 = 20 µ m. 영화 속도 = 5 fps. 영화의 총 기간은 60 s. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼입니다. (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 3입니다. NPY-pHluorin를 포함 하는 알갱이의 높은 포도 당 트리거 Exocytosis.
NPY pHluorin 포함 된 알갱이의 퓨전 높은 포도 당 (16 m m)와 자극에 대 한 응답에서 트리거됩니다. 기저 세포 외 포도 당 농도 (3mm), 작은 분 비 활동을 관찰 합니다. 그러나, 높은 포도 당에 따라 인슐린과 립 정도 동기화 방식에서 섬에 다른 세포의 원형질 막에 나타납니다. 높은 포도 당 후 적용 ~ 3 세대에서 2.5 분 (16 G 레이블을 나타납니다). Confocal 비행기의 최대 투영 표시 됩니다. 눈금 막대 = 20 µ m. 영화 속도 10 fps =. 영화의 총 기간은 7 분 가이 비디오를 보려면 여기를 클릭 하십시오입니다. (다운로드 오른쪽 클릭.)
4 비디오입니다. 높은 포도 당으로 장기간된 자극 Exocytosis의 여러 파열을 트리거합니다.
높은 포도 당으로 장기간된 자극 분 비 독도, 동안과 립 뚜렷이 표시의 다중 펄스 상승을 제공 합니다. 분 비 활동의 펄스를 볼 수 있는 모든 ~ 인간의 섬의 3-4 분 Confocal 평면 표시 됩니다. 모조 색상 구성표는 형광 강도 대 한 적용 되었습니다. 눈금 막대 = 20 µ m. 영화 속도 = 30 fps. 영화의 총 기간은 20 분 가이 비디오를 보려면 여기를 클릭 하십시오입니다. (다운로드 오른쪽 클릭.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 원고는 confocal 현미경 검사 법에 의해 exocytosis 그대로 췌 장 독도 내 베타 세포에서 인슐린 알갱이의 시각화를 사용할 수 있는 기술을 설명 합니다. 그것은 높은 transfection 효율을 보장 하기에 아 데 노비 루스 복제 형광 기자로 NPY-pHluorin를 사용 합니다.
방법은 우리 손에 고효율, 그것은 주로 두 개의 매개 변수 의존 하는 몇 가지 수정 해야 할 수도 있습니다: 1) 섬 준비, 및 감염 조건 최적화와 바이러스 성 주식의 2) titer의 품질. 독도의 바이러스 감염, 이전 섬 준비를 37 ° c.에 하룻밤 격리 및 수송 스트레스 로부터 복구할 수 있도록 셀 섬 표면 또는 섬 센터18 에 hypoxic 세포 (어두운 세포)의 존재에서 튀어나와 등 감소 생존의 흔적에 대 한 확인 하 고 감염/식 기간 내내 가벼운 현미경 섬 형태 검사 . 각 바이러스 성 주식의 titer 및 감염 효율성에서 달라질 수 있습니다. 바이러스 titer의 현미경 분석 결과 사전 문화 시간에 따라 사용 하는 바이러스의 볼륨을 조정 해야 합니다. 가장 중요 한 단계는 충분히 기자는 표현과 섬 무결성 및 응답 유지 감염 조건 (예를 들어, 바이러스 성 입자의 수, 시험 전에 문화 시간)의 최적화를. 감염 프로토콜을 최적화 하는 경우와 각 새로운 바이러스 성 배치와 함께, 다른 시간 지점에서 몇 가지 독도 수집 하 고 exocytosis KCl (30mm) 또는 높은 포도 당 (16mm) elicited 수 여부 확인. 우리는 발견 분석 결과 더 나은 작품 및 작은 섬 세포 건강 유지 포도 나 낮은 (약 2)와 문화 시간 때 응답 퓨전 구문 식 수준을 증가 (약 5 일) 확장 됩니다. 우리의 결과 이전 연구 유전자 제품의 효율적인 표현을 달성 될 수 있도록 더 나은 adenoviral vector의 낮은 transfecting 농도에서 섬 함수19를 유지 하면서 보여주는 라인.
그러나 기술은,, 몇 가지 제한이 있다. 하나는 기자로 서 NPY-pHluorin를 사용 하 여과 립 수 없습니다 구상 될 전에 그들은 원형질 막으로 융합 및 융합 공 열립니다입니다. 공부 하 고 인슐린과 립 exocytosis 대신 매매, 아 데 노 바이러스 NPY eGFP 인코딩 대신 사용할 수 있습니다. 또 다른 한계는, 낮은 정도로 NPY pHluorin 될 대상으로 수 있습니다 비 인슐린 포함과 립 이다. 그러나, NPY pHluorin에 감염 된 세포의 대부분은 또한 인슐린과 세포 표현 글 루카 곤 또는 somatostatin의 10% 미만 표현. 실제로,과 립 분 비, 타악기 패턴 및 공동 지역화, 인슐린과 포도 당 종속성 표시 가장 분 비 이벤트 인슐린과 립에서 화물 자료를 나타냅니다. 인슐린의 모니터링 되도록 exocytosis 발생, 분석 결과 (예를 들어, 높은 포도 당) 인슐린 분 비를 자극 하는 조건 하에서 수행 되어야 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 베타 셀 식의 특이성을 개선 하기 위해, NPY pHluorin는 쥐 인슐린 발기인 등 선택적 발기인의 통제 할 수 있습니다. 기술의 또 다른 한계는 그것은 exogenous 인슐린과 립, 그들의 속 및 동작20를 교란 할 수 있는 단백질의 식이 필요. 이 실험의 결과 해석할 때 고려해 야 하 고, 만약에 가능 하다 면, 결론 유효성을 검사 해야 다른 인슐린과 립 화물 단백질을 사용 하 여 (예를 들어, C-펩 티 드, 작은 섬 녹말 체 폴 리 펩 티) 기자로.
또한이이 프로토콜 에이전트 캠프 모금 (IBMX 및 산림) 인슐린과 립 exocytosis에 높은 포도 당의 효과 약효를 포함 하는 것이 좋습니다. 이 자극 프로토콜 모방의 순수 관련 증폭 경로 (incretins 또는 paracrine 및 신경 신호 분자에 의해 트리거) 인슐린 분 비 췌 장 베타 세포에서 캠프를 증가 시켜 약효를 활성화 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 모금 에이전트 캠프의 부재, 높은 포도 당 (16 m m)는 또한과 립 exocytosis elicits 하지만 분 비 이벤트 관찰 수 낮습니다. 과 립 여전히 개별 버스트에서 평균 셀 응답와 동기화 나타나고 비슷한 버스트 기간 표시: 1.5-10 분 혼자 높은 포도 당에 대 높은 포도 당 플러스 IBMX/산림에서 1.4-6.6 분.
그것이 충분 한 공간 및 시간 해상도 그대로 독도 내 베타 세포에서 실시간으로에서 단일 퓨전 이벤트 시각화를 여기에 설명 된 분석 결과 기존의 방법에 관하여 중요 하다. 예를 들어, 그것은 높은 동기화를 인슐린과 포도 당 자극에 따라 인간의 독도에 출시는 밝혔다. 또한, 만약 독도 coverslip 잘 부착은, 그들은 수 수 몇 군데 장기간 (적어도 15-20 분) 동안. 이것은 인간의 독도 exocytosis 타악기 vivo에서 인슐린 분 비의 비슷한 기간에 나타나는 고유 파열에서 발생 보여 사용 되었다. 분석 결과 또한 인슐린 exocytosis murine 또는 인간의 독도 사용 하 여 여러 자극의 효과 테스트할 수 있습니다. 또한, 다른 방법 처럼 작은 섬 세포 분리는 필요 하지 않습니다, 때문에 그것은 베타 세포 인구는 섬 내에서 동작을 연구에 적용할 수 있습니다. 사실, 우리 이웃 베타 세포 클러스터의 형태로 관찰 ~ 5-10의 세포 활동이 동기화 됩니다. 동일한 클러스터에서 베타 세포는 아마 갭 정션 채널 connexin 3621의 의해 결합 됩니다. 동기화 응답 그들의 적절 일 분 비22필수적인 베타 세포 연결을 보여 줍니다.
미래에,이 기술은 어떻게 cytosolic 칼슘 또는 막 잠재력, 변화 예를 들어, 연관 베타 세포에서과 립 exocytosis 실시간으로 시각화 기능 이미징에 대 한 다른 형광 성 염료와 결합할 수 있습니다. 특히, 새로운 pH 민감한 붉은 형광 단백질 사용 가능한14,23 되고있다 고 NPY 또는 다른 인슐린과 립 화물 단백질을 융합 될 수 있는, 기능적인 화상 진 찰에 대 한 녹색 염료를 사용할 수 있습니다. 또한,이 기술은 vascularized 독도24마우스 눈 앞쪽 챔버에 이식의 비보에 이미징에 대 한 마우스 모델와 결합할 수 있습니다. 독도 adenoviruses 감염 될 수 있습니다 눈에 이식 하기 전에 48-72 h. 면역 결핍 생쥐 인간의 독도 이식 하는 경우 사용 되어야 한다. 이 모델을 사용 하 여, 인슐린과 립 분 비의 subcellular 공간 패턴 혈관 준비25와 상관 될 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
저자는 현미경으로 도움말에 대 한 핵심 시설을 이미징 DRI에서 마 샤 Boulina 감사 합니다. 이 작품은 NIH 교부 금 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 및 R56 DK084321 (AC)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
References
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
- Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
- Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
- Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
- Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478 (2011).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
- Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
- Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
- Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801 (2015).
- Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632 (2015).
- Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
- Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
- Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
- Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target? Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
- Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).
