共焦点イメージングの神経ペプチド Y-pHluorin: そのままのマウスと人間のランゲルハンス島におけるインスリン開口分泌の可視化技術
Summary
PHluorin、pH に敏感な緑色蛍光タンパク質を用いたそのまま膵ランゲルハンス島のインスリン分泌の可視化のためのプロトコルについて述べる。膵島は、小胞貨物ニューロペプチド Y に結合された pHluorin をエンコード アデノ ウイルスに感染しています。これにより、共焦点顕微鏡によるインスリン顆粒の融合イベントを検出するため。
Abstract
インスリン分泌は、病気のようにも通常生理条件下でのグルコース恒常性で中心的な役割を果たしています。インスリン開口分泌電気生理学や顕微鏡蛍光レポーターの式に結合を使用するかを検討する現在のアプローチ。しかしこれらの技術のほとんどはクローン細胞株に最適化されています。 または膵島を分離を必要とします。対照的に、ここで紹介した方法はそのまま膵ランゲルハンス島のインスリン開口分泌のリアルタイム可視化できます。このプロトコルでまずエンコード pH 敏感な緑色蛍光タンパク質 (GFP)、pHluorin、神経ペプチド Y(NPY) と結合したアデノ ウイルスの単離膵島のウイルスの感染を示します。第二に、我々 は、共焦点イメージング島 5 日間後ウイルス感染とインスリン顆粒分泌を監視する方法について説明します。簡単に言えば、感染した小島をイメージング室 coverslip のされされて継続的に様々 な刺激を含む細胞外の溶液を灌流中の直立レーザー走査型共焦点顕微鏡の下でイメージを作成します。高速共鳴スキャナーを使用して時間経過の録音として膵島の 50 μ m にまたがる共焦点画像を取得します。インスリン顆粒細胞膜との融合は、時間をかけて続けることができます。この手順は、単一の実験で刺激のバッテリのテストが可能になりますまた、マウスと人間の島の両方と互換性のある、機能イメージング (例えば膜の潜在性またはゾル性細胞質カルシウム染料) のための様々 な染料と組み合わせることができます。
Introduction
インスリンは膵島のベータ細胞によって生成される、グルコース代謝1の重要な調節因子であります。死またはベータ細胞の機能不全はグルコース恒常性を乱すし、糖尿病2に 。Ca2 +でリリースされている芯顆粒中にインスリンがパック-に依存する方法3。インスリン開口分泌の調整方法を解明理解何がインスリン分泌を決定し、糖尿病の治療のための新規治療標的の同定のための新しい道を開くに不可欠です。
インスリン分泌は、蛍光分子との組み合わせで, 膜容量測定と顕微鏡的アプローチなどの電気生理学的アプローチを使用して幅広く研究されています。膜容量測定時間分解能が良いがあるし、単一セルの録音を許可します。ただし、静電容量の変化セルの純表面変更を反映し個々 の融合イベントをキャプチャか他の非インスリン分泌小胞3からインスリン顆粒の融合を区別します。蛍光プローブと小胞積荷タンパク質との組み合わせで 2 光子または全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡などの微視的アプローチは、追加の詳細を提供します。これらの技術は、分泌の単一イベントとも前と後に分泌の段階をキャプチャし、セル3の人口の分泌パターンを勉強するため。
蛍光レポーターを 3 種類にすることができます: 1) 細胞外、2) 細胞質、または 3) 小胞。1) 細胞外記者が極地のトレーサー (例えばdextrans、sulforhodamine B (SRB)、黄色、ルシファー ピラニン)4細胞外の環境を導入することができます。極のトレーサーの使用は細胞の人口の融合細孔の調査では、し、血管など様々 な細胞構造をキャプチャします。しかし、彼らは小胞貨物に関する報告はしません。2) 細胞質の記者は、細胞質に直面、ドッキングと開口放出に関与する膜準蛋白質に結合する蛍光プローブです。神経科学神経伝達物質のリリース5を勉強するために正常に使用されている水溶性Nエチルマレイミド感受性因子添付ファイル蛋白質受容体 (スネア) 家族のメンバーがあります。そのような蛋白質は複数の結合パートナーがあり、インスリン顆粒特定。3) 小胞の記者は、貨物固有ベシクル挙動の調査を可能にする小胞貨物蛋白質に融合した蛍光プローブです。インスリン顆粒特定貨物蛋白質は他の間でインスリン、c-ペプチド、膵島アミロイドポリペプチド NPY を含める6,7。NPY は、インスリン顆粒を含むであるのみ、共同蛍光レポーター8の優秀なパートナーとなってインスリン、解放されます。
NPY を異なる蛍光タンパク質の融合は特定シナプトタグミン アイソ フォーム9,10の要件などの神経内分泌細胞の開口放出の様々 な面を調査する以前採用されている方法リリースの時間コースには、アクチン細胞骨格とミオシン II11,12によって異なります。本研究では非蛍光性は、変更された GFP 蛍光レポーターとして pHluorin を選んだ内部コアの密度の高い酸性 pH で顆粒は、中立的な細胞外 pH13への露出に鮮やかな蛍光なります。成熟したインスリン顆粒 5.5 以下の酸性の pH があります。顆粒は細胞膜と開きますヒューズ、一度その貨物が 7.4,7,14でレポーターとして pH 感応蛋白質 1p-169 利用できるの中立的な細胞外 pH に公開されます。
1p-169 pH の敏感な性質とインスリン顆粒中の NPY の選択式、NPY pHluorin 融合コンストラクトを使用してインスリン開口分泌のさまざまなプロパティを研究できます。融合コンストラクトのウイルスの伝達は高いトランスフェクション効率を確保し、一次ベータ細胞または細胞や膵島を動作します。このメソッドは、NPY を含む小胞を持つ他の細胞型で開口放出を勉強するためのガイドラインとして使用できます。それは、特定の条件(ノックダウン、過剰発現等)の影響を検討する任意のトランスジェニック マウス モデルによる開口放出に組み合わせることもできます。この手法は、以前インスリン顆粒分泌 β 細胞膵島15の時空間パターンを特徴付けるために使用されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、共焦点顕微鏡による内そのままの膵島 β 細胞でインスリン顆粒の開口放出を視覚化するために使用できる手法について説明します。高いトランスフェクション効率を確保するためにアデノ ウイルス複製蛍光レポーターとして NPY pHluorin を使用します。
メソッドは私たちの手で非常に効率的なそれは主に 2 つのパラメーターに依存するいくつかの変更を必要が?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、イメージング顕微鏡の助けを中核施設 DRI からマーシャ Boulina をありがとうございます。この作品は、NIH の助成金 1K01DK111757-01 (JA)、F31668418 (MM)、R01 DK111538、R33 ES025673、R56 DK084321 (AC) によって支えられました。
Materials
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22×40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
References
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
- Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
- Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
- Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
- Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478 (2011).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
- Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
- Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
- Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801 (2015).
- Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632 (2015).
- Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
- Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
- Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
- Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target?. Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
- Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).
