Summary
Les auteurs décrivent un protocole pour la visualisation de l’exocytose de l’insuline dans les îlots intacts à l’aide de pHluorin, une protéine fluorescente verte sensibles au pH. Les îlots isolés sont infectées par l’adénovirus encodage pHluorin couplé à la vésicule fret neuropeptide Y. Cela permet la détection des événements de fusion granule insuline par microscopie confocale.
Abstract
La sécrétion de l’insuline joue un rôle central dans l’homéostasie du glucose dans des conditions physiologiques normales aussi bien que dans la maladie. Approches actuelles à étudier l’insuline granules cytotoxiques qu'utiliser électrophysiologie ou microscopie couplée à l’expression de reporters fluorescents. Cependant, la plupart de ces techniques ont été optimisée pour les lignées clonales ou besoin se dissociant des îlots pancréatiques. En revanche, la méthode présentée ici permet de visualisation en temps réel de l’insuline granules cytotoxiques dans les îlots pancréatiques intacts. Dans ce protocole, nous décrivons tout d’abord l’infection virale des îlots pancréatiques isolés par l’adénovirus qui encode une pH-sensibles à la protéine fluorescente verte (GFP), pHluorin, couplée au neuropeptide Y (NPY). En second lieu, nous décrivons le confocal imagerie des îlots cinq jours après une infection virale et comment contrôler la sécrétion d’insuline granule. Brièvement, les îlots infectés sont placés sur un lamelle couvre-objet sur une chambre d’imagerie et imagés sous un microscope confocal à balayage laser vertical tout en étant continuellement perfusés avec solution extracellulaire contenant divers stimuli. Images confocales couvrant 50 µm de l’îlot sont acquis en Time-lapse enregistrements à l’aide d’un scanner rapide résonant. La fusion de granules de l’insuline avec la membrane plasmique peut être suivie au fil du temps. Cette procédure permet de tester une batterie de stimuli dans une expérience simple également, est compatible avec les souris et les îlots humains et peut être combinée avec différentes teintures pour l’imagerie fonctionnelle (p. ex., colorants de calcium cytosolique ou potentiels de membrane).
Introduction
L’insuline est produite par les cellules bêta de l’îlot pancréatique et c’est un important régulateur du métabolisme de glucose1. La mort ou la dysfonction des cellules bêta perturbe l’homéostasie du glucose et mène au diabète2. L’insuline est emballé dans les granules denses-core qui sont libérés d’un Ca2 +-dépendante manière3. Élucider comment les granules cytotoxiques de l’insuline est régulée est essentiel pour bien comprendre ce qui détermine la sécrétion d’insuline et ouvre de nouvelles voies pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement du diabète.
Exocytose d’insuline a été étudiée en utilisant des approches électrophysiologiques, telles que les mesures de capacité membranaire et approches microscopiques en combinaison avec des molécules fluorescentes. Les mesures de capacité membrane ont bonne résolution temporelle et permettent des enregistrements de cellule unique. Cependant, des changements dans la capacité reflètent la variation nette de surface de la cellule et ne pas capturer les événements de fusion individuels ou distinguer fusion de granules de l’insuline d’autres vésicules de sécrétion non insulino-3. Les approches microscopiques, telles que la microscopie de fluorescence (FRBR) réflexion interne totale ou deux photons en combinaison avec des sondes fluorescentes et protéines de vésicule de cargo, fournissent des détails supplémentaires. Ces techniques de capture des événements exocytotique uniques et aussi les phases préalables- et post-exocytotique et peuvent être utilisés pour l’étude des tendances exocytotique dans les populations de cellules3.
Fluorescents reporters peuvent être de trois types : 1) extracellulaire, 2) cytoplasmique ou 3) vésiculaire. 1) extracellulaires reporters sont des traceurs polaires (par exemple, dextrans, la sulforhodamine B (SRB), lucifer jaune, pyranine) qui peuvent être introduits dans le milieu extracellulaire4. L’utilisation de traceurs polaires permet d’enquête sur le pore de fusion dans une population de cellules et capture des différentes structures intercellulaires tels que les vaisseaux sanguins. Toutefois, ils ne signalent pas sur le comportement de cargaison de vésicule. 2) cytoplasmiques reporters sont des sondes fluorescentes, couplés à des protéines associées aux membranes qui face le cytoplasme et sont impliqués dans la station d’accueil et d’exocytose. Les exemples incluent des membres de la famille de récepteurs (SNARE) en protéines soluble Nfacteur sensible - éthylmaléimide attachement qui ont été utilisées avec succès en neurosciences pour l’étude des neurotransmetteurs release5. Ces protéines ont des partenaires multiples et ne sont pas l’insuline-granule spécifique. 3) vésiculaires reporters sont des sondes fluorescentes fusionnés aux protéines cargo vésiculaire qui permettent pour l’étude du comportement de la vésicule de marchandises spécifiques. Protéines spécifiques fret insuline-granule comprennent, entre autres, l’insuline, peptide c, polypeptide amyloïde d’îlot et NPY6,7. NPY n’est présent que dans l’insuline contenant des granules et est publié conjointement avec l’insuline, ce qui en fait un excellent partenaire pour un journaliste fluorescent8.
La fusion de différentes protéines fluorescentes NPY a été précédemment employée pour étudier divers aspects de l’exocytose dans les cellules neuroendocrines, telles que l’exigence de la synaptotagmine spécifique isoformes9,10 et comment le temps de sortie dépend sur le cytosquelette d’actine et la myosine II11,12. Dans cette étude, nous avons choisi pHluorin comme le journaliste fluorescent, qui est une mis à jour le GFP qui est non fluorescent au pH acide à l’intérieur du noyau dense granules mais devient brillamment fluorescent lors de l’exposition au neutre pH extracellulaire13. Granulés à insuline matures ont un pH acide inférieures à 5,5. Une fois que le granule fusionne avec la membrane plasmique et ouvre, sa cargaison est exposée au neutre pH extracellulaire de 7.4, permettant l’utilisation de la pHluorin de protéines sensibles au pH comme reporter7,14.
Compte tenu du caractère sensible de pH de pHluorin et l’expression sélective de NPY dans les granules de l’insuline, la construction de fusion NPY-pHluorin peut être utilisée pour étudier les différentes propriétés des granules cytotoxiques de l’insuline. La livraison virale de la construction de fusion assure un rendement élevé de transfection et travaille sur des cellules primaires de bêta ou de lignées cellulaires ainsi que sur les îlots isolés. Cette méthode peut également être utilisée comme ligne directrice pour étudier l’exocytose dans tout autre type de cellule avec vésicules contenant NPY. Il peut aussi être combiné avec n’importe quel modèle de souris transgénique pour étudier les effets de certaines conditions (passes rabattues, la surexpression, etc.) sur l’exocytose. Cette technique a été précédemment utilisée pour caractériser les tendances spatiales et temporelles de l’insulinosécrétion granule dans les populations de cellules bêta dans les îlots humains15.
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Protocol
le Comité d’éthique animale de l’Université de Miami a approuvé toutes les expériences.
1. viral Infection d’Intact isolée humaine ou les îlots pancréatiques de souris
- culture de l’Islet : préparer les milieux de culture d’îlot : Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) 1066, 10 % (v/v) de SVF et 2 mM de L-Glutamine.
- Homme îlots pancréatiques sont obtenus à partir du programme intégré de Distribution îlot (NIDDK, NIH). À l’arrivée, transfert des îlots (~ 500 équivalents d’îlot) à 35 mm non-culture de tissus traités Pétri avec 2 mL de milieu de culture CMRL à 37 ° C, 5/95 % CO 2/o 2 pendant 24 h avant l’infection virale.
- Souris îlots pancréatiques peuvent être isolés suivant les protocoles établis précédemment 16. Suite à l’isolement, la culture ~ 200 équivalents d’îlot en 35 mm non-culture de tissus traitement Pétri avec 2 mL de milieu de culture CMRL à 37 ° C, 5/95 % CO 2/o 2 pendant 24 h avant l’infection virale.
Remarque : Évitez d’utiliser des souris transgéniques avec des journalistes GFP ou YFP exprimées sur des îlots pour éviter les chevauchements de fluorescence avec NPY-pHluorin.
- Préparation de virus
Remarque : la fusion de NPY-pHluorin a été clonée dans le vecteur de pcDNA3 10 et subcloned dans un vecteur adénoviral pour production adénoviraux [adénovirus sérotype 5 (DE1/E3)] par un adénovirus recombinant entreprise de fabrication. Le virus a été aliquotés et congelés à-80 ° C. Le stock viral est fourni par la compagnie aux concentrations de 10 12 à 10 particules virales 13 (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).- Pour in vitro infection de l’îlot, utilisation 10 6 UFP/mL, ce qui entraîne une multiplicité approximative d’infection (MOI) d’environ 2 (voir la Discussion pour plus de détails)
- Infection virale des îlots pancréatiques
ATTENTION : Travailler avec les adénovirus requiert de certification et des procédures de niveau de biosécurité 2 (BSL2). Vérifier avec l’agent de prévention des risques biotechnologiques institutionnels d’orientation et de formation sur les procédures BSL2.- Préparer humain/souris îlots comme décrit ci-dessus.
- Ajouter 5 à 10 µL de virus stock dans chaque 35 mm boîte de Pétri contenant des îlots de l’homme/souris dans 2 mL de milieu de culture CMRL (avec 10 % FBS et 2 mM de L-Glutamine).
Remarque : Régler le volume du virus utilisé après le titre viral tel que prévu par la feuille de données entreprise. - Culture des îlots en contenant le virus médias à 37 °C/5% CO 2 pendant 24 h.
- Après 24h, aspirer le support contenant le virus et les remplacer par 2 mL de milieu de culture CMRL (avec 10 % FBS et 2 mM de L-Glutamine).
- Culture des îlots pour les 4-6 jours à 37 °C/5% CO 2, remplaçant les médias tous les 3 jours.
- Après 4 - 6 jours de culture, attendre environ 30 % des cellules des îlots pancréatiques d’être infectés. Îlots peuvent ensuite être utilisés pour des expériences d’imagerie live.
2. Confocal Imaging d’infectés îlots
Remarque : se référer à la Table des matières pour les matériaux et l’équipement requis pour l’imagerie confocale.
- Réactif préparation et montage expérimental
- préparent la solution extracellulaire : ajoutez 125 mM NaCl, KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, 0,1 % de BSA, 5,9 mM pH 7,4, stérile filtré.
NOTE : Cette mémoire tampon est normalement préparé sans glucose et peut être stocké à 4 ° C pendant environ 1 mois. Le glucose est ajouté sur le jour de l’expérience pour atteindre la concentration finale souhaitée.- Préparer un milieu glucosé basal (3 mM) : Ajouter 75 µL de stock de glucose de 2 M à 50 mL de solution extracellulaire.
- Médium hyperglycémiques (16 mM) : ajouter 400 µL du stock de glucose de 2 M à 50 mL de solution extracellulaire
- Diluer tout stimulus supplémentaire (p. ex., KCl ou adénosine triphosphate (ATP)) en solution extracellulaire contenant du glucose de 3 mM.
- Avant de commencer une expérience, Prétraiter les lamelles couvre-objet avec poly-D-lysine en ajoutant 30 µL de solution de poly-D-Lysine (1 mg/mL) à la lamelle pendant 1 h et il rincer abondamment avec de l’H 2 O.
Remarque : Les lamelles de poly-lysine enduit peuvent être stockés à température ambiante jusqu'à 6 mois. - Au moins 1 h avant l’expérience, à l’aide d’une pipette de 1 mL, transférer les îlots à un 35 mm boîte de Pétri contenant une solution extracellulaire avec 3 mM de glucose. Garder les îlots à 37 ° C et 5 % de CO 2.
Remarque : Si nécessaire, la membrane plasmique peuvent être étiquetée dans cette étape. Pour étiqueter la membrane plasmique, ajoutez le colorant de di-8-ANEPP 2 µM à la solution extracellulaire avec 3 mM de glucose. Incuber les îlots en solution de colorant pendant 1 h à 37 °C/5% CO 2. La teinture de la membrane plasmique peut être excitée à 488 nm et détecté à 620 nm. - min avant de commencer une expérience, fixez la lamelle à la chambre d’imagerie de sceller avec de la graisse de silicone sous vide. Difficulté à la chambre d’imagerie à la plate-forme d’imagerie. À l’aide d’une pipette, placez 20-30 îlots sur la zone de poly-D-Lysine-traités de la lamelle couvre-objet et laissez les îlots adhèrent à la surface pendant 20 min.
Remarque : Il est important de ne pas laisser la lamelle sécher complètement pour éviter tout endommagement de l’îlot. - Tandis que les îlots sont adhérentes à la lamelle, préparer le système de perfusion en les rinçant abondamment avec de l’eau. Ajouter chaque solution sur un autre canal : 3 mM de glucose (canal 1), 16 mM de glucose (canal 2), 16 mM de glucose avec 100 µM 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) et 10 µM la forskoline (canal 3), 25 mM de KCl à 3 mM de glucose (canal 4), 10 µM ATP dans (glucose) 3 mM canal 5). Enlever toutes les bulles du système en ouvrant chaque canal séparément et en laissant l’écoulement de la solution pendant quelques minutes et s’assurer que l’écoulement est uniforme (0,5 mL/min) et le tuyau ne coule pas.
- Connecter le radiateur de solution en ligne unique pour le tuyau de sortie de perfusion et de régler la température du tampon sortant à 37 ° C.
- Préparer la pompe d’aspiration. Enlever toutes les bulles du système et s’assurer que l’écoulement est uniforme et la tuyauterie ne coule pas.
- Une fois que les îlots adhèrent à la surface de la lamelle couvre-objet, remplir doucement vers le haut de la chambre d’imagerie avec la solution extracellulaire contenant du glucose de 3 mM. Éviter de laver les îlots de la surface de la lamelle.
- Place de la plate-forme d’imagerie avec les îlots sur la platine du microscope et branchez-le sur le système de perfusion et la pompe d’aspiration.
- Tournant sur l’écoulement et constamment perfuse les îlots avec la solution extracellulaire de la 3G. Le système est maintenant prêt pour l’imagerie confocale.
- préparent la solution extracellulaire : ajoutez 125 mM NaCl, KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, 0,1 % de BSA, 5,9 mM pH 7,4, stérile filtré.
- Imagerie confocale
- localiser les îlots dans le champ du microscope avec un grossissement inférieur. Une fois porté sur les îlots, basculez sur objectifs de grossissement plus élevés (p. ex., objectif à immersion à l’eau X 63 (63 X / 0,9 NA)).
- Ouvrez l’acquisition à l’aide de logiciels (Table des matières) et activer le mode scanner résonnance.
- Sélectionner le mode d’imagerie XYZT et configurer les paramètres d’acquisition comme suit :
- tourner sur l’Argon laser et le laser à 488 nm ligne et ajuster la puissance du laser à 50 % pour l’excitation pHluorin.
- Recueillir des émissions à 505-555 nm.
- Choisir une résolution de 512 x 512 pixels. Appuyez sur la " Live " bouton pour démarrer l’imagerie et de régler les niveaux de gain (gain typique est environ 600 V).
- Définir le début et la fin de la pile-z : mettre l’accent sur le dessus de l’îlot et choisissez " begin " et passer au dernier plan qui peut se concentrer et choisissez " fin ". Utilisez une taille de z-étape de 5 µm. Le logiciel calculera automatiquement le nombre d’avions confocale.
- Définir l’intervalle de temps pour l’acquisition de chaque pile-z près de 1,5 à 2 s, puis choisissez l’option " acquérir jusqu'à l’arrêt " pour l’imagerie continu.
- Presse le " début " bouton pour initialize.
- Utiliser différents protocoles de stimulation pour induire des granules cytotoxiques en perfusant les îlots avec les stimuli désirées. Protocoles de stimulation peuvent être personnalisés pour s’adapter à l’objectif scientifique désiré (voir ci-dessous).
- Protocoles de stimulation
Remarque : dans chaque protocole de stimulation, commencer par l’enregistrement au moins 2 min d’activité de fond d’îlot durant la perfusion constante avec solution extracellulaire contenant du glucose de 3 mM. Perfuse avec un stimulant pour la période souhaitée. L’ordre de stimulants, de la durée de la stimulation, ainsi que la durée des enregistrements peuvent être personnalisés pour s’adapter à l’application scientifique désirée. Assurez-vous de laver les îlots avec solution extracellulaire contenant du glucose 3 mM avant de commencer une nouvelle stimulation. Dessous de trouver les protocoles de stimulation d’échantillon qui ont été utilisés pour montrer les capacités de la méthode.- Stimuler avec du chlorure d’ammonium (NH 4 Cl) comme témoin positif pour pHluorin pH sensibilité et l’efficacité de l’infection virale ( Figure 3) : 3 mM de glucose (2 min) → 50 mM NH 4 Cl (2 min) en glucose 3 mM → 3 mM de glucose (2 min)
Remarque : dans le NH 4 Cl solution, remplacer NaCl sur une base équimolaire. - Stimuler l’insuline granules cytotoxiques en augmentant la concentration en glucose ( Figure 5 et Figure 6) : 3 mM de glucose (2 min) → 16 mM de glucose (15-30 min) → 3 mM de glucose (2 min
Remarque : Afin de voir de nombreuses salves d’activité, perfuse les îlots en permanence avec la solution de 16 G pendant au moins 15 min.
NOTE : Afin d’accroître la cohérence des réponses sécrétrices 17, les utilisateurs peuvent ajouter de cAMP de sensibilisation des agents (100µm IBMX et 10 µM forskoline) aux solutions de la 3 G et 16 G. Cela ne modifie pas les patterns temporels de la sécrétion des granules. Pour détails, voir 15 et Discussion.
- Stimuler avec du chlorure d’ammonium (NH 4 Cl) comme témoin positif pour pHluorin pH sensibilité et l’efficacité de l’infection virale ( Figure 3) : 3 mM de glucose (2 min) → 50 mM NH 4 Cl (2 min) en glucose 3 mM → 3 mM de glucose (2 min)
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Representative Results
L’intégralité du workflow de la technique est illustré à la Figure 1. Brièvement, souris ou îlots humains peuvent être infectées par l’adénovirus encodage NPY-pHluorin et imagés, après quelques jours de culture, sous un microscope confocal. Comme granules fusionnent avec la membrane plasmique et ouverte, une augmentation de fluorescence est observée et peut être quantifiée (Figure 1). Pour déterminer si le NPY-pHluorin est en effet un outil approprié pour contrôler la dynamique de granule de l’insuline, les îlots infectés ont été immunomarquage avec des anticorps contre GFP et les hormones, l’insuline différents îlots, la somatostatine ou glucagon. La plupart des cellules exprimant le NPY-pHluorin (GFP positif) étaient des cellules bêta comme ils ont aussi exprimé l’insuline (~ 90 % ; Figure 2 a, 2 b). Seulement quelques séropositifs au glucagon des cellules alpha ou cellules somatostatin-positif delta ont été marqués au GFP (Figure 2 b). Ce qui est important, dans les cellules infectées, la fusion de NPY colocalisée avec insuline (coefficient de corrélation de Pearson de 0,61 ± 0,04 pour GFP et insuline contre 0,21 ± 0,05 pour GFP et le glucagon et 0,07 ± 0,01 pour GFP et la somatostatine).
Nous avons démontré que pHluorin est un capteur de pH efficace, en augmentant le pH intracellulaire avec 50 mM NH4Cl a donné lieu à une > augmentation de 500 % la fluorescence intracellulaire (Figure 3 a, 3 b, 1 vidéo). Lorsque le pH à l’intérieur de la granule augmente après la fusion avec la membrane plasmique et l’ouverture du pore de fusion, granules contenant NPY-pHluorin deviennent visibles lors des conditions qui stimulent l’exocytose de l’insuline comme la dépolarisation de la membrane avec KCl (Figure 4, video 2).
Événements sécrétoires uniques dans les cellules bêta dans les îlots intacts peuvent être visualisées avec l’imagerie confocale Time-lapse des îlots de NPY-pHluorin infecté. Elles se produisent en réponse à une dépolarisation de la membrane direct avec KCl ou plusieurs autres stimuli physiologiques (Figure 4 et Figure 7, voir ci-dessous). La concentration basale de glucose extracellulaire (3 mM), on observe peu d’activité sécrétoire. Cependant, la fusion de granules avec la membrane plasmique est déclenchée en réponse à une stimulation par l’hyperglycémie (16 mM) (Figure 5 a, vidéo 3). En plaçant la ROIs avec différentes tailles et dans différents domaines, la cinétique de la réaction des granules de sécrétion peut être comparée à celle des cellules individuelles ou des groupes de cellules à proximité (cluster) (Figure 5 b). Ce type d’analyse a permis portant que : 1) les épreuves individuelles de sécrétion sont très synchronisées et sécrétées en quelques secondes de la réponse cellulaire moyen et 2) les cellules bêta à proximité forment des grappes fonctionnelles de l’activité synchronisée.
La sécrétion d’insuline dans le corps se produit de façon pulsatile. Stimuler les îlots NPY-pHluorin-infected avec la concentration de glucose élevé pour des périodes prolongées (15-20 min) a donné lieu à plusieurs légumineuses (ou éclats) de sécrétion (Figure 6, vidéo 4). Lors de chaque impulsion, granules individuels fusionnent avec la membrane plasmique de façon synchronisée comme indiqué avant (Figure 5). Rafales de l’activité sécrétoire peuvent être vu toutes les 3-4 min.
Transitoire augmente en fluorescence dans NPY-pHluorin granules contenant pourraient également être observées en réponse à l’agoniste purinergiques ATP (10 µM) ou l’acétylcholine (ACh, 10 µM), un agoniste muscarinique (Figure 7), qui sont connus des stimulateurs de sécrétion d’insuline dans les îlots humains. Comme prévu, la dépolarisation de la membrane avec KCl (30 mM) a également déclenché l’insuline granules cytotoxiques (Figure 5). Plusieurs stimulus peuvent être appliqués à la préparation même des îlots aussi longtemps que les îlots sont lavées bien entre des stimuli. Assurez-vous de modifier l’ordre d’application quand on répète l’expérience.
Figure 1. Un schéma illustrant le test mis au point. Adénovirus qui encode un GFP sensibles au pH (pHluorin) couplé au NPY ont été produites et utilisées à infecter des souris ou des îlots pancréatiques humaines. Quatre à six jours après l’infection, les îlots ont été placés sur un lamelle couvre-objet et imagés sous un microscope confocal à balayage laser vertical. La construction de NPY-pHluorin s’exprime dans les granules de l’insuline dans les cellules bêta. La fluorescence est piégée au pH acide de granules matures de l’insuline mais devient lumineuse sur la fusion de granules avec la membrane plasmique et l’exposition au neutre pH extracellulaire de 7,4.
Figure 2. La Fusion de NPY construire s’exprime dans les Granules de l’insuline. (A) images confocales d’îlots humains intacts infecté par NPY-pHluorin, immunocolorées pour GFP (vert) et de l’insuline (panneau de gauche, rouge), la somatostatine (milieu, rouge) ou glucagon (droite, rouge). Noyaux cellulaires sont indiqués en bleu (DAPI étiqueté). Barreaux de l’échelle = 10 µm. (B) la Quantification de la fraction de cellules positives à GFP qui contiennent également de l’insuline (Ins), la somatostatine (Soma) ou glucagon (Glu). Sont indiqué la moyenne ± SEM, n = 5 îlots. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. NPY-pHluorin est un pH efficace capteur. Projection maximale (A) des images confocales d’un îlot de souris infectées par NPY-pHluorin en solution extracellulaire contenant du glucose 3 mM avant (panneau du haut, 3 G) et en présence de 50 mM NH4Cl (panneau inférieur). Echelle = 100 µm. B Trace montrant le changement dans l’intensité de la fluorescence moyenne (unités arbitraires) dans l’îlot entier induite par NH4CL Dashed line indique NH4Cl application. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Granules contenant NPY-pHluorin deviennent visibles une fois qu’ils fusionnent avec la Membrane plasmique et ouvert. Isletsinfected humaine par l’adénovirus NPY-pHluorin étaient incubatEd avec la membrane plasmique teindre di-8-ANEPP (rouge). Stimulation d’îlot avec KCl (30 mM) a déclenché une apparition soudaine et transitoire des granules fluorescents à la surface cellulaire (indiqué en vert). Images confocales de cellules au sein d’un îlot humain apparaissent à avant la réponse d’exocytotique (t = 0), pendant (t = 3-9 s) et après (t = 12 s). Le contraste était réglable pour supprimer la fluorescence de fond vert. Echelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5. Taux de glycémie élevé déclenche NPY-pHluorin Fusion avec la Membrane plasmique. (A) projection maximale des images confocales d’un îlot humain intact infecté par NPY-pHluorin la concentration basale de glucose (glycémie 3 G - 3 mM, panneau latéral gauche) ou à forte concentration de glucose (glycémie 16 G - 16 mM, panneau de droite). Extracellulaires solutions contenaient le cAMP élever la forskoline agents et IBMX (pour plus de détails, voir le protocole). Echelle = 10 µm. (B) Traces indiquant des changements dans les intensités de fluorescence moyenne (unités arbitraires) dans le canal vert en ROIs placé autour de simples événements sécrétoires (rouge, granules), cellules (verts) ou des agrégats cellulaires (bleu). Taux de glycémie élevé a été appliquée pendant 5 min après ~ 2,5 min en 3G. Valeurs de fluorescence ont été normalisées à la valeur initiale de fluorescence (de base). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6. Sécrétoires événements génèrent des impulsions discrètes de sécrétion sur hyperglycémie. Traces montrant les changements signifient intensité de fluorescence (unités arbitraires) dans ROIs placés autour des cellules différentes au sein d’un îlot humain intact pendant la stimulation soutenue avec le glucose de 16 mM. Chaque couleur représente une cellule individuelle. Période d’activité sécrétoire peut être vu chaque 3-4 min s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7. NPY-pHluorin Fusion avec la Membrane plasmique est déclenchée par connu stimulateurs de sécrétion d’insuline. Traces indiquant des changements dans l’intensité de la fluorescence moyenne (unités arbitraires) dans ROIs placés autour des épreuves individuelles de sécrétion dans les cellules à l’intérieur des îlots humains intacts induites par le KCl (30 mM), ATP (10 µM), hyperglycémie (16G, 16 mM) et l’acétylcholine (Ach, 10 µM). KCl et l’ATP ont été appliqués dans la concentration basale de glucose (3 mM). Lignes noires montrent le moyen des granules et lignes grises représentent les valeurs de SEM. Les traces vertes montrent la réponse de la cellule correspondante. Échelle de temps horizontale (2 min) s’applique à tous les graphes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1. NPY-pHluorin adénovirus efficacement infecter les cellules des îlots pancréatiques et les changements de pH de sens.
Îlots de souris ont été infectées pendant 4 jours par l’adénovirus encodage NPY-pHluorin. Îlots infectés ont été placés sur un lamelle couvre-objet et monté sur la chambre d’imagerie. Pour augmenter le pH intracellulaire, les îlots sont perfusés avec 50 mM NH4Cl ajouté à la solution extracellulaire contenant du glucose de 3 mM. Une augmentation rapide et forte fluorescence peut être vu sur NH4Cl application. Echelle = 100 µm. vitesse de film = 5 images/s. Durée totale du film est 90 s. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Vidéo 2. Granules contenant NPY-pHluorin deviennent visibles une fois qu’ils fusionnent avec la Membrane plasmique et ouvert.
Les îlots humaines infectées par l’adénovirus NPY-pHluorin ont été incubées avec la membrane plasmique colorant di-8-ANEPP. Stimulation d’îlot avec KCl (30 mM) a déclenché une apparition soudaine et transitoire des granules fluorescents à la surface cellulaire. Une projection maximale des plans confocaux est montrée. Le contraste était réglable pour supprimer la fluorescence de fond vert. Echelle = 20 µm. vitesse de film = 5 images/s. Durée totale du film est de 60 s. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Vidéo 3. Taux de glycémie élevé déclencheurs exocytose des Granules contenant NPY-pHluorin.
Fusion des granules contenant de NPY-pHluorin est déclenchée en réponse à une stimulation par l’hyperglycémie (16 mM). La concentration basale de glucose extracellulaire (3 mM), on observe peu d’activité sécrétoire. Toutefois, à forte concentration de glucose, granules d’insuline apparaissent transitoirement à la membrane plasmique des cellules différentes dans un îlot de façon synchronisée. Taux de glycémie élevé est appliqué après ~ 2,5 min en 3G (16G étiquette apparaît). Une projection maximale des plans confocaux est montrée. Echelle = 20 µm. vitesse de film = 10 images par seconde. Durée totale du film est de 7 min. s’il vous plaît cliquez ici pour visualiser cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Vidéo 4. Une Stimulation prolongée avec hyperglycémie déclenche plusieurs salves d’exocytose.
Une stimulation prolongée avec forte concentration de glucose donne lieu à plusieurs impulsions des îlots de sécrétion, au cours de laquelle les granules apparaissent transitoirement. Impulsions de l’activité sécrétoire peuvent considérer chaque ~ 3-4 min. Confocal avion d’un îlot humain apparaît. Un schéma Pseudo-couleur a été appliqué pour l’intensité de la fluorescence. Echelle = 20 µm. vitesse de film = 30 images/s. Durée totale du film est 20 min. s’il vous plaît cliquez ici pour visualiser cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
Cet article décrit une technique qui permet de visualiser l’exocytose des granules de l’insuline dans les cellules bêta dans les îlots pancréatiques intacts par microscopie confocale. Il utilise NPY-pHluorin comme le journaliste fluorescent cloné dans adénovirus pour assurer une efficacité de transfection élevé.
Bien que la méthode était très efficace dans nos mains, il pourrait avoir besoin de quelques modifications qui dépendent principalement de deux paramètres : 1) la qualité de la préparation de l’îlot et 2) le titre de stock virale avec l’optimisation des conditions de l’infection. Avant l’infection virale d’îlots, permettre la préparation de l’îlot de récupérer du stress d’isolement et de transport, pendant une nuit à 37 ° C. Inspecter la morphologie de l’îlot sous un microscope optique tout au long de la période d’infection/expression et vérifier les signes de viabilité réduite telles que les cellules qui dépassent de la surface de l’îlot ou la présence de cellules hypoxiques (cellules plus sombres) dans l’îlot Centre18 . Chaque action virale peut varier dans l’efficacité de titre et de l’infection. Veillez à régler le volume du virus utilisé après le titre viral et l’heure de la culture avant l’essai de la microscopie. L’étape la plus critique est l’optimisation des conditions infection (p. ex., nombre de particules virales, temps de culture avant le dosage) afin qu’assez de la journaliste s’exprime et l’intégrité de l’îlot et la réactivité sont maintenues. Lors de l’optimisation du protocole de l’infection et avec chaque nouveau lot virale, recueillir quelques îlots à différents moments et vérifier si l’exocytose peut être déclenché avec KCl (30 mM) et/ou d’hyperglycémie (16 mM). Nous avons trouvé que le test fonctionne mieux et cellules des îlots pancréatiques demeurent saines et glucose sensible lorsque le MOI est faible (environ 2) et le temps de culture est étendu (environ 5 jours) pour augmenter les niveaux d’expression de la construction de la fusion. Nos résultats correspondent à une précédente étude montrant qu’expression efficace de produits de gènes peut être mieux réalisée à des concentrations plus faibles de transfection du vecteur adénoviral tout en préservant l’îlot fonction19.
La technique a, toutefois, certaines limitations. L’une est que granules ne peut pas être visualisés en utilisant NPY-pHluorin comme un journaliste, avant qu’ils fusionnent avec la membrane plasmique et le pore de fusion s’ouvre. Afin d’étudier l’insuline granule traite au lieu de l’exocytose, adénovirus NPY-eGFP d’encodage peut être utilisé à la place. Une autre limitation est que, dans une plus faible mesure, NPY-pHluorin peut être ciblée vers les granules contenant non insulinodépendant. Cependant, la majorité des cellules qui ont été infectés avec NPY-pHluorin a également exprimé l’insuline et moins de 10 % du glucagon des cellules exprimés ou de la somatostatine. En effet, la dépendance de glucose de sécrétion des granules pour le modèle pulsatile et co-localisation avec l’insuline, a indiqué que plus de sécrétoires événements représentent fret mainlevée de granules d’insuline. Afin de garantir le suivi de l’insuline exocytose est naturelle, le test doit être réalisé dans des conditions qui stimulent la sécrétion d’insuline (par ex., hyperglycémie). Néanmoins, afin d’améliorer la spécificité d’expression de la cellule bêta, NPY-pHluorin pourrait être mis sous le contrôle d’un promoteur plus sélectif tels que le promoteur de l’insuline de rat. Une autre limite de la technique, c’est qu’il exige l’expression de protéines exogènes dans les granules de l’insuline, qui peuvent perturber leur biogenèse et/ou un comportement20. Ceci devrait être considéré lors de l’interprétation des résultats des expériences et, si possible, les conclusions doivent être validées à l’aide d’autres protéines de cargaison de granule de l’insuline (par exemple, C-peptide, polypeptide amyloïde d’îlot) comme journalistes.
Ce protocole recommande également y compris les agents de sensibilisation cAMP (IBMX et la forskoline) pour potentialiser les effets de l’hyperglycémie sur l’exocytose des granules d’insuline. Ce protocole de stimulation imite l’activation des physiologiquement pertinents voies amplification (provoqués par des incrétines ou paracrine et molécules de signalisation neuronales) qui potentialisent la sécrétion d’insuline en augmentant de cAMP dans les cellules bêta du pancréas. Néanmoins, en l’absence de cAMP de sensibilisation des agents, hyperglycémie (16 mM) suscite aussi des granules cytotoxiques, mais le nombre d’événements sécrétoires observé est plus faible. Granules apparaissent toujours en rafales discrètes, sont synchronisés avec la réponse moyenne des cellules et montrent des périodes similaires de rafale : 1.4-6,6 min en hyperglycémie plus IBMX/la forskoline vs 1,5-10 min à forte concentration de glucose seule.
L’essai décrit ici est significative en ce qui concerne les méthodes existantes comme il l’a suffisamment résolution spatiale et temporelle de visualiser les événements de fusion unique en temps réel dans les cellules bêta dans les îlots intacts. Par exemple, il a révélé la synchronisation haute avec laquelle l’insuline granules sont libérés dans les îlots humains lors de la stimulation de la glycémie. En outre, si les îlots sont bien attachés à la lamelle, ils peuvent être photographiées pendant de longues périodes (au moins 15-20 min). Cela permettait d’afficher que dans les îlots humains exocytose s’effectue en rafales distincts qui apparaissent dans des périodes semblables à celles de la sécrétion d’insuline pulsatile in vivo . Le test permet aussi de tester l’effet de plusieurs stimuli sur l’exocytose de l’insuline à l’aide des îlots murines ou humaines. De plus, car il ne nécessite pas de dissociation cellulaire îlot comme d’autres méthodes, il peut être appliqué pour étudier le comportement des populations de cellules bêta dans un îlot. En effet, nous avons observé que les cellules voisines beta forment des grappes de ~ 5 à 10 cellules dont l’activité est synchronisée. Les cellules bêta du même cluster sont probablement couplées par canaux de jonction gap de connexine 3621. Leur réaction synchronisée illustre la connectivité cellulaire bêta qui est indispensable à la sécrétion de l’insuline adéquate22.
À l’avenir, cette technique est cumulable avec les autres colorants fluorescents pour l’imagerie fonctionnelle pour visualiser en temps réel comment les changements de calcium cytosolique ou potentiel de membrane, par exemple, corrèlent avec granules cytotoxiques dans les cellules bêta. En particulier, comme les protéines fluorescentes sensibles à nouveau pH rouge deviennent disponibles14,23 et peuvent être fusionnés à NPY ou d’autres protéines de cargaison de granule de l’insuline, des colorants verts pour l’imagerie fonctionnelle peuvent être utilisés. Par ailleurs, cette technique peut être combinée avec un modèle de souris pour l’imagerie in vivo de vascularisé îlots transplantés dans la chambre antérieure de l' œil de souris24. Îlots peuvent être infectés par adénovirus 48-72 h avant la transplantation dans le œil. Les souris présentant une déficience immunitaires doivent être utilisées si des îlots humains sont transplantés. En utilisant ce modèle, la répartition spatiale subcellulaire de l’insulinosécrétion granule peut être corrélée avec dispositifs vasculaires25.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Marcia Boulina de la DRI laboratoire central de l’aide avec les microscopes d’imagerie. Ce travail a été soutenu par les NIH subventions 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), DK111538 R01, ES025673 R33 et R56 DK084321 (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
References
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
- Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
- Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
- Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
- Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478 (2011).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
- Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
- Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
- Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801 (2015).
- Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632 (2015).
- Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
- Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
- Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
- Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target? Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
- Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).
