Summary
PHluorin、pH に敏感な緑色蛍光タンパク質を用いたそのまま膵ランゲルハンス島のインスリン分泌の可視化のためのプロトコルについて述べる。膵島は、小胞貨物ニューロペプチド Y に結合された pHluorin をエンコード アデノ ウイルスに感染しています。これにより、共焦点顕微鏡によるインスリン顆粒の融合イベントを検出するため。
Abstract
インスリン分泌は、病気のようにも通常生理条件下でのグルコース恒常性で中心的な役割を果たしています。インスリン開口分泌電気生理学や顕微鏡蛍光レポーターの式に結合を使用するかを検討する現在のアプローチ。しかしこれらの技術のほとんどはクローン細胞株に最適化されています。 または膵島を分離を必要とします。対照的に、ここで紹介した方法はそのまま膵ランゲルハンス島のインスリン開口分泌のリアルタイム可視化できます。このプロトコルでまずエンコード pH 敏感な緑色蛍光タンパク質 (GFP)、pHluorin、神経ペプチド Y(NPY) と結合したアデノ ウイルスの単離膵島のウイルスの感染を示します。第二に、我々 は、共焦点イメージング島 5 日間後ウイルス感染とインスリン顆粒分泌を監視する方法について説明します。簡単に言えば、感染した小島をイメージング室 coverslip のされされて継続的に様々 な刺激を含む細胞外の溶液を灌流中の直立レーザー走査型共焦点顕微鏡の下でイメージを作成します。高速共鳴スキャナーを使用して時間経過の録音として膵島の 50 μ m にまたがる共焦点画像を取得します。インスリン顆粒細胞膜との融合は、時間をかけて続けることができます。この手順は、単一の実験で刺激のバッテリのテストが可能になりますまた、マウスと人間の島の両方と互換性のある、機能イメージング (例えば膜の潜在性またはゾル性細胞質カルシウム染料) のための様々 な染料と組み合わせることができます。
Introduction
インスリンは膵島のベータ細胞によって生成される、グルコース代謝1の重要な調節因子であります。死またはベータ細胞の機能不全はグルコース恒常性を乱すし、糖尿病2に 。Ca2 +でリリースされている芯顆粒中にインスリンがパック-に依存する方法3。インスリン開口分泌の調整方法を解明理解何がインスリン分泌を決定し、糖尿病の治療のための新規治療標的の同定のための新しい道を開くに不可欠です。
インスリン分泌は、蛍光分子との組み合わせで, 膜容量測定と顕微鏡的アプローチなどの電気生理学的アプローチを使用して幅広く研究されています。膜容量測定時間分解能が良いがあるし、単一セルの録音を許可します。ただし、静電容量の変化セルの純表面変更を反映し個々 の融合イベントをキャプチャか他の非インスリン分泌小胞3からインスリン顆粒の融合を区別します。蛍光プローブと小胞積荷タンパク質との組み合わせで 2 光子または全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡などの微視的アプローチは、追加の詳細を提供します。これらの技術は、分泌の単一イベントとも前と後に分泌の段階をキャプチャし、セル3の人口の分泌パターンを勉強するため。
蛍光レポーターを 3 種類にすることができます: 1) 細胞外、2) 細胞質、または 3) 小胞。1) 細胞外記者が極地のトレーサー (例えばdextrans、sulforhodamine B (SRB)、黄色、ルシファー ピラニン)4細胞外の環境を導入することができます。極のトレーサーの使用は細胞の人口の融合細孔の調査では、し、血管など様々 な細胞構造をキャプチャします。しかし、彼らは小胞貨物に関する報告はしません。2) 細胞質の記者は、細胞質に直面、ドッキングと開口放出に関与する膜準蛋白質に結合する蛍光プローブです。神経科学神経伝達物質のリリース5を勉強するために正常に使用されている水溶性Nエチルマレイミド感受性因子添付ファイル蛋白質受容体 (スネア) 家族のメンバーがあります。そのような蛋白質は複数の結合パートナーがあり、インスリン顆粒特定。3) 小胞の記者は、貨物固有ベシクル挙動の調査を可能にする小胞貨物蛋白質に融合した蛍光プローブです。インスリン顆粒特定貨物蛋白質は他の間でインスリン、c-ペプチド、膵島アミロイドポリペプチド NPY を含める6,7。NPY は、インスリン顆粒を含むであるのみ、共同蛍光レポーター8の優秀なパートナーとなってインスリン、解放されます。
NPY を異なる蛍光タンパク質の融合は特定シナプトタグミン アイソ フォーム9,10の要件などの神経内分泌細胞の開口放出の様々 な面を調査する以前採用されている方法リリースの時間コースには、アクチン細胞骨格とミオシン II11,12によって異なります。本研究では非蛍光性は、変更された GFP 蛍光レポーターとして pHluorin を選んだ内部コアの密度の高い酸性 pH で顆粒は、中立的な細胞外 pH13への露出に鮮やかな蛍光なります。成熟したインスリン顆粒 5.5 以下の酸性の pH があります。顆粒は細胞膜と開きますヒューズ、一度その貨物が 7.4,7,14でレポーターとして pH 感応蛋白質 1p-169 利用できるの中立的な細胞外 pH に公開されます。
1p-169 pH の敏感な性質とインスリン顆粒中の NPY の選択式、NPY pHluorin 融合コンストラクトを使用してインスリン開口分泌のさまざまなプロパティを研究できます。融合コンストラクトのウイルスの伝達は高いトランスフェクション効率を確保し、一次ベータ細胞または細胞や膵島を動作します。このメソッドは、NPY を含む小胞を持つ他の細胞型で開口放出を勉強するためのガイドラインとして使用できます。それは、特定の条件(ノックダウン、過剰発現等)の影響を検討する任意のトランスジェニック マウス モデルによる開口放出に組み合わせることもできます。この手法は、以前インスリン顆粒分泌 β 細胞膵島15の時空間パターンを特徴付けるために使用されています。
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Protocol
マイアミ大学の動物倫理委員会は、すべての実験を承認した
。1 です。 ウイルス感染のそのまま分離人間またはマウスの膵島
- 島文化: 膵島培養メディアを準備: コンノート医学研究所 (CMRL) 1066、10% (v/v) FBS と 2 mM L グルタミン。
- ヒト膵島は、統合された膵島配布プログラム (NIDDK, NIH) から取得されます。到着時に転送島 (~ 500 アイレット同等) に 35 mm 組織培養処理 2 mL CMRL 培養基で 37 ° C、5/95% CO 2/O 2 ウイルス感染前に 24 h のペトリ皿 。
- マウス膵ランゲルハンス島を分離以前に確立されたプロトコル 16 次にすることができます。次の分離、培養 〜 200 島同等の 35 mm 組織培養処理 2 mL CMRL 培養基で 37 ° C、5/95% CO 2/O 2 ウイルス感染前に 24 h のペトリ皿
。 注意: NPY pHluorin と蛍光の重複を避けるために島に表明した GFP や YFP の記者とトランスジェニック マウスは使用しない 。
- ウイルス準備
注: NPY pHluorin 融合 pcDNA3 ベクトル 10 に複製され subcloned アデノウイルスベクター アデノ ウイルスの生産のために [アデノ ウイルス血清型 5 (コピー DE1/E3)] 組換えアデノ ウイルスによる製造会社。ウイルスが避けようと-80 ° C で保存されます。ウイルスの在庫は 10 の抗体で会社によって提供 12 10 13 ウイルス粒子 (〜 3 × 10 10 - 3 x 10 11 PFU)。- 体外 膵感染、使用 10 6 PFU/mL 約 2 (詳細については 議論 を参照) の感染 (MOI) の近似的多様性に終って
- 膵島のウイルス感染
注意: バイオ セーフティ レベル 2 (BSL2) プロシージャおよび証明にアデノ ウイルスでの作業が必要です。ガイダンス ・ BSL2 手続きに関する研修制度バイオ セーフティに関する役員に確認してください。- 上記のように人間/マウス島を準備します 。
- (10 %fbs と 2 mM L グルタミン) と CMRL 培地 2 mL に人間/マウス島を含む各 35 mm のペトリ皿にストック ウイルスの 5-10 μ L を追加します
。 注: ウイルス会社データシートで定めるウイルス力価によると使用量を調整する 。
- ウイルスを含んでいる、島の文化メディア 37 °C/5% CO 2 24 時間で
- 24 h 後吸引ウイルスを含むメディアと 2 mL CMRL 培地 (10 %fbs と 2 mM L グルタミン) で置き換えます 。
- 37 °C/5% CO 2、3 日おき、メディアの交換で 4-6 日の小島を文化します 。
- 後 4 - 養殖の 6 日間は、約、30% 膵島細胞に感染するを期待しています。小島は、ライブ イメージング実験のため使用できます 。
2。感染している小島の共焦点イメージング
注:、共焦点レーザー顕微鏡に必要な資機材の 材料表 を参照してください
。- 試薬調製と実験装置
- 細胞外のソリューションの準備: pH 7.4、滅菌フィルターの 125 mM の NaCl、5.9 mM KCl、2.56 mM CaCl 2、1 mM MgCl 2、25 mM HEPES、0.1 %bsa を追加
。 注: このバッファーは通常ブドウ糖を使わず、4 ° C で 1 ヶ月保存できます。グルコースは、所望の最終濃度に到達する実験の日に追加されます。- 準備基底グルコース (3 mM) 培地: 細胞外液 50 mL に 2 M グルコース株式 75 μ L を追加します 。
- 高血糖 (16 mM) 媒体: 細胞外液 50 mL に 2 M グルコース ストックの 400 μ L を追加
- 3 mM グルコースを含む細胞外の溶液中の任意の追加刺激 (例えば、KCl またはアデノシン三リン酸 (ATP)) を希釈します 。
- 1 h の coverslip にポリ-D-リジン溶液 (1 mg/mL) の 30 μ L を追加し、徹底的に H 2 o. 洗浄ポリ-D-リジンと coverslips を前処理実験を開始する前に
注: ポリ リジン コーティング coverslips 格納できる常温 6 ヶ月です 。
- 1 mL ピペットを使用して、実験の前に少なくとも 1 時間は 3 mM グルコースを細胞外の溶液を含む 35 mm のペトリ皿に小島を転送します。37 ° C、5% CO 2 で小島を維持します
。 注: 必要に応じて、細胞膜がこの手順でラベル付けできます。細胞膜にラベルを付ける、3 mM グルコースを細胞外の溶液に 2 μ M ・ ディ ・ 8 ANEPP 染料を追加します。37 °C/5% CO 2 で 1 h の色素溶液中の小島を孵化させなさい。膜色素は、488 で励起されることが nm と 620 で検出された nm 。
- 分、実験を開始する前に、真空のシリコン グリスをシール イメージング室に、coverslip を取り付けます。イメージング プラットフォームにイメージングの商工会議所を修正します。小島は 20 分を表面に付着させ coverslip のポリ D リジン扱われる領域に 20-30 の小島を配置、ピペットを使用して
注: coverslip 膵損傷を避けるために完全に乾燥させることが重要です 。
- 小島、coverslip に付着している間は、水ですすぐ灌流システムを準備します。別のチャンネルに各ソリューションを追加: 3 mM グルコース (1 チャンネル)、16 mM グルコース (チャネル 2)、100 μ M 3-イソブチル-1-メチルキサンチン (IBMX) と 10 μ M フォルスコリン (チャネル 3) 3 mM グルコース (チャネル 4) 3 mM グルコース (10 μ M ATP の 25 mM KCl 16 mM グルコースチャネル 5)。各チャンネルを個別に開くと、数分間ソリューション フローをさせることによって、システムからすべての泡を削除し、流れが一貫性のある (0.5 mL/分) と管が漏れていないことを確認してください 。
- 灌排水チューブに単一インライン ソリューション ヒーターを接続し、37 止水バッファーの温度を調整する ° C
- は、吸引ポンプを準備します。システムからすべてのバブルを削除して、流れが一貫した管が漏れていないことを確認します 。
- 島は、coverslip 表面に付着後は優しく 3 mM グルコースを含む細胞外の溶液でのイメージングの商工会議所によって埋めます。洗浄、カバーガラスの表面から島を避ける 。
- 顕微鏡ステージ上に小島とイメージング プラットフォームを配置し、灌流システムと吸引ポンプに接続します 。
- ターン流れ、常に 3 G 細胞外の溶液で小島を灌流します。システム共焦点レーザー顕微鏡の準備が整いました 。
- 細胞外のソリューションの準備: pH 7.4、滅菌フィルターの 125 mM の NaCl、5.9 mM KCl、2.56 mM CaCl 2、1 mM MgCl 2、25 mM HEPES、0.1 %bsa を追加
- 共焦点イメージング
- 低倍率の顕微鏡分野で小島を探します。小島に焦点を当てて後は、高い倍率の目標に切り替える (例えば、63 X 水浸対物レンズ (63 X/0.9 NA)).
- ソフトウェア (資材表) を使用して取得を開き、共振型スキャナー モードを有効にします 。
- XYZT 画像モードを選択し、取得設定を次のように:
- ターンではアルゴン レーザーおよび 488 nm レーザー ライン、50 %phluorin 励起レーザー パワーを調整します 。
- 505 555 nm の発光を収集します 。
- は、512 × 512 ピクセルの解像度を選択します。プレス、" ライブ " イメージングを起動し、(典型的な利得は約 600 V) 利得レベルを調整します 。
- 設定の開始と z スタックの末尾: 小島の上に焦点を当てるし、選択 " 開始 " 最後集中することができますを選択する平面の移動と " エンド "。5 μ m の z ステップ サイズを使用します。共焦点平面の数が自動的に算出されます 。
- 1.5-2 秒近くそれぞれの z の取得時間間隔を設定し、オプションを選択 " を停止するまでを取得 " 連続イメージング 。
- プレス、" 開始 " ini ボタンtialize.
- 必要な刺激と小島を灌によって開口分泌を誘導するさまざまな刺激のプロトコルを使用します。刺激のプロトコルを (次に見なさい) 目的の科学的な目的に合うようにカスタマイズできます 。
- 刺激のプロトコル
注: すべての刺激のプロトコルでは 3 mM グルコースを含む細胞外の溶液に一定の血流中に膵島バック グラウンド アクティビティの少なくとも 2 分を記録することによって開始します。必要な期間が覚醒剤を灌流します。覚醒剤の注文、刺激の持続時間と同様、録音の期間は、必要な科学的な目的に合うようにカスタマイズできます。新しい刺激を開始する前に 3 mM グルコースを含む細胞外の溶液で小島を徹底的に洗浄することを確認します。以下のメソッドの機能を示すために使用されているサンプル刺激のプロトコルを見つけます。- PHluorin ph 非感受性とウイルス感染効率 ( 図 3) のための肯定的な制御として塩化アンモニウム (NH 4 Cl) と
- 活性化: 3 mM グルコース (2 分) → 50 mM NH 4 3 mM グルコース Cl (2 分)→ 3 mM グルコース (2 分)
注: で、NH 4 Cl ソリューションはモルごとに NaCl を取り付けます 。
- ( 図 5 および 図 6) グルコース濃度を増やすことによって刺激するインスリン開口分泌: 3 mM グルコース (2 分) → 16 mM グルコース (15-30 分) → 3 mM グルコース(2 分
注: 活動のいくつかのバーストを見るために少なくとも 15 分の 16 G ソリューションを継続的に島を灌流
注: 分泌応答 17 の一貫性を高めるために追加キャンプ調達エージェント (IBMX 100 μ M と 10 μ M フォルスコリン) 3 G と 16 G の両方のソリューションにします。顆粒の分泌の一時的なパターンは変わりません。詳細は、 15 と ディスカッション を参照してください 。
- 活性化: 3 mM グルコース (2 分) → 50 mM NH 4 3 mM グルコース Cl (2 分)→ 3 mM グルコース (2 分)
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Representative Results
技術の全体のワークフローは、図 1に示すです。簡単に言えば、マウスまたは膵島 NPY pHluorin をエンコード アデノ ウイルスに感染しているできイメージ、共焦点顕微鏡のカルチャで数日後。顆粒は細胞膜と開くヒューズ、蛍光性の増加が観察される、定量化することができます (図 1)。どう NPY pHluorin は確かにインスリン顆粒動態を監視するための適切なツール、感染した小島は GFP と異なる膵島ホルモン インシュリン、ソマトスタチンやグルカゴン抗体と immunostained.またインスリンを表した、NPY pHluorin (GFP 陽性) を表現するほとんどの細胞が β 細胞 (~ 90%;図 2 a、 2 b)。グルカゴン陽性アルファ細胞またはデルタ ソマトスタチン陽性細胞数は GFP 標識 (図 2 b).重要なに感染した細胞、インスリン (0.61 ± 0.04 GFP と対 0.21 ± GFP およびグルカゴンの 0.05 と 0.07 ± 0.01 GFP およびソマトスタチンのインスリンのピアソンの相関係数), NPY の融合。
その pHluorin は効果的な pH センサーのデモンストレーションを行った 50 mM NH4と細胞内 pH の増加として Cl の結果、> (図 3 a、 3 bビデオ 1) 細胞内蛍光の 500% の増加。顆粒内 pH が細胞膜と融合細孔の開口部との融合時に増加、NPY pHluorin を含む顆粒が KCl (図と膜脱分極などのインスリン分泌を刺激する条件に表示されます。4、ビデオ 2)。
そのまま島の β 細胞に単一の分泌イベントは、NPY pHluorin 感染小島の共焦点のタイムラプス イメージングの視覚化できます。これらは、KCl や他のいくつかの生理学的な刺激(図 4および図 7、以下を参照してください) で直接膜脱分極の応答で発生します。基底細胞外グルコース濃度 (3 mM)、ほとんどの分泌活動が観察されません。ただし、細胞膜と顆粒の融合は、高グルコース (16 mM) (図 5 aビデオ 3) 刺激への応答でトリガーされます。異なるサイズの Roi を配置することによって、さまざまな分野で、分泌顆粒の応答速度は、個々 のセルまたは近接 (クラスター) (図 5 b) セルのグループと比較できます。このタイプの分析を有効にするを決定する: 1) 個々 の分泌イベントが非常に同期され、分泌された平均細胞応答から数秒以内と近接 2)、β 細胞が同期された活動の機能のクラスターを形成します。
体内のインスリン分泌は、拍動性の方法で発生します。長時間 (15-20 分) は複数パルス (またはバースト) (図 6ビデオ 4) 分泌の上昇を与えた高グルコース濃度と NPY-pHluorin に感染した小島を刺激します。各パルス中に個々 の顆粒 (図 5) の前に示すように、同期方法で膜融合します。分泌活動のバーストすることができますすべての 3 〜 4 分を見た。
一過性 NPY pHluorin 含む顆粒はプリン アゴニスト ATP に対しても観察できる蛍光に上昇 (10 μ M) またはムスカリン作動薬アセチルコリン (ACh、10 μ M) (図 7)、どちらがの知られています。膵島のインスリン分泌。予想通り、KCl (30 mM) と膜脱分極はまたインスリン開口分泌 (図 5) を発生します。いくつかの刺激は、小島が刺激の間によく洗っている限り、同じ島の準備に適用できます。実験を繰り返し、アプリケーションの順序を変更することを確認します。
図 1。アッセイを示すスキームが開発します。NPY と結合した pH 感受性 GFP (pHluorin) をエンコードするアデノ ウイルス作り出され、マウスやヒトの膵島に感染するために使用します。感染後 4 〜 6 日小島に観察に配置され直立レーザー走査型共焦点顕微鏡の下で視覚化。NPY pHluorin 構造体は、β 細胞でインスリン顆粒で表されます。その蛍光成熟インスリン顆粒の酸性 pH で急冷が、顆粒の融合血しょう膜および 7.4 の中性細胞外 pH への曝露時に明るくなり。
図 2。NPY 融合構築はインスリン顆粒で表されます。(A)そのまま人間の小島の共焦点画像 GFP (緑) とインスリン (左パネル、赤)、immunostained、NPY pHluorin にソマトスタチン (中央、赤い) またはグルカゴン (右、赤) 感染しています。細胞核は、青 (DAPI ラベル) で示されます。スケール バー = 10 μ m. (B)いずれかのインスリン (Ins)、ソマトスタチン (相馬) またはグルカゴン (Glu) をも含む GFP 陽性細胞の割合の定量化。表示は平均 ± SEMs、n = 5 の島。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。NPY pHluorin は効果的な pH センサー 。(A) (上部パネル、3 G) の前に 3 mM グルコースを含む細胞外液 NPY pHluorin に感染したマウスの膵島の共焦点画像の最大投影と 50 mM NH4Cl (下段) の存在下で。スケールバー = 100 μ m。 (B) NH4Cl. 破線による全体の膵島の平均蛍光強度 (任意の単位) の変化を示すトレース NH4Cl アプリケーションを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。融合血しょう膜でオープン後、NPY pHluorin を含む顆粒は見えるようになります。NPY pHluorin アデノ ウイルスと人間の isletsinfected されたインキュベート細胞膜とエドを染めるディ-8-ANEPP (赤)。KCl (30 mM) を用いた膵島刺激トリガー (緑色で表示)、細胞表面に蛍光顆粒の突然で一時的な外観です。分泌応答前にヒトの膵島内のセルの共焦点画像が表示されます (t = 0) 中、(t = 3-9 s) と後 (t = 12 秒)。コントラストは背景の緑の蛍光性を削除する調整されました。スケール バー = 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。高グルコース トリガー NPY pHluorin 膜融合。(A)基底のグルコース濃度 (3 G ・ 3 mM グルコース、左右パネル) または高グルコース (血糖値 16 G 16 mM、右側のパネル)、NPY pHluorin に感染して、そのままヒトの膵島の共焦点画像の最大投影。細胞外のソリューションには、エージェントのフォルスコリンと IBMX (詳細についてはプロトコルを参照) を上げるキャンプが含まれています。スケール バー = 10 μ m. (B) ・ ロワの緑のチャネルの平均蛍光強度 (任意の単位) の変化を示す痕跡で囲む単一分泌イベント (赤・顆粒)、細胞 (緑) または細胞塊 (青)。高グルコースを適用した 5 分後 〜 3 G の 2.5 分。蛍光の値は、最初の蛍光値 (基準) に正規化されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6。分泌イベントは高血糖時に分泌の離散パルスを生成します。変化を示す痕跡は、16 mM グルコースと持続的な刺激の中にそのままヒトの膵島で別のセルの周囲に配置・ ロワで蛍光強度 (任意の単位) を意味します。各色は、個別のセルを表します。分泌活動の破烈をすることができます 3-4 分毎を見てこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7。NPY pHluorin 膜融合、インスリン分泌の刺激を知られているによってトリガーされます。Roi の平均蛍光強度 (任意の単位) で変化を示す痕跡で囲む KCl (30 mM)、ATP によるそのままの膵島内のセルに個別の分泌イベント (10 μ M)、高グルコース (16 G、16 mM) とアセチルコリン (Ach、10 μ M)。KCl と ATP は、基底のグルコース濃度 (3 mM) で適用されました。黒い線は平均顆粒を示し、灰色の線は、SEM の値を反映します。緑は、対応する細胞応答を表示します。時間軸スケール (2 分) は、すべてのグラフに適用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ビデオ 1。NPY pHluorin アデノ ウイルス効率的に感染するランゲルハンス島細胞および pH の変化を感知します。
マウス島は、4 日間 NPY pHluorin をエンコード アデノ ウイルスに感染していた。感染した島、上に配置、イメージングの商工会議所にマウントされています。細胞内 pH を高めるため小島灌流 50 mM NH4Cl 3 mM グルコースを含む細胞外のソリューションに追加します。NH4Cl アプリケーションに高速、強力な蛍光の増加を見ることができます。スケールバー = 100 μ m. ムービー速度 = 5 fps。映画の合計時間は、90 s.してくださいここをクリックしてビデオを見ることです。(右クリックしてダウンロード)
ビデオ 2。一度融合血しょう膜およびオープン NPY pHluorin を含む顆粒が見えるようになります。
人間 NPY pHluorin アデノ ウイルスに感染している培養細胞膜色素・ ディ ・-8-ANEPP と。KCl (30 mM) を用いた膵島刺激には、細胞表面に蛍光顆粒の突然かつ一時的な外観がトリガーされます。共焦点平面の最大投影が表示されます。コントラストは背景の緑の蛍光性を削除する調整されました。スケール バー = 20 μ m. ムービー速度 = 5 fps。映画の合計期間は、60 s.してくださいここをクリックしてビデオを見ることです。(右クリックしてダウンロード)
動画 3.高グルコース トリガーは NPY pHluorin を含む顆粒の開口放出。
NPY pHluorin 含む顆粒の融合は、高グルコース (16 mM) での刺激への応答でトリガーされます。基底細胞外グルコース濃度 (3 mM)、ほとんどの分泌活動が観察されません。しかし、高血糖の時にインスリン顆粒は一過性異なる同期的膵島細胞の原形質膜に表示します。高グルコースを行った後 〜 3 G の 2.5 分 (16 G のラベルに表示されます)。共焦点平面の最大投影が表示されます。スケール バー = 20 μ m. ムービー速度 10 fps を =。映画の総持続期間は 7 分このビデオを表示するのにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロード)
動画 4.長期にわたる高グルコース刺激は、エキソサイトーシスのいくつかのバーストをトリガーします。
長期にわたる高グルコース刺激分泌顆粒の一過性の表示中に小島の複数のパルスを生じさせる。分泌活動のパルスを見ることができるすべて 〜 ヒトの膵島の 3-4 分共焦点平面が表示されます。蛍光強度のフォルス カラー スキームが適用されました。スケール バー = 20 μ m. ムービー速度 30 fps を =。ムービーの総時間は 20 分このビデオを表示するのにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロード)
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Discussion
本稿では、共焦点顕微鏡による内そのままの膵島 β 細胞でインスリン顆粒の開口放出を視覚化するために使用できる手法について説明します。高いトランスフェクション効率を確保するためにアデノ ウイルス複製蛍光レポーターとして NPY pHluorin を使用します。
メソッドは私たちの手で非常に効率的なそれは主に 2 つのパラメーターに依存するいくつかの変更を必要があります: 1) 膵島の準備、および 2) 感染条件の最適化とウイルス株の価の品質。小島のウイルス感染、前に 37 ° C で一晩分離と輸送のストレスから回復する膵島準備を許可します。細胞膵島表面または低酸素細胞 (暗い) 膵島センター18の存在から突出など減少の可能性の兆候を感染/式期間とチェックで光学顕微鏡による膵島の形態を検査します。.各ウイルス株価と感染効率の異なる場合があります。ウイルス ウイルス力価や顕微鏡測定前に文化の時間に応じて使用量を調整することを確認します。最も重要なステップは、レポーターの十分な表現は、膵島の完全性と応答性が維持されるように感染条件 (例えば、ウイルス粒子の数、アッセイの前に、培養時間) の最適化です。感染プロトコルの最適化し新しいウイルスのバッチごとに、異なる時点でのいくつかの小島を収集し、KCl (30 mM) および/または高グルコース (16 mM) と開口放出が誘発されるかどうかを確認してください。わかった、アッセイは、良い作品し膵島細胞健康を維持し、グルコース応答時、慣性モーメント、低 (約 2) 培養時間は融合コンストラクトの表現のレベルを増加する (約 5 日) に拡張します。我々 の結果は、膵島機能19を維持しながら、アデノ ウイルスのベクトルの濃度株は遺伝子産物の効率的な表現より実現できることを示す先行研究の沿ったものです。
しかし、技術はいくつかの制限を持っています。1 つは、記者として NPY pHluorin を使用して、顆粒表示できない彼らは細胞膜と融合し、融合毛穴が開いた前にです。インスリン開口放出の代わりに顆粒が人身売買を勉強するには、アデノ ウイルス NPY eGFP をエンコードを代わりに使用できます。別の制限より低い程度、NPY pHluorin を対象にできますインスリン非含む顆粒です。ただし、NPY pHluorin に感染した細胞の大半はまたインシュリンと表現する細胞のグルカゴン、ソマトスタチンの 10% 未満を表明しました。確かに、顆粒の分泌、その拍動パターンとインスリンとの共局在のグルコース依存性インスリン顆粒から貨物リリースを表す最も分泌イベント示されます。インスリンの監視を保証するには、開口放出が発生している (例えば、高グルコース) インスリン分泌を刺激する条件の下で試験を行わなければなりません。それにもかかわらず、ベータ細胞発現の特異性を向上させるため、NPY pHluorin はラットのインスリン プロモーターなどより選択的プロモーターの制御下にでした。技術の別の制限は、外因性インスリン顆粒は、器官および/または動作20を混乱させることができる蛋白質の発現が必要とすることです。実験の結果を解釈するときに、これが見なす、他インスリン顆粒貨物蛋白質を使用して結論を検証する必要があります可能であれば、(例えば、C ペプチド、膵島アミロイドポリペプチド) レポーターとして。
このプロトコルでは、キャンプ調達エージェント (IBMX とフォルスコリン) インスリン開口分泌に及ぼす高グルコースを増強するなどもお勧めします。この刺激のプロトコルは、膵 β 細胞におけるキャンプを増やすことによってインスリン分泌を増強する (インクレチンや傍分泌神経シグナリング分子によってトリガー) の生理学的関連性の増幅経路の活性化を模倣します。それにもかかわらず、キャンプ調達エージェントがない場合は、高グルコース (16 mM) また顆粒の開口放出を引き出すが、観測された分泌のイベントの数が低い。平均細胞応答と同期している顆粒はまだ離散バーストに表示され、同じようなバースト期間を表示: 高グルコースだけで 1.5-10 分対高グルコース プラス IBMX/フォルスコリン 1.4 6.6 分。
ここで説明アッセイは、単一の融合イベントをそのまま島内の β 細胞でリアルタイムに視覚化する十分な空間的で、一時的な解像度があり、既存のメソッドに関して重要なです。例えば、どのインスリン顆粒、グルコース刺激によるヒト膵島でリリースされて高同期を明らかにしました。また、小島も接続している場合、coverslip、長時間 (少なくとも 15-20 分) はイメージできます。これは、膵島のエキソサイトーシスが拍動体内のインスリン分泌のものと同様の期間に表示される個別のバーストで発生表示する使用されました。アッセイもマウスやヒトの膵島を用いたインスリン開口放出にいくつかの刺激の効果をテストできます。さらに、他の方法のような膵島細胞解離は必要ない、ために、内、膵島 β 細胞集団の挙動を調べるに適用できます。確かに、我々 はのクラスターを隣接するベータ細胞に形成観察 〜 5-10 セルの活動を同期します。同じクラスターから β 細胞はおそらくコネキシン 3621のギャップ結合チャネルによって結合されています。彼らの応答を同期は、適切なインスリン分泌22に不可欠な β 細胞接続を示しています。
今後、この手法は、方法ゾル性細胞質カルシウムや膜電位の変化は例えば、ベータ細胞の顆粒放出と相関をリアルタイムで視覚化する機能イメージングのための他の蛍光染料と組み合わせることができます。特に、新しい pH 敏感な赤色蛍光タンパク質が利用できる14,23になっている、NPY または他インスリン顆粒貨物蛋白質に融合することができます機能イメージングのための緑の染料が使用できます。さらに、この手法は、マウス目24の房内に移植した血管柄付き島の生体内イメージング用マウス モデルと組み合わせることができます。小島はアデノ ウイルスに感染すること目に移植する前に 48 72 h。膵島を移植した場合、免疫欠損マウスを使用ください。このモデルを使用して、血管の手配25インスリン顆粒分泌の細胞レベル下の空間パターンを関連付けることができます。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があるを宣言します。
Acknowledgments
著者は、イメージング顕微鏡の助けを中核施設 DRI からマーシャ Boulina をありがとうございます。この作品は、NIH の助成金 1K01DK111757-01 (JA)、F31668418 (MM)、R01 DK111538、R33 ES025673、R56 DK084321 (AC) によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
References
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