Summary
Se describe un protocolo para la visualización de exocitosis de la insulina en los islotes intactos usando pHluorin, una proteína verde fluorescente sensible al pH. Islotes aislados están infectados con adenovirus codificación pHluorin acoplado al carga vesícula del neuropéptido Y. Esto permite la detección de eventos de fusión de gránulos de insulina mediante microscopía confocal.
Abstract
La secreción de insulina juega un papel central en la homeostasis de la glucosa bajo condiciones fisiológicas normales, así como en la enfermedad. Enfoques actuales para el estudio de exocitosis de gránulos de insulina utilice electrofisiología o microscopía juntada a la expresión de reporteros fluorescentes. Sin embargo la mayoría de estas técnicas se han optimizado para líneas celulares clonales o requiere disociar islotes pancreáticos. En contraste, el método presentado aquí permite la visualización en tiempo real de la exocitosis de gránulos de insulina en los islotes pancreáticos intactos. En este protocolo se describe primero la infección viral de los islotes pancreáticos aislados con adenovirus que codifica una pH-sensible a la proteína verde fluorescente (GFP), pHluorin, acoplada al neuropéptido Y (NPY). En segundo lugar, describimos el confocal de imágenes de islotes cinco días después de la infección viral y cómo controlar la secreción de gránulos de insulina. Brevemente, los islotes infectados se colocan sobre un cubreobjetos sobre una cámara de proyección de imagen y reflejados en un microscopio confocal vertical escaneo láser mientras que continuamente siendo perfundidos con solución extracelular que contiene varios estímulos. Se adquieren imágenes confocales, que abarca 50 μm del islote como grabaciones time-lapse utilizando un escáner rápido resonante. La fusión de gránulos de insulina con la membrana plasmática puede ser seguida en el tiempo. Este procedimiento también permite probar una batería de estímulos en un solo experimento es compatible con ratón e islotes humanos y puede ser combinado con diversos colorantes para proyección de imagen funcional (por ejemplo, tintes de calcio citosólico o potencial de membrana).
Introduction
Insulina es producida por las células beta del islote pancreático y es un regulador clave del metabolismo de glucosa1. Muerte o disfunción de las células beta perturba la homeostasis de la glucosa y conduce a la diabetes2. Insulina está lleno de gránulos de núcleo denso que se liberan en un Ca2 +-dependiente de la forma3. Dilucidar cómo se regulación la exocitosis de gránulos de insulina es esencial para comprender plenamente lo que determina la secreción de insulina y abre nuevas vías para la identificación de nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de la diabetes.
Exocitosis de insulina ha sido extensamente estudiada con métodos electrofisiológicos, como mediciones de capacitancia de la membrana y los enfoques microscópicos en combinación con moléculas fluorescentes. Mediciones de capacitancia de membrana tienen buena resolución temporal y permitan grabaciones unicelular. Sin embargo, cambios en la capacidad de reflejar el cambio neto de la superficie de la célula y capturar eventos de fusión individuales ni distinguir fusión de gránulos de insulina de otras vesículas secretoras de insulina no3. Enfoques microscópicos, tales como microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total o de dos fotones en combinación con sondas fluorescentes y vesícula carga proteínas, proporcionan detalles adicionales. Estas técnicas de capturan eventos exocitóticas simples y también las etapas pre- y post-exocitóticas y pueden ser utilizadas para estudiar los patrones exocitóticas en poblaciones de células3.
Reporteros fluorescentes pueden ser de tres tipos: 1) extracelular, 2) citoplasmática o 3) vesicular. 1) periodistas extracelulares son trazadores polar (por ejemplo, dextranos, sulforodamina B (SRB), lucifer amarillo, pyranine) que pueden ser introducidos a través del medio extracelular4. El uso de trazadores polar permite la investigación de la fusión del poro en una población de células y captura varias estructuras intercelulares como los vasos sanguíneos. Sin embargo, no informan sobre el comportamiento de carga de vesícula. 2) citoplasmáticas reporteros son sondas fluorescentes acopladas a las proteínas asociadas a membrana que cara el citoplasma y están involucradas en la exocitosis y acoplamiento. Ejemplos incluyen a los miembros de la soluble N- etilmaleimida sensible factor accesorio receptor (trampa) familia de proteínas que se han utilizado con éxito en Neurociencia para el estudio de la liberación de neurotransmisor5. Estas proteínas tienen múltiples socios de enlace y no son insulina-gránulo específico. 3) vesiculares reporteros son sondas fluorescentes fusionadas a proteínas de carga vesicular que permiten la investigación del comportamiento de la carga específica de vesícula. Las proteínas de carga específica de gránulos de insulina incluyen insulina, péptido c, polipéptido amiloideo del islote y NPY entre otros6,7. NPY sólo está presente en que contiene gránulos de insulina y se lanza conjuntamente con la insulina, lo que es un excelente socio para un reportero fluorescente8.
La fusión de diferentes proteínas fluorescentes a NPY ha sido empleada anteriormente para estudiar diversos aspectos de la exocitosis en las células neuroendocrinas, como el requisito del específico synaptotagmin isoformas9,10 y cómo curso del tiempo de lanzamiento depende en el citoesqueleto de actina y miosina II11,12. En este estudio, hemos elegido pHluorin como el reportero fluorescente, que es un GFP modificado que no fluorescente en el pH ácido dentro de núcleo denso gránulos pero se convierte en brillante fluorescente a la exposición al pH extracelular neutro13. Gránulos de insulina madura tienen un pH ácido por debajo de 5.5. Una vez que el gránulo se fusiona con la membrana plasmática y se abre, su carga está expuesta al neutral pH extracelular de 7.4, permitiendo el uso de la pHluorin de proteínas sensibles al pH como un reportero de7,14.
Debido a la naturaleza sensible de pH de pHluorin y la expresión selectiva de NPY en gránulos de insulina, puede utilizarse el concepto de fusión de NPY-pHluorin para el estudio de diversas propiedades de la exocitosis de gránulos de insulina. Viral la fusión construcción garantiza la eficacia de transfección alta y trabaja en primaria de las células beta o líneas celulares, así como en islotes aislados. Este método también puede utilizarse como una guía para el estudio de exocitosis en cualquier otro tipo de célula con las vesículas que contienen NPY. También se puede combinar con cualquier modelo de ratón transgénico para estudiar efectos de determinadas condiciones (caídas, sobreexpresión, etc.) en la exocitosis. Esta técnica se ha utilizado anteriormente para caracterizar patrones espaciales y temporales de la secreción de gránulos de insulina en poblaciones de células beta en islotes humanos15.
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Protocol
el Comité de ética animal de la Universidad de Miami ha aprobado todos los experimentos.
1. viral infección intacto aislados humanos o islotes pancreáticos de ratón
- cultura del islote: preparar los medios de cultivo de islotes pancreáticos: Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) 1066, 10% FBS (v/v) y 2 mM L-glutamina.
Islotes pancreáticos
- humanos se obtienen del programa integrado de distribución de islote (NIDDK, NIH). A su llegada, transferencia de los islotes (~ 500 equivalentes del islote) para 35 mm no-cultivo de tejidos tratados Petri con medios de cultivo CMRL de 2 mL a 37 ° C, 5% / 95% CO 2/o 2 durante 24 h antes de la infección viral.
- Ratón islotes pancreáticos pueden ser aislados siguiendo protocolos previamente establecidos 16. Tras aislamiento, de la cultura ~ 200 equivalentes de islote en 35 mm no-cultivo de tejidos trataron Petri con medios de cultivo CMRL de 2 mL a 37 ° C, 5% / 95% CO 2/o 2 durante 24 h antes de la infección viral.
Nota: Evite el uso de ratones transgénicos con GFP o YFP periodistas expresadas en islotes para evitar superposición de fluorescencia con NPY-pHluorin.
- Preparación de virus
Nota: la fusión de NPY-pHluorin fue clonada en el vector pcDNA3 del 10 y subcloned en un vector adenoviral para la producción de adenoviral [adenovirus serotipo 5 (DE1/E3)] por un adenovirus recombinante empresa de fabricación. El virus fue alícuotas y almacenados a-80 ° C. La acción viral es proporcionada por la compañía a concentraciones de 10 12 10 13 partículas virales (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).- Para la infección en vitro islote, uso 10 6 PFU/mL, dando como resultado una aproximado multiplicidad de infección (MOI) de alrededor de 2 (véase la discusión para más detalles)
- Infección viral de los islotes pancreáticos
Atención: Trabajar con adenovirus requiere certificación y procedimientos de bioseguridad nivel 2 (BSL2). Consulte con el oficial de seguridad de la biotecnología institucional de orientación y formación sobre procedimientos BSL2.- Preparar humanos/ratón islotes como se describe arriba.
- Añadir 5-10 μl de virus comunes a cada plato de Petri de 35 mm que contiene islotes de humano/ratón en 2 mL CMRL de medios de cultivo (con 10% FBS y 2 mM L-glutamina).
Nota: Ajuste el volumen del virus utilizado según el título viral proporcionado por la hoja de datos de la empresa. - Los islotes en que contiene el virus de la cultura media de 37 °C/5% CO 2 para 24 h.
- Después de 24 h, aspirar los medios de comunicación que contiene el virus y reemplazar con medios de cultivo 2 mL CMRL (con 10% FBS y 2 mM L-glutamina).
- De la cultura los islotes para 4-6 días a 37 °C/5% CO 2, reemplazando a los medios de comunicación cada 3 días.
- Después de 4 - 6 días de cultivo, espera alrededor 30% de células del islote infectado. Islotes de entonces pueden ser utilizados para experimentos de imagen vivo.
2. Confocal de imágenes de infectados islotes
Nota: Consulte la Tabla de materiales para los materiales y equipos necesarios para la proyección de imagen confocal.
- Reactivo de preparación y disposición experimental
- preparan la solución extracelular: Añadir 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, BSA 0,1%, pH 7,4, estéril filtrada.
Nota: Esta memoria intermedia se prepara normalmente sin glucosa y puede conservarse a 4 ° C hasta 1 mes. Se añade glucosa el día del experimento para alcanzar la concentración final deseada.- Medio de glucosa basal (3 mM) preparación: Añadir 75 μl del stock de glucosa de 2 M a 50 mL de la solución extracelular.
- Hyperglycemic (16 mM) medio: Añadir 400 μL de caldo de glucosa de 2 M a 50 mL de la solución extracelular
- Diluir cualquier estímulo adicional (p. ej., KCl o trifosfato de adenosina (ATP)) en la solución extracelular que contiene glucosa 3 mM.
- Antes de comenzar un experimento, use el cubreobjetos con poly-D-lisina por añadir 30 μl de solución de poly-D-lisina (1 mg/mL) al cubreobjetos para 1 h y aclarándolo bien con H 2 O.
Nota: El cubreobjetos recubierto de poli-lisina pueden almacenarse a temperatura ambiente hasta 6 meses. - Al menos 1 h antes del experimento, usando una pipeta de 1 mL, transferir los islotes a un plato de Petri de 35 mm que contiene la solución extracelular con 3 mM de glucosa. Mantener los islotes a 37 ° C y 5% CO 2.
Nota: Si es necesario, la membrana plasmática pueden ser etiquetada en este paso. Para la etiqueta de la membrana plasmática, añadir colorante de di-8-ANEPP de 2 μm a la solución extracelular con 3 mM de glucosa. Incubar los islotes en la solución colorante por 1 h a 37 °C/5% CO 2. El tinte de la membrana plasmática puede ser excitado a 488 nm y detectado a 620 nm. - minutos antes de comenzar un experimento, colocar el cubreobjetos a la cámara de proyección de imagen sellando con grasa de silicona vacío. Fijar la cámara a la plataforma de proyección de imagen de imagen. Mediante una pipeta, coloque 20-30 islotes en la zona de poly-D-lisina-tratado del cubreobjetos y dejar que los islotes se adhieren a la superficie durante 20 min
Nota: Es importante para que el cubreobjetos secar completamente para evitar el daño del islote no. - Mientras que los islotes están adhiriendo a lo cubreobjetos, preparar el sistema de perfusión, aclarándolo bien con agua. Añadir a cada solución a un canal diferente: 3 mM de glucosa (canal 1), 16 mM de glucosa (canal 2), 16 mM de glucosa con 100 μm 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) y la forskoline 10 μm (canal 3), 25 mM KCl en 3 mM de glucosa (canal 4), 10 μm ATP en 3 mM glucosa ( canal 5). Eliminar todas las burbujas del sistema, abrir cada canal por separado y permitiendo que el flujo de la solución durante unos minutos y asegúrese de que el flujo es constante (0.5 mL/min) y la tubería tiene fugas no.
- Conectar el calentador de línea única solución al tubo de salida de perfusión y ajustar la temperatura del búfer desbordado a 37 ° C.
- Preparar la bomba de succión. Eliminar todas las burbujas del sistema y asegúrese de que el flujo es constante y la tubería no tiene fugas.
- Una vez que los islotes se adhieren a la superficie del cubreobjetos, suavemente llenan la sala de proyección de imagen la solución extracelular que contiene 3 mM de glucosa. Evite lavar los islotes de la superficie del cubreobjetos.
- Colocar la plataforma de proyección de imagen con los islotes en la platina del microscopio y conectar al sistema de perfusión y la succión de la bomba.
- Vuelta en el flujo y constantemente inundar los islotes con la solución extracelular 3G. El sistema está ahora listo para la proyección de imagen confocal.
- preparan la solución extracelular: Añadir 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, BSA 0,1%, pH 7,4, estéril filtrada.
- Proyección de imagen confocal
- Localice los islotes en el campo del microscopio con la ampliación baja. Una vez centrado en los islotes, cambiar objetivos aumento mayor (por ejemplo, el objetivo de inmersión de agua X 63 (63 X / 0.9 NA)).
- Abrir la adquisición utilizando el software (Tabla de materiales) y activar el modo de escáner resonante.
- Seleccionar el modo imagen XYZT y configurar los parámetros de adquisición de la siguiente manera:
- gire sobre el argón láser y el láser de 488 nm línea y ajustar la potencia del láser al 50% para la excitación de la pHluorin.
- Recoger la emisión en el 505-555 nm.
- Elegir una resolución de 512 x 512 píxeles. Prensa el " Live " botón para iniciar la proyección de imagen y ajustar los niveles de ganancia (ganancia típica es alrededor de 600 V).
- Establecer el begin y end de la z-pila: centrarse en la parte superior de la isla y elija " empezar " y mover hasta el último plano que puede ser enfocado y elegir " final ". Utilice un tamaño de paso z de 5 μm. El software automáticamente calcula el número de aviones confocales.
- Establecer el intervalo de tiempo para la adquisición de cada pila de z cerca de 1.5-2 s y elegir la opción " adquirir hasta " para la proyección de imagen continua.
- Prensa del " Inicio " botón para initialize.
- Utilizar varios protocolos de estimulación para inducir la exocitosis de gránulos por perfundiendo los islotes con los estímulos deseados. Protocolos de estimulación pueden personalizarse para adaptarse a la finalidad científica deseada (véase abajo).
- Protocolos de estimulación
Nota: en cada protocolo de estimulación, empezar por grabar al menos 2 minutos de la actividad de fondo del islote durante perfusión constante con solución extracelular que contiene 3 mM de glucosa. Perfusión con un estimulante para el período de tiempo. La orden de estimulantes, duración del estímulo, así como duración de las grabaciones se pueden personalizar para adaptarse a los fines científicos deseados. Asegúrese de lavar a fondo con solución extracelular que contiene glucosa 3 mM antes de comenzar un nuevo estímulo islotes. A continuación ofrecemos los protocolos de estimulación de muestra que se han utilizado para demostrar las capacidades del método.- Estimular con cloruro de amonio (NH 4 Cl) como control positivo para la pHluorin pH sensibilidad y eficiencia de la infección viral ( figura 3): 3 mM de glucosa (2 min) → 50 mM NH 4 Cl (2 min) de 3 mM de glucosa → 3 mM de glucosa (2 min)
Nota: en el NH 4 Cl solución, sustituir NaCl en forma equimolar. - Estimular exocitosis de gránulos de insulina por aumento de la concentración de glucosa ( figura 5 y figura 6): glucosa (2 min) de 3 mM → 16 mM de glucosa (15-30 min) → 3 mM de glucosa (2 min
Nota: Para poder ver varias ráfagas de actividad, inundar los islotes continuamente con la solución de 16 G por lo menos 15 minutos
Nota: Para aumentar la consistencia de las respuestas secretoras 17, los usuarios pueden agregar a agentes de campo de sensibilización (IBMX de 100 μm y 10 μm forskoline) soluciones el 3 G y 16 G. Esto no cambia los patrones temporales de la secreción de gránulos. Para más detalles consulte el 15 y el debate.
- Estimular con cloruro de amonio (NH 4 Cl) como control positivo para la pHluorin pH sensibilidad y eficiencia de la infección viral ( figura 3): 3 mM de glucosa (2 min) → 50 mM NH 4 Cl (2 min) de 3 mM de glucosa → 3 mM de glucosa (2 min)
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Representative Results
El flujo de trabajo de la técnica se muestra en la figura 1. Brevemente, ratón o islotes humanos pueden ser infectados con adenovirus codificación NPY-pHluorin y reflejadas, después de pocos días en la cultura, bajo el microscopio confocal. Como gránulos se fusionan con la membrana plasmática y abierto, un aumento en fluorescencia se observa y se puede cuantificar (figura 1). Para determinar si NPY-pHluorin es una herramienta adecuada para controlar la dinámica de gránulos de insulina, islotes infectados immunostained con anticuerpos contra GFP y el islote diferentes hormonas insulina, somatostatina o glucagón. Mayoría de las células que expresan NPY-pHluorin (GFP positivas) fueron las células beta como también expresaron su insulina (~ 90%; Figura 2A, 2B). Sólo algunas células alfa glucagon-positivas o células delta somatostatina-positivo fueron etiquetados de GFP (figura 2B). Lo importante, en las células infectadas, la fusión de NPY colocalized con insulina (coeficiente de correlación de Pearson de 0,61 ± 0.04 para GFP e insulina vs 0.21 ± 0.05 para GFP y glucagón y 0,07 ± 0,01 para GFP y somatostatina).
Demostramos que pHluorin es un sensor de pH eficaz, como el aumento del pH intracelular con 50 mM NH4Cl dio lugar a un > 500% de incremento en la fluorescencia intracelular (Figura 3A, 3B, 1 Video). A medida que el pH dentro del gránulo aumenta en fusión con la membrana plasmática y la apertura del poro de fusión, gránulos que contienen NPY-pHluorin se hacen visibles las condiciones que estimulan la exocitosis de la insulina como la despolarización de la membrana con KCl (figura 4, video 2).
Solo eventos secretores en las células beta en islotes intactos se pueden visualizar con la proyección de imagen confocal de Time-lapse de islotes de NPY-pHluorin infectado. Estas ocurren en respuesta a la despolarización directa de la membrana con KCl o varios otros estímulos fisiológicos (figura 4 y figura 7, ver más abajo). En la concentración basal de glucosa extracelular (3 mM), se observa poca actividad secretora. Sin embargo, la fusión de gránulos con la membrana plasmática se activa en respuesta a la estimulación con glucosa alta (16 mM) (figura 5A, Video 3). Colocando el ROIs de diferentes tamaños y en diferentes áreas, la cinética de la respuesta de gránulos secretores puede compararse con la de las células individuales o grupos de células en proximidad cercana (cluster) (figura 5B). Este tipo de análisis permitidas determinar que: 1) los eventos secretores individuales son muy sincronizado y secretada dentro de algunos segundos de la respuesta de la célula media, y 2) las células beta en proximidad cercana forman grupos funcionales de la actividad sincronizada.
La secreción de insulina en el cuerpo se produce de manera pulsátil. Estimula los islotes NPY-pHluorin-infectados con la concentración de glucosa elevada por periodos prolongados (15-20 min) dieron lugar a múltiples pulsos (o explosiones) de secreción (figura 6, Video 4). Durante cada pulso, gránulos individuales se fusionan con la membrana del plasma de manera sincronizada como mostramos antes (figura 5). Ráfagas de actividad secretora pueden ser visto cada 3-4 minutos.
Transitoria incrementa en fluorescencia en NPY-pHluorin que contiene gránulos pudieran observarse también en respuesta a los agonistas purinérgicos ATP (10 μm) o el agonista muscarínico de acetilcolina (ACh, 10 μm) (figura 7), los cuales son conocidos estimuladores de secreción de insulina en los islotes humanos. Como era de esperar, la despolarización de la membrana con KCl (30 mM) también ha disparado exocitosis de gránulos de insulina (figura 5). Varios estímulos pueden aplicarse a la misma preparación del islote como los islotes se lavan bien entre estímulos. No se olvide de alterar el orden de aplicación al repetir el experimento.
Figura 1. Un esquema que ilustra el ensayo desarrollado. Adenovirus que codifica un GFP pH-sensible (pHluorin) junto a NPY se produce y utiliza para infectar a ratón o islotes pancreáticos humanos. Cuatro a seis días después de la infección, los islotes fueron colocados en un cubreobjetos y reflejados microscopio vertical-sistema de escaneo láser confocal. La construcción de NPY-pHluorin se expresa en los gránulos de insulina en las células beta. Su fluorescencia se apaga en el pH ácido de gránulos de insulina madura pero se convierte en brillante sobre la fusión de gránulos con la membrana plasmática y la exposición a la neutral pH extracelular de 7.4.
Figura 2. La construcción de la fusión de NPY se expresa en los gránulos insulina. (A) imágenes confocales de islotes humanos intactos infectan con NPY-pHluorin, immunostained para GFP (verde) e insulina (panel de la izquierda, rojo), somatostatina (medio rojo) o glucagón (derecha, red). Los núcleos celulares aparecen en azul (DAPI etiquetado). Barras de la escala = 10 μm. (B) cuantificación de la fracción de células GFP-positivas que también contienen insulina (Ins), somatostatina (Soma) o glucagón (Glu). Se muestra son la media ± SEM, n = 5 islotes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. NPY-pHluorin es un Sensor del pH efectivo. (A) máxima proyección de imágenes confocales de un islote de ratón infectado con NPY-pHluorin en la solución extracelular que contiene glucosa 3 mM antes (panel superior, 3 G) y en presencia de 50 mM NH4Cl (panel inferior). Barra de escala = 100 μm. (B) traza que muestra el cambio en la intensidad de fluorescencia media (unidades arbitrarias) en el islote todo inducido por NH4cl. Dashed line indica NH4Cl aplicación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Gránulos que contienen NPY-pHluorin se hacen visibles una vez que se fusionan con la membrana plasmática y abierto. Isletsinfected humana con NPY-pHluorin adenovirus fueron incubatEd con la membrana plasmática del tinte di-8-ANEPP (rojo). Estimulación de islotes con KCl (30 mM) desencadenó una aparición repentina y transitoria de gránulos fluorescentes en la superficie de la célula (mostrado en verde). Imágenes confocales de células dentro de un islote humano muestran antes la respuesta exocitóticas (t = 0), durante (t = 3-9 s) y después (t = 12 s). Contraste fue ajustado para eliminar la fluorescencia del fondo verde. Barra de escala = 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. NPY-pHluorin la fusión con la membrana plasmática desencadena la glucosa alta. (A) proyección máxima de imágenes confocales de un intacto islote humano infectado con NPY-pHluorin en la concentración de glucosa basal (3 G - 3 mM de glucosa, panel de la izquierda) o en alta glucosa (glucosa 16 G - 16 mM, panel de la derecha). Soluciones extracelulares contienen el campamento criar agentes forskoline y IBMX (ver protocolo para más detalles). Barra de escala = 10 μm. (B) que muestra cambios en la intensidad de fluorescencia media (unidades arbitrarias) en el canal verde en ROIs los rastros colocan alrededor de eventos secretoras simples (rojo, gránulo), células (verde) o racimos de célula (azul). Glucosa alta se aplicó durante 5 minutos después de ~ 2,5 min en 3G. Valores de fluorescencia se normalizaron en el valor de fluorescencia inicial (línea base). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Eventos secretores generan pulsos discretos de secreción con glucosa alta. Rastros que muestran cambios en media intensidad de fluorescencia (unidades arbitrarias) en ROIs colocados alrededor de las diferentes células en un islote humano intacto durante la estimulación sostenida con 16 mM de glucosa. Cada color representa una celda individual. Explosión de actividad secretora puede ser visto cada 3-4 minutos haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. NPY-pHluorin la fusión con la membrana plasmática se desencadena por conocidos estimuladores de la secreción de insulina. Rastros que muestran cambios en la intensidad de fluorescencia media (unidades arbitrarias) en ROIs colocaron alrededor de eventos secretores en las células en islotes humanos intactos inducidas por KCl (30 mM), ATP (10 μm), glucosa alta (16G, 16 mM) y la acetilcolina (Ach, 10 μm). KCl y ATP fueron aplicados en la concentración de glucosa basal (3 mM). Las líneas negras muestran el medio gránulo y líneas grises reflejan valores de SEM. Huellas verdes muestran la respuesta de la célula correspondiente. Escala de tiempo horizontal (2 min) se aplica a todos los gráficos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1. NPY-pHluorin Adenovirus eficientemente infectar las células del islote y sentido cambios en el pH.
Islotes de ratón fueron infectados durante 4 días con adenovirus codificación NPY-pHluorin. Islotes infectados se colocaron en un cubreobjetos y montados en la cámara de proyección de imagen. Para aumentar el pH intracelular, los islotes fueron perfundidos con 50 mM NH4Cl añadido a la solución extracelular que contiene 3 mM de glucosa. Un rápido y fuerte aumento de la fluorescencia puede verse a NH4Cl aplicación. Barra de escala = 100 μm. velocidad de película = 5 fps. Duración total de la película es 90 s. por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Video 2. Gránulos que contienen NPY-pHluorin se hacen visibles una vez que se fusionan con la membrana plasmática y abierto.
Islotes humanos infectados con adenovirus de NPY-pHluorin se incubaron con el tinte de membrana plasmática di-8-ANEPP. Estimulación de islotes con KCl (30 mM) desencadenó una aparición repentina y transitoria de gránulos fluorescentes en la superficie celular. Se muestra una proyección máxima de planos confocales. Contraste fue ajustado para eliminar la fluorescencia del fondo verde. Barra de escala = 20 μm. velocidad de película = 5 fps. Duración total de la película es 60 s. por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Video 3. Glucosa alta desencadena la exocitosis de gránulos que contienen NPY-pHluorin.
Fusión de gránulos que contienen NPY-pHluorin se activa en respuesta a la estimulación con glucosa alta (16 mM). En la concentración basal de glucosa extracelular (3 mM), se observa poca actividad secretora. Sin embargo, luego de glucosa alta, gránulos de insulina aparecen transitoriamente en la membrana plasmática de las diferentes células en un islote de manera sincronizada. Glucosa alta se aplicó después de ~ 2,5 min en 3G (16G aparece). Se muestra una proyección máxima de planos confocales. Barra de escala = 20 μm. velocidad de película = fps 10. Duración total de la película es por favor haga clic aquí para ver este video de 7 minutos. (Clic derecho para descargar)
Video 4. Prolongada estimulación con glucosa alta dispara varias ráfagas de exocitosis.
Prolongada estimulación con glucosa alta da lugar a múltiples pulsos de islotes de secreción, durante el cual los gránulos aparecen transitoriamente. Pulsos de actividad secretora se observan cada ~ se muestra plano Confocal de 3 a 4 minutos de un islote humano. Se aplicó un sistema de pseudocolor para intensidad de fluorescencia. Barra de escala = 20 μm. velocidad de la película = a 30 fps. Duración total de la película es por favor haga clic aquí para ver este video de 20 minutos. (Clic derecho para descargar)
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Discussion
Este manuscrito describe una técnica que puede utilizarse para visualizar la exocitosis de gránulos de insulina en las células beta en islotes pancreáticos intactos por microscopia confocal. Utiliza el NPY-pHluorin como el reportero fluorescente clonado en adenovirus para asegurar una eficacia de transfección alta.
Aunque el método era muy eficiente en nuestras manos, pueden requerir algunas modificaciones que dependen fundamentalmente de dos parámetros: 1) la calidad de la preparación del islote y 2) el título de la acción viral con la optimización de las condiciones de infección. Antes de la infección viral de los islotes, permiten la preparación de islote para recuperarse del estrés de aislamiento y transporte durante la noche a 37 ° C. Examine la morfología del islote bajo un microscopio de luz en todo el período de infección/expresión y comprobación de signos de viabilidad disminuida como células que sobresalen de la superficie del islote o la presencia de hipoxia (células más oscuras) en el islote centro18 . Cada acción viral puede variar en eficacia del título y de la infección. Asegúrese de ajustar el volumen del virus utilizado según el título viral y el tiempo de la cultura antes de lo análisis de microscopía. El paso más crítico es la optimización de las condiciones de infección (p. ej., número de partículas virales, tiempo de la cultura antes del ensayo) para que del reportero se expresa y se mantuvieran la integridad de islote y la capacidad de respuesta. Cuando optimizar el protocolo de infección y con cada nueva hornada viral, recoger unos islotes en diferentes puntos temporales y compruebe si la exocitosis pueden ser sacado con KCl (30 mM) o glucosa alta (16 mM). Se encontró que el ensayo funciona mejor y las células del islote siendo sanas y glucosa cuando el MOI es baja (aproximadamente 2) y el tiempo de la cultura se amplía (alrededor de 5 días) para aumentar los niveles de expresión de la construcción de la fusión. Nuestros resultados están en consonancia con un anterior estudio que muestra que expresión eficiente de productos del gene se puede lograr mejor en concentraciones más bajas de la transferencia del vector adenoviral conservando islote función19.
Sin embargo, la técnica tiene algunas limitaciones. Uno es que mediante el uso de pHluorin de NPY como reportero, los gránulos no se pueden visualizar antes de que se fusionan con la membrana plasmática y se abre el poro de fusión. Para estudiar trata de gránulos de insulina en lugar de exocitosis, adenovirus codificación eGFP NPY puede utilizarse en su lugar. Otra limitación es que, en menor medida, puede orientarse a los gránulos que contienen insulina no NPY-pHluorin. Sin embargo, la mayoría de las células que fueron infectadas con NPY-pHluorin manifestado su insulina y menos del 10% de las células expresadas glucagón o somatostatina. De hecho, la dependencia de la glucosa de la secreción de gránulos, su patrón pulsátil y co-localización con la insulina, indicó que eventos secretores más representan carga liberación de gránulos de insulina. Para garantizar el control de la insulina se produce exocitosis, el ensayo debe realizarse en condiciones que estimulan la secreción de insulina (p. ej., glucosa alta). Sin embargo, para mejorar la especificidad de la expresión de la célula beta, NPY-pHluorin se podría poner bajo el control de un promotor más selectivo como el promotor de la insulina de rata. Otra limitación de la técnica es que requiere la expresión de proteínas exógenas en gránulos de insulina, que pueden perturbar su biogénesis o comportamiento20. Esto debe considerarse al interpretar los resultados de los experimentos y, si es posible, las conclusiones deben validarse con otras proteínas de carga de gránulos de insulina (e.g., C-péptido, polipéptido amiloideo del islote) como reporteros.
Este protocolo también recomienda incluir agentes de campo de sensibilización (IBMX y Forskolina) para potenciar los efectos de la glucosa alta en la exocitosis de gránulos de insulina. Este protocolo de estimulación imita la activación de vías amplificadores fisiológicamente relevantes (accionada por incretinas o paracrina y moléculas de señalización neuronales) que potencian la secreción de insulina por aumento de cAMP en las células beta pancreáticas. Sin embargo, en ausencia de campo aumentar a agentes, glucosa alta (16 mM) también desencadena la exocitosis de gránulos pero el número de eventos secretorios observados es menor. Gránulos todavía aparecen en explosiones discretas, se sincronizan con la respuesta de la célula media y muestran similares períodos de explosión: 1.4-6.6 min glucosa alta más IBMX/forskoline vs 1.5-10 min en alta glucosa sola.
El ensayo descrito aquí es significativo con respecto a los métodos existentes ya que tiene suficiente resolución espacial y temporal para visualizar eventos de fusión única en tiempo real en las células beta en islotes intactos. Por ejemplo, reveló la gran sincronización con la que insulina gránulos son liberados en islotes humanos sobre el estímulo de glucosa. Además, si islotes se unen bien al cubreobjetos, puede ser reflejadas por períodos prolongados (al menos 15-20 min). Esto fue utilizada para demostrar que en islotes humanos exocitosis ocurre en explosiones distintas que aparecen en períodos similares a los de la secreción de insulina pulsátil en vivo . El análisis también permite probar el efecto de varios estímulos en la exocitosis de insulina utilizando islotes murinos y humanos. Además, porque no requiere la disociación de células de islote como otros métodos, se puede aplicar para estudiar el comportamiento de las poblaciones de la célula beta en un islote. De hecho, se observó que células beta vecinas forman racimos de ~ 5-10 células en el cual se sincroniza la actividad. Las células beta desde el mismo cluster se juntan probablemente por canales de ensambladura de gap de connexin 3621. Su respuesta sincronizada ilustra la conectividad de la célula beta es esencial para la secreción de insulina adecuada22.
En el futuro, esta técnica puede combinarse con otros tintes fluorescentes para funcional proyección de imagen para visualizar en tiempo real cómo cambios en el calcio citosólico o potencial de la membrana, por ejemplo, correlacionan con exocitosis de gránulos en las células beta. En particular, como proteínas fluorescentes rojo sensible de nuevo pH se están haciendo disponibles14,23 y se pueden fusionar para NPY u otras proteínas de carga de gránulos de insulina, pueden utilizarse colorantes verdes para proyección de imagen funcional. Además, esta técnica puede combinarse con un modelo de ratón para obtener imágenes en vivo de vascularizado islotes trasplantados en la cámara anterior del ojo ratón24. Islotes pueden ser infectados con adenovirus 48-72 h antes del trasplante en el ojo. Ratones deficientes inmunes deben utilizarse si se trasplantan los islotes humanos. Usando este modelo, el patrón espacial subcelular de la secreción de gránulos de insulina puede ser correlacionado con arreglos vascular25.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Marcia Boulina de DRI de instalaciones centrales para obtener ayuda con los microscopios. Este trabajo fue financiado por los NIH becas 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, ES025673 R33 y R56 DK084321 (CA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
References
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