Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für die Visualisierung von Insulin Exozytose in intakte Inseln mit pHluorin, eine pH-Sensitive grün fluoreszierendes Protein. Isolierte Inseln sind mit Adenoviren Codierung gekoppelt an die Vesikel Fracht Neuropeptid Y pHluorin infiziert. Dies ermöglicht für den Nachweis von Insulin Granulat Fusion Veranstaltungen konfokalen Mikroskopie.
Abstract
Insulin-Sekretion spielt eine zentrale Rolle in Glukose Homeostasis unter normalen physiologischen Bedingungen, wie bei Krankheit. Aktuelle Ansätze für Insulin Granulat Exozytose studieren entweder Elektrophysiologie oder Mikroskopie gekoppelt, um die Expression von fluoreszierenden Reporter verwenden. Aber die meisten dieser Techniken wurden optimiert für klonale Zelllinien oder erfordern abkoppelt pankreatische kleinen Inseln. Im Gegensatz dazu ermöglicht die hier vorgestellte Methode für Real-Time Visualisierung von Insulin Granulat Exozytose in intakten Pankreas Inseln. In diesem Protokoll beschreiben wir zunächst die Virusinfektion isolierte pankreatische Inselchen mit Adenoviren, die ein pH-Sensitive grünes fluoreszierendes Protein (GFP), pHluorin, gekoppelt an Neuropeptid Y (NPY) kodiert. Zweitens, beschreiben wir die konfokale imaging von Inselchen fünf Tage nach Virusinfektion und Granulat Insulinsekretion zu überwachen. Kurz, die infizierten Inselchen auf ein Deckglas auf einem bildgebenden Kammer gesetzt und abgebildet unter eine aufrechte Laserscanning-confocal Mikroskop während wird kontinuierlich mit extrazelluläre Lösung, enthält verschiedene Reize durchblutet. Konfokale Bilder über 50 µm der Insel sind als Zeitraffer-Aufnahmen mit einem schnell-Resonanz-Scanner erworben. Die Verschmelzung von Insulin Granulat mit der Plasmamembran kann im Laufe der Zeit verfolgt werden. Dieses Verfahren auch erlaubt die Prüfung einer Batterie von Reizen in einem einzigen Experiment ist kompatibel sowohl mit Maus als auch mit menschlichen Inselchen und ist kombinierbar mit verschiedenen Farbstoffen für funktionelle Bildgebung (z.B. Membran potenzielle oder zytosolischen Kalzium Farbstoffe).
Introduction
Insulin wird von den Betazellen der Bauchspeicheldrüse Insel produziert und es ist ein wichtiger Regulator der Glukose-Stoffwechsel-1. Tod oder Dysfunktion der Betazellen stört Glukose Homöostase und führt zu Diabetes2. Insulin wird in dichten Kern-Granulat, das in einem Ca2 +freigesetzt werden verpackt-abhängigen Weise3. Aufklärung, wie Insulin Granulat Exozytose reguliert wird ist wichtig zu verstehen, was bestimmt Insulinsekretion und eröffnet neue Wege für die Identifizierung der neue therapeutische Targets für die Behandlung von Diabetes.
Exozytose von Insulin wurde durch elektrophysiologische Ansätze wie Membran Kapazität Messungen und mikroskopische Ansätze in Verbindung mit fluoreszierenden Molekülen ausgiebig untersucht. Membran Kapazität Messungen haben gute zeitlichen Auflösung und einzelne Zelle Aufnahmen erlauben. Jedoch Änderungen in der Kapazität reflektieren die Oberfläche Nettoveränderung der Zelle und nicht einzelnen Fusion Ereignisse erfassen oder Insulin Granulat Fusion aus anderen Nichtinsulin sekretorischen Vesikel3zu unterscheiden. Mikroskopisch kleine Ansätze, wie ein zwei-Photonen oder vollständige interne Reflexion (TIRF) Fluoreszenzmikroskopie in Kombination mit fluoreszierenden Sonden und Vesikel Ladung Proteine, geben Sie weitere Details. Diese Techniken steht Einzelveranstaltungen und auch die Pre- und Post-steht Phasen zu erfassen und können für das Studium steht Muster in den Bevölkerungen der Zellen3verwendet werden.
Fluoreszierende Reporter kann von drei Arten: 1) extrazelluläre, 2) zytoplasmatischen oder (3) vesikuläre. (1) extrazelluläre Reporter sind polar Tracer (z.B. Dextrans, Sulforhodamine B (SRB), Luzifer gelb, Pyranine), die durch die extrazelluläre Milieu4eingeführt werden können. Die Verwendung von polar Tracer ermöglicht die Untersuchung der Fusion Pore in einer Bevölkerung der Zellen und nimmt verschiedene interzelluläre Strukturen wie Blutgefäße. Sie berichten jedoch nicht auf Vesikel Ladung Verhalten. (2) zytoplasmatischen Reporter sind fluoreszierende Sonden gekoppelt an Membran-assoziierte Proteine, die Gesicht Zytoplasma und Andocken und Exozytose beteiligt sind. Beispiele hierfür sind Mitglieder der löslichen N- Ethylmaleimide-Sensitive Faktor Anhaftung Rezeptor (SNARE) Proteinfamilie, die erfolgreich eingesetzt in den Neurowissenschaften für das Studium der Neurotransmitter-Freisetzung-5. Solche Proteine haben mehrere Bindungspartner und sind nicht Insulin-Granulat bestimmte. (3) vesikuläre Reporter sind fluoreszierende Sonden verschmolzen, vesikuläre Ladung Proteine, die für die Untersuchung von Fracht-spezifische Vesikel Verhalten ermöglichen. Insulin-Granulat spezifische Ladung Proteine sind Insulin, c-Peptid und Inselchen Amyloid Polypeptid NPY u.a.6,7. NPY ist nur in Insulin mit Granulat und ist zusammen mit Insulin, so dass es einen hervorragenden Partner für eine fluoreszierende Reporter8veröffentlicht.
Die Verschmelzung von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen zu NPY hat zuvor eingesetzt, um verschiedene Aspekte der Exozytose in neuroendokrinen Zellen, wie die Anforderungen der spezifischen Synaptotagmin Isoformen9,10 zu studieren und wie die zeitlicher Verlauf der Freigabe hängt von dem Aktin-Zytoskelett und Myosin II11,12. In dieser Studie wählten wir pHluorin als fluoreszierende Reporter, die eine veränderte GFP, die nicht fluoreszierenden ist bei den sauren pH-Wert im Inneren Rumpfkern Granulat wird aber hell fluoreszierende bei Kontakt mit der extrazellulären pH-neutral-13. Reife Insulin Granulat haben einen sauren pH-Wert unter 5,5. Sobald das Untermodul "mit der Plasmamembran und öffnet verschmilzt, ist die extrazelluläre Nullph von 7,4, erlaubt die Verwendung von pH-Sensitive Proteine pHluorin als Reporter7,14seine Ladung ausgesetzt.
Angesichts der Sensibilität der pH-Wert des pHluorin und die selektive Expression von NPY in Insulin-Granulat kann die NPY-pHluorin Fusion Konstrukt verwendet werden, verschiedene Eigenschaften von Insulin Granulat Exozytose zu studieren. Die virale Lieferung des Konstrukts Fusion sorgt für hohe Transfektion Effizienz und arbeitet an primären Betazellen oder Zell-Linien sowie auf isolierten Inseln. Diese Methode kann auch als Richtlinie verwendet werden, für das Studium in einer anderen Zelle Art mit NPY-haltige Vesikel Exozytose. Es kann auch mit einer transgenen Mausmodell Studie zu Auswirkungen von bestimmten Bedingungen (Niederschlägen, Überexpression, etc.) auf Exozytose kombiniert werden. Diese Technik wurde zuvor verwendet, um räumliche und zeitliche Muster der Insulinsekretion Granulat in Beta-Zell-Populationen in menschlicher Inselchen15zu charakterisieren.
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Protocol
der Tierethik Ausschuss von der University of Miami hat alle Experimente angenommen.
1. virale Infektion der intakten isolierten menschlichen oder Maus Pankreas Inselchen
- Insel-Kultur: bereiten Sie die kleine Insel Kulturmedien: Connaught medizinische Forschung Labors (CMRL) 1066, 10 % (V/V) FBS und 2 mM L-Glutamin.
- Menschlichen pankreatische kleinen Inseln werden von der integrierten Islet Vertriebsprogramm (NIDDK, NIH) erhalten. Nach der Ankunft transfer der Inseln (~ 500 Inselchen Äquivalente) auf 35 mm nicht-Zellkultur Petrischalen mit 2 mL CMRL Kulturmedien bei 37 ° C, 5/95 % CO 2/o 2 für 24 h vor der Virusinfektion behandelt.
- Maus Pankreas Inseln absperrbar nach vorher festgelegten Protokolle 16. Nach Isolierung, Kultur ~ 200 Inselchen Entsprechungen im Gewebe Kultur 35 mm Petrischalen mit 2 mL CMRL Kulturmedien bei 37 ° C, 5/95 % CO 2/o 2 für 24 h vor der Virusinfektion behandelt.
Hinweis: Vermeiden Sie die Verwendung transgener Mäuse mit GFP oder YFP Reportern äußerte auf kleinen Inseln zur Vermeidung von Überschneidungen der Fluoreszenz mit NPY-pHluorin.
- Virus Vorbereitung
Hinweis: die NPY-pHluorin Fusion wurde in die pcDNA3 Vector 10 kloniert und subcloned in einem adenoviralen Vektor für adenoviralen Produktion [Adenovirus Serotyp 5 (DE1/E3)] durch einen rekombinanten Adenovirus produzierendes Unternehmen. Das Virus wurde regelmÄÑig und bei-80 ° c gelagert Die virale Lager erfolgt durch das Unternehmen bei Titer von 10 12 10 13 Viruspartikel (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).- Für in-vitro- Inselchen Infektion, Einsatz 10 6 PFU/mL, was eine ungefähre Multiplizität der Infektion (MOI) von rund 2 (siehe Diskussion für Details)
- Virusinfektion des Pankreas Inselchen
Achtung: Arbeiten mit Adenoviren erfordert Biosafety Level 2 (BSL2) Verfahren und Zertifizierung. Überprüfen Sie mit dem institutionellen Biosafety Officer für Beratung und Schulung auf BSL2 Verfahren.- Mensch/Maus Inselchen vorbereiten, wie oben beschrieben.
- 5-10 µL Lager Virus hinzufügen jede 35 mm Petrischale mit Mensch/Maus Inselchen in 2 mL CMRL Nährmedien (mit 10 % FBS und 2 mM L-Glutamin).
Hinweis: Stellen Sie die Lautstärke des Virus nach der viralen Titer verwendet, wie es von der Firma Datenblatt. - Kultur der Inseln in Virus-haltigen Medien bei 37 °C/5% CO 2 für 24 Std.
- Nach 24 h, aspirieren Sie die Virus-haltigen Medien und ersetzen durch 2 mL CMRL Nährmedien (mit 10 % FBS und 2 mM L-Glutamin).
- Kultur der Inseln für 4-6 Tage bei 37 °C/5% CO 2, Austauschen der Medien alle 3 Tage.
- Nach 4 - 6 Tagen Kultivierung, erwarten rund 30 % der Inselzellen, angesteckt zu werden. Inselchen können dann für live-imaging-Experimente verwendet werden.
2. Confocal Imaging von infizierten Inselchen
Hinweis: beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für die Materialien und Ausrüstung für die konfokale Bildgebung erforderlich.
- Reagenz Vorbereitung und Versuchsaufbau
- bereiten extrazelluläre Lösung: Fügen Sie 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, 0,1 % BSA, pH 7,4, steril gefiltert.
Hinweis: Dieser Puffer wird normalerweise ohne Glukose vorbereitet und kann bis zu 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden. Glukose wird am Tag des Experiments zu erreichen die gewünschte Endkonzentration hinzugefügt.- Prepare basalen Glukose (3 mM) Medium: 50 mL extrazelluläre Lösung 75 µL 2 M Glukose Bestand hinzufügen.
- Hyperglycemic (16 mM) Medium: extrazelluläre Lösung 50 mL 400 µL 2 M Glukose Bestand hinzufügen
- Zusätzliche Anreize (z.B., KCl oder Adenosintriphosphat (ATP)) in extrazelluläre Lösung mit 3 mM Glukose verdünnen.
- Vor dem Start eines Experiments vorbehandeln Deckgläsern mit Poly-D-Lysin indem das Deckglas für 1 h 30 µL Poly-D-Lysin-Lösung (1 mg/mL) hinzufügen und gründlich spülen es mit H 2 O.
Hinweis: Die Poly-Lysin beschichtet Deckgläsern können bei Raumtemperatur bis zu 6 Monate gespeichert werden. - Mindestens 1 h vor dem Experiment, mit einer 1-mL-Pipette, übertragen die Inseln auf einer 35-mm-Petrischale, extrazelluläre Lösung mit 3 mM Glukose enthält. Halten Sie die kleinen Inseln auf 37 ° C und 5 % CO 2.
Hinweis: Bei Bedarf können die Plasmamembran in diesem Arbeitsschritt beschriftet werden. Fügen Sie 2 µM di-8-ANEPP Farbstoff um die Plasmamembran zu beschriften hinzu, die extrazelluläre Lösung mit 3 mM Glukose. Inkubieren Sie die Inseln in Farbstofflösung für 1 h bei 37 °C/5% CO 2. Der Plasmamembran Farbstoff kann begeistert sein, auf 488 nm und entdeckt bei 620 nm. - min vor dem Start ein Experiment, das Deckglas zuordnen der bildgebenden Kammer durch mit Vakuum Silikonfett abdichten. Die bildgebende Kammer zur imaging Plattform zu beheben. Mit einer Pipette legen Sie 20-30 Inselchen auf Poly-D-Lysin-behandelten Bereich das Deckglas und lassen die kleinen Inseln an der Oberfläche für 20 min. haften
Hinweis: Es ist wichtig, nicht das Deckglas zur Vermeidung von Beschädigungen der Insel vollständig trocknen lassen. - , Während die kleinen Inseln das Deckglas einhalten bereiten die Perfusion System durch gründlich mit Wasser spülen. Fügen Sie jede Lösung auf einen anderen Kanal: 3 mM Glukose (Kanal 1), 16 mM Glukose (Kanal 2), 16 mM Glukose mit 100 µM 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) und 10 µM Forskolin (Kanal 3), 25 mM KCl 3 mM Glukose (Kanal 4), 10 µM ATP in Glukose () 3 mM Kanal 5). Entfernen Sie alle Luftblasen aus dem System durch jeden Kanal separat öffnen und die Lösung fließen zu lassen, für ein paar Minuten, und stellen Sie sicher, dass die Strömung konsistent (0,5 mL/min) und der Schlauch ist nicht undicht.
- Verbinden die einzelnen Inline-Lösung Heizung der Perfusion Ablaufrohr ins freie ab und stellen Sie die Temperatur des Puffers abfließende auf 37 ° c
- Bereiten die Saugpumpe. Alle Luftblasen aus dem System entfernen, und stellen Sie sicher, dass die Strömung und der Schlauch ist nicht undicht.
- Sobald die Inseln an die Oberfläche Deckglas haften sanft Auffüllen der bildgebenden Kammer die extrazelluläre Lösung mit 3 mM Glukose. Zu vermeiden, waschen Sie die Inseln weg von der Oberfläche des Deckglases.
- Legen Sie die Image Plattform mit den Inseln auf den Mikroskoptisch und verbinden Sie es mit der Perfusion System und Saugpumpe.
- Wiederum auf den Fluss und ständig durchspülen der Inseln mit der 3G extrazelluläre Lösung. Das System ist nun bereit für die konfokale Bildgebung.
- bereiten extrazelluläre Lösung: Fügen Sie 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, 0,1 % BSA, pH 7,4, steril gefiltert.
- Confocal Imaging
- Suchen Sie die kleinen Inseln im Feld Mikroskop mit geringerer Vergrößerung. Nachdem auf den kleinen Inseln konzentriert, wechseln Sie zu höheren Vergrößerung Ziele (z.B., 63 X Wasser eintauchen Ziel (63 X / 0.9 NA)).
- Den Erwerb mit Software (Table of Materials) öffnen und die resonante Scanner-Modus zu aktivieren.
- Den XYZT-imaging-Modus wählen und konfigurieren Sie die Übernahme Einstellungen wie folgt:
- biegen Sie auf die Argon Laser 488 nm Laser Linie und passen Sie die Leistung des Lasers zu 50 % bei pHluorin Erregung.
- Sammeln Emission bei 505-555 nm.
- Wählen Sie eine Auflösung von 512 x 512 Pixel. Drücken Sie die " Live " Schaltfläche Starten Sie Imaging und passen den Gewinn (typische Gewinn beträgt rund 600 V).
- Set, Beginn und Ende der Z-Stapel: konzentrieren Sie sich auf der Spitze der Insel und wählen Sie " Begin " und wechseln zur letzten Ebene, die konzentriert werden, und wählen Sie " Ende ". Verwenden einer Z-Schrittweite von 5 µm. Die Software berechnet automatisch die Anzahl der konfokalen Flugzeuge.
- Legen Sie das Zeitintervall für den Erwerb von jedem Z-Stapel in der Nähe von 1,5-2 s und wählen Sie die Option " erwerben bis " für die kontinuierliche Bildgebung.
- Drücken Sie den " Start " Schaltfläche "ini"tialize.
- Verwenden verschiedene Protokolle Stimulation induzieren Granulat Exozytose Vorrichtung die Inseln mit den gewünschten reizen. Stimulation-Protokolle können angepasst werden die gewünschten wissenschaftlichen Zweck (siehe unten).
- Stimulation Protokolle
Hinweis: In jedem Protokoll Stimulation beginnen, durch die Aufnahme von mindestens 2 min Inselchen Hintergrundaktivität während konstante Perfusion mit extrazelluläre Lösung mit 3 mM Glukose. Durchspülen Sie mit ein Stimulans für den gewünschten Zeitraum. Die Reihenfolge der Stimulanzien, Dauer der Stimulation sowie Dauer der Aufnahmen kann der gewünschte wissenschaftliche Zwecke angepasst werden. Achten Sie auf Inseln mit extrazelluläre Lösung mit 3 mM Glukose vor Beginn einer neuen Stimulation gründlich waschen. Unten finden Sie die Probe-Stimulation-Protokolle, die verwendet wurden, um die Methode-Fähigkeiten unter Beweis.- Stimulieren mit Ammoniumchlorid (NH 4 Cl) als Positivkontrolle für pHluorin pH-Wert Empfindlichkeit und Virusinfektion Effizienz ( Abbildung 3): 3 mM Glukose (2 min) → 50 mM NH 4 Cl (2 min) in 3 mM Glukose → 3 mM Glukose (2 min)
Hinweis: im NH 4 Cl Lösung ersetzen NaCl äquimolaren Gesundheitsprüfungen. - Stimulieren Insulin Granulat Exozytose durch Erhöhung der Glukosekonzentration ( Abbildung 5 und Abbildung 6): 3 mM Glukose (2 min) → 16 mM Glukose (15-30 min) → 3 mM Glukose (2 min
Hinweis: Um mehrere Aktivitätsspitzen sehen, durchspülen der Inseln ständig mit 16 G Lösung für mindestens 15 min.
Hinweis: Um die Konsistenz der sekretorischen Antworten 17 zu erhöhen, können Benutzer Erhöhung der cAMP Agenten (100 µM IBMX und 10 µM Forskolin) die 3 G und 16 G Lösungen hinzufügen. Dies ändert nicht die zeitlichen Muster der Granulat-Sekretion. 15 und Diskussion siehe.
- Stimulieren mit Ammoniumchlorid (NH 4 Cl) als Positivkontrolle für pHluorin pH-Wert Empfindlichkeit und Virusinfektion Effizienz ( Abbildung 3): 3 mM Glukose (2 min) → 50 mM NH 4 Cl (2 min) in 3 mM Glukose → 3 mM Glukose (2 min)
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Representative Results
Der gesamte Workflow von der Technik ist in Abbildung 1dargestellt. Kurz, Maus oder menschliche Inseln können mit Adenoviren NPY-pHluorin-Codierung infiziert und abgebildet, nach paar Tagen in Kultur unter einem confocal Mikroskop. Als Granulat mit Plasmamembran und offenen Sicherung, eine Zunahme der Fluoreszenz wird beobachtet und quantifiziert werden kann (Abbildung 1). Um festzustellen, ob NPY-pHluorin in der Tat ein geeignetes Instrument zur Insulin-Granulat-Dynamik zu überwachen ist, wurden infizierte Inselchen Immunostained mit Antikörpern gegen GFP und der verschiedenen Inselchen Hormone Insulin, Somatostatin oder Glukagon. Die meisten Zellen mit dem Ausdruck NPY-pHluorin (GFP positiv) wurden Beta-Zellen, wie sie auch Insulin zum Ausdruck (~ 90 %; Abbildung 2A, 2 b). Nur wenige alpha Glukagon-positiven Zellen oder Zellen Somatostatin-positiven Delta waren mit der Bezeichnung der GFP (Abb. 2 b). Vor allem in infizierten Zellen, die NPY Fusion colocalized mit Insulin (Pearson Korrelationskoeffizient von 0,61 ± 0,04 für GLP und Insulin vs. 0,21 ± 0,05 für GLP und Glukagon und 0,07 ± 0,01 für GLP und Somatostatin).
Wir bewiesen, dass pHluorin ist eine effektive pH-Sensor wie die Erhöhung des intrazellulären pH mit 50 mM NH4Cl führte ein > 500 % Zunahme der intrazellulären Fluoreszenz (Abbildung 3A, 3 b, Video 1). Steigt der pH-Wert im Inneren das Untermodul "nach Fusion mit der Plasmamembran und die Öffnung der Fusion Pore sichtbar Granulat mit NPY-pHluorin Bedingungen, die stimulieren Insulin Exozytose wie Membran-Depolarisation mit KCl (Abbildung 4, Video 2).
Sekretorische Einzelveranstaltungen in Beta-Zellen in intakte Inseln können mit konfokale Zeitraffer Bildgebung von NPY-pHluorin infiziert Inselchen visualisiert werden. Diese treten als Reaktion auf direkte Membran-Depolarisation mit KCl oder mehrere andere physiologische Reize (Abbildung 4 und Abbildung 7, siehe unten). In den basalen extrazelluläre Glukosekonzentration (3 mM) ist wenig sekretorischen Aktivität beobachtet. Granulat-Fusion mit der Plasmamembran wird jedoch in Reaktion auf die Stimulation mit hohen Glukose (16 mM) (Abb. 5A, Video 3) ausgelöst. Durch die Platzierung der ROIs mit verschiedenen Größen und in unterschiedlichen Bereichen kann die Reaktionskinetik der sekretorischen Granulat mit der einzelnen Zellen oder Zellgruppen in unmittelbarer Nähe (Cluster) (Abb. 5 b) verglichen werden. Diese Art der Analyse aktiviert feststellend, dass: (1) die sekretorischen Einzelveranstaltungen sind sehr synchronisierte und abgesondert innerhalb weniger Sekunden aus der durchschnittliche Zelle Antwort, und (2) die Beta-Zellen in der Nähe funktionale Cluster der synchronisierte Aktivität bilden.
Insulin-Sekretion im Körper tritt in eine pulsierende Weise. Stimulierung der NPY-pHluorin-infizierten Inselchen mit erhöhten Glukosekonzentration für längere Zeit (15-20 min) Mehrfachimpulse oder platzt der Sekretion (Abbildung 6, Video 4) hervorbrachte. Bei jedem Impuls verschmelzen einzelne Granulat mit der Plasmamembran in eine synchronisierte Art und Weise wie vor (Abbildung 5) gezeigt. Platzt der sekretorischen Aktivität kann alle 3-4 Minuten zu sehen.
Transient erhöht die Fluoreszenz in NPY-pHluorin mit Granulat sich auch als Reaktion auf die Purinergic Agonist ATP zeichnete (10 µM) oder die Muskarin Agonist Acetylcholin (ACh, 10 µM) (Abbildung 7), beide von denen sind Stimulatoren der bekannt Insulin-Sekretion in menschlichen Inselchen. Wie erwartet ausgelöst die Membran-Depolarisation mit KCl (30 mM) auch Insulin Granulat Exozytose (Abbildung 5). Verschiedene Reize können auf die gleiche Insel Vorbereitung angewendet werden, solange die kleinen Inseln zwischen Reize gut gewaschen werden. Achten Sie darauf, die Reihenfolge der Anwendung ändern, wenn Sie das Experiment zu wiederholen.
Abbildung 1: Ein Schema zur Veranschaulichung der Assay entwickelt. Adenovirus, das einen pH-Sensitive GFP (pHluorin) gekoppelt an NPY kodiert wurden produziert und verwendet, um die Maus oder menschlichen pankreatischen kleinen Inseln zu infizieren. Vier bis sechs Tage nach der Infektion, wurden die kleinen Inseln auf einem Deckgläschen gelegt und abgebildet unter einem aufrecht konfokale Laserscanning-Mikroskop. Das Konstrukt NPY-pHluorin drückt sich in Insulin-Granulat in Beta-Zellen. Die Fluoreszenz wird bei den sauren pH-Wert von Reifen Insulin Granulat abgeschreckt aber wird hell auf Granulat Fusion mit der Plasmamembran und der Exposition gegenüber der extrazellulären neutralen pH-Wert von 7,4.
Abbildung 2: Die NPY Fusion konstruieren äußert sich in Insulin Granulat. (A) konfokale Bilder von intakten menschlichen Inselchen infiziert mit NPY-pHluorin, Immunostained für GFP (grün) und Insulin (linke Panel, rot), Somatostatin (rote Mitte) oder Glucagon (rechts, rot). Die Zellkerne sind blau (DAPI beschriftet) dargestellt. Skalieren von Balken = 10 µm. (B) Quantifizierung der Bruchteil der GFP-positiven Zellen, die Insulin (Ins), Somatostatin (Soma) oder Glucagon (Glu) enthalten. Dargestellt sind die mittlere ± SEMs, n = 5 Inseln. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. NPY-pHluorin ist eine effektive pH Sensor. (A) maximale Projektion der konfokalen Bilder von einer Maus-Insel mit NPY-pHluorin in extrazelluläre Lösung mit 3 mM Glukose vor (oberen Panel, 3 G) infiziert und in Anwesenheit von 50 mM NH4Cl (untere Leiste). Maßstabsleiste = 100 µm. (B) zeigt die Änderung im mittleren Fluoreszenzintensität (willkürliche Einheiten) in der ganzen Insel, induziert durch NH4CL gestrichelt Linie Spur zeigt NH4Cl Anwendung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Granulat mit NPY-pHluorin werden sichtbar, sobald sie mit der Plasmamembran und offene verschmelzen. Menschlichen Isletsinfected mit NPY-pHluorin Adenoviren wurden incubatEd mit der Plasmamembran färben di-8-ANEPP (rot). Insel-Stimulation mit KCl (30 mM) löste eine plötzliche und vorübergehende Erscheinung von fluoreszierenden Granulat an der Zelloberfläche (grün dargestellt). Konfokale Bilder von Zellen innerhalb einer menschlichen Insel vor der Antwort steht bei angezeigt werden (t = 0), während (t = 3-9 s) und nach (t = 12 s). Kontrast war angepasst, um grüne Hintergrundfluoreszenz zu entfernen. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5. Hoher Blutzucker löst NPY-pHluorin Fusion mit der Plasmamembran. (A) maximale Projektion der konfokalen Bilder von intakten menschlichen Insel infiziert mit NPY-pHluorin in basalen Glukosekonzentration (3 G - 3 mM Glukose, Panel links) oder hohe Glukose (16 G - 16 mM Glukose, rechts). Extrazelluläre Lösungen enthalten das cAMP Anhebung Agenten Forskolin und IBMX (Einzelheiten siehe Protokoll). Maßstabsleiste = 10 µm. (B) Spuren zeigt Änderungen in mittlere Fluoreszenz-Intensitäten (willkürliche Einheiten) in den Grün-Kanal in ROIs um sekretorischen Einzelbewerben (rot, Granulat), Zellen (grün) oder Zellcluster (blau) gelegt. Hoher Blutzucker galt für 5 min nach ~ 2,5 min in 3G. Fluoreszenz-Werte wurden auf den anfänglichen Fluoreszenz-Wert (Baseline) normalisiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6. Sekretorischen Ereignisse generieren diskrete Impulse der Sekretion bei hoher Glucose. Spuren zeigen Veränderungen in meine Fluoreszenzintensität (willkürliche Einheiten) in ROIs während der anhaltenden Stimulation mit 16 mM Glukose um verschiedene Zellen innerhalb einer intakten menschlichen Insel gelegt. Jede Farbe repräsentiert eine einzelne Zelle. Platzen der sekretorischen Aktivität kann alle 3-4 min. gesehen Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7. NPY-pHluorin Fusion mit der Plasmamembran wird ausgelöst durch bekannt Stimulatoren der Insulin-Sekretion. Änderungen im mittleren Fluoreszenzintensität (willkürliche Einheiten) in ROIs zeigen Spuren um sekretorischen Einzelveranstaltungen in Zellen im intakten menschlichen Inselchen induziert durch KCl (30 mM), ATP gelegt (10 µM), hohe Glukose (16G, 16 mM) und Acetylcholin (Ach, 10 µM). KCl und ATP wurden in den basalen Glukosekonzentration (3 mM) eingesetzt. Schwarze Linien zeigen die durchschnittliche Granulat und graue Linien SEM Werte widerspiegeln. Grüne Spuren zeigen die entsprechende Zelle Antwort. Horizontalen Zeitskala (2 min) gilt für alle Graphen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Video 1. NPY-pHluorin Adenovirus effizient infizieren Inselzellen und Sinn-pH-Änderungen.
Maus-Inseln waren für 4 Tage mit Adenoviren Codierung NPY-pHluorin infiziert. Infizierten Inselchen wurden auf einem Deckgläschen gelegt und auf die Bildgebung Kammer montiert. Um intrazelluläre pH-Wert zu erhöhen, wurden die Inseln mit 50 mM NH4Cl hinzugefügt, um die extrazelluläre Lösung mit 3 mM Glukose durchblutet. Eine schnelle und starke Zunahme der Fluoreszenz kann beim NH4Cl Anwendung gesehen werden. Maßstabsleiste = 100 µm. Film Geschwindigkeit = 5 Bilder pro Sekunde. Gesamtdauer des Films beträgt 90 S. bitte hier klicken, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Video 2. Granulat mit NPY-pHluorin werden sichtbar, sobald sie mit der Plasmamembran und offen verschmelzen.
Menschlichen Inselchen mit NPY-pHluorin Adenovirus infiziert wurden mit der Plasmamembran Farbstoff di-8-ANEPP inkubiert. Insel-Stimulation mit KCl (30 mM) löste eine plötzliche und vorübergehende Erscheinung von fluoreszierenden Granulat an der Zelloberfläche. Eine maximale Projektion der konfokalen Flugzeuge wird angezeigt. Kontrast war angepasst, um grüne Hintergrundfluoreszenz zu entfernen. Maßstabsleiste = 20 µm. Film Geschwindigkeit = 5 Bilder pro Sekunde. Gesamtdauer des Films beträgt 60 S. bitte hier klicken, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Video 3. Hoher Blutzucker Trigger Exozytose von Granulaten mit NPY-pHluorin.
Fusion von NPY-pHluorin mit Granulat wird in Reaktion auf die Stimulation mit hohen Glukose (16 mM) ausgelöst. Im basalen extrazelluläre Glukosekonzentration (3 mM) wird wenig sekretorischen Aktivität beobachtet. Jedoch auf hohe Glukose, Insulin Granulat vorübergehend an der Plasmamembran der verschiedenen Zellen in einer kleinen Insel in einer synchronisierten Weise angezeigt. Hoher Blutzucker galt nach ~ 2,5 min in 3G (16G Bezeichnung angezeigt wird). Eine maximale Projektion der konfokalen Flugzeuge wird angezeigt. Maßstabsleiste = 20 µm. Film Geschwindigkeit = 10 fps. Gesamtdauer des Films beträgt 7 min. Klicken Sie bitte hier um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Video 4. Längere Stimulation mit hohen Glukose löst mehrere Ausbrüche von Exozytose.
Längere Stimulation mit hohen Glukose führt zu Mehrfachimpulse Sekretion Inseln, während die Granulat vorübergehend angezeigt werden. Impulse der sekretorischen Aktivität können man jeden ~ 3-4 min. konfokale Flugzeug von einer menschlichen Insel gezeigt. Pseudofarben Regelung galt für Fluoreszenzintensität. Maßstabsleiste = 20 µm. Film Geschwindigkeit = 30 fps. Gesamtdauer des Films ist 20 min. Klicken Sie bitte hier um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
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Discussion
Dieses Manuskript beschreibt eine Technik, die Exozytose von Insulin-Granulat in Beta-Zellen in intakten pankreatischen kleinen Inseln zu visualisieren von konfokalen Mikroskopie verwendet werden kann. NPY-pHluorin verwendet als der fluoreszierenden Reporter in Adenovirus kloniert um eine hohe Transfektion Effizienz zu gewährleisten.
Obwohl die Methode höchst effizient in unseren Händen war, erfordert möglicherweise einige Änderungen, die in erster Linie von zwei Parametern abhängig sind: (1) die Qualität der Insel Vorbereitung und (2) der Titer von viralen Lager mit Optimierung der Infektionsbedingungen. Erlauben Sie vor der Virusinfektion der Inselchen die Inselchen Vorbereitung zur Wiederherstellung Isolierung und Transport Stress über Nacht bei 37 ° C. Überprüfen Sie die kleine Insel Morphologie unter einem Lichtmikroskop während der Infektion/Expressionszeit und Prüfung auf Anzeichen von verminderter Tragfähigkeit wie Zellen ragen aus der Insel Oberfläche oder Vorhandensein von hypoxische Zellen (dunkler) in der kleinen Insel Mitte18 . Jede virale Aktie variieren in Titer und Infektion Effizienz. Achten Sie darauf, um die Lautstärke des Virus nach der viralen Titer und die Zeit der Kultur vor der Mikroskopie-Assay verwendet. Die wichtigste Schritt ist die Optimierung der Infektionsbedingungen (z. B.Anzahl der Viruspartikel, Kulturzeit vor Assay), damit genug des Reporters drückt und die Inselchen Integrität und Reaktionsfähigkeit sind gewährleistet. Wenn die Infektion Protokoll zu optimieren und mit jeder neuen viralen Charge, sammeln ein paar Inselchen zu unterschiedlichen Zeitpunkten und prüfen ob Exozytose mit KCl (30 mM) und/oder hohe Glukose (16 mM) ausgelöst werden kann. Wir fanden, dass der Test besser funktioniert und Inselzellen gesund bleiben und Glukose reagieren, wenn die MOI niedrig (etwa 2) und die Kulturzeit ist (ca. 5 Tage) verlängert wird, um die Ausdruck des Fusion-Konstrukts zu erhöhen. Unsere Ergebnisse sind im Einklang mit einer früheren Studie zeigen, dass effiziente Ausdruck der Genprodukte besser bei niedrigeren transfecting Konzentrationen des adenoviralen Vektor erreicht werden kann, unter Beibehaltung der Insel Funktion19.
Die Technik hat jedoch einige Einschränkungen. Ist, dass mithilfe von NPY-pHluorin als Reporter, Granulat visualisiert werden können nicht, bevor sie mit der Plasmamembran verschmelzen und die Fusion-Pore öffnet. Um Insulin Granulat Menschenhandel statt Exozytose zu studieren, kann stattdessen Adenovirus NPY-eGFP-Codierung verwendet werden. Eine weitere Einschränkung ist, dass in geringerem Maße, NPY-pHluorin auf Nichtinsulin enthaltende Granulat ausgerichtet werden kann. Der Großteil der Zellen, die mit NPY-pHluorin infiziert waren äußerten jedoch auch Insulin und weniger als 10 % der Zellen ausgedrückt Glukagon oder Somatostatin. In der Tat, die Glukose-Abhängigkeit der Granulat-Sekretion, pulsierender Muster und Co Lokalisierung mit Insulin, darauf hingewiesen, dass die sekretorischen Ereignisse Fracht Freisetzung von Insulin Granulat darstellen. Zur Gewährleistung der Überwachung von Insulin Auftritt Exozytose, der Test unter Bedingungen durchgeführt werden sollte, die Insulin-Sekretion (z.B. hohe Glukose) zu stimulieren. Dennoch, um die Spezifität der Beta-Zellen Ausdruck zu verbessern, NPY-pHluorin unter der Kontrolle von selektiver Förderer wie die Ratte Insulin Promotor genommen werden konnte. Eine weitere Einschränkung der Technik ist, dass es Ausdruck der exogene Proteine in Insulin-Granulat, erfordert, die ihre Biogenese und/oder Verhalten20durcheinanderbringen können. Dies sollte berücksichtigt werden, bei der Interpretation der Ergebnisse der Experimente und, wenn möglich, sollten die Schlussfolgerungen validiert werden, mit anderen Insulin Granulat Ladung Proteine (z.B., C-Peptid, Inselchen Amyloid Polypeptid) als Reporter.
Dieses Protokoll empfiehlt außerdem, einschließlich der Erhöhung der cAMP Agenten (IBMX und Forskolin), die Wirkung der hohen Glukose auf Insulin Granulat Exozytose potenzieren. Diese Stimulation Protokoll imitiert die Aktivierung der physiologisch relevanten verstärkendes Bahnen (ausgelöst durch Inkretine oder parakrine und neuronale Signalmoleküle), die Insulin-Sekretion zu potenzieren, durch die Erhöhung von cAMP in der Beta-Zellen der Bauchspeicheldrüse. In Ermangelung des Lagers erhöhen Agenten, hohe Glukose (16 mM) entlockt auch Granulat Exozytose dennoch sinkt die Anzahl der sekretorischen Ereignisse beobachtet. Granulat erscheinen noch in diskreten platzt, werden synchronisiert mit der durchschnittlichen Zell-Antwort und zeigen ähnliche platzen Zeiträume: 1,4-6,6 min hohe Glukose plus IBMX/Forskolin vs. 1,5-10 min im hohen Glukose allein.
Der hier beschriebene Test ist in Bezug auf bestehende Methoden signifikante da es ausreichenden räumlichen und zeitlichen Auflösung, einzelne Fusion Ereignisse in Echtzeit in Beta-Zellen in intakten Inselchen zu visualisieren. Zum Beispiel hat es enthüllt die hohe Synchronisation mit dem, die Insulin Granulat in menschlichen Inselchen nach Glukose Stimulation freigesetzt werden. Darüber hinaus Wenn Inselchen das Deckglas gut befestigt sind, können sie über einen längeren Zeitraum (mindestens 15-20 min) abgebildet. Dieses wurde verwendet, zu zeigen, dass im menschlichen Inselchen Exozytose in unterschiedlichen Schüben auftritt, die in Perioden ähnlich denen von pulsierender in Vivo Insulinsekretion erscheinen. Der Test ermöglicht auch testen die Wirkung von mehreren Reizen auf Insulin Exozytose mit murinen oder menschlichen Inselchen. Darüber hinaus da Islet Cell Dissoziation wie andere Methoden nicht erforderlich ist, kann es zur Untersuchung des Verhaltens von Beta-Zell-Populationen innerhalb einer kleinen Insel angewendet werden. In der Tat, wir beobachteten, dass benachbarte Betazellen Cluster von bilden ~ 5-10 Zellen in der Aktivität synchronisiert. Beta-Zellen aus dem gleichen Cluster sind wahrscheinlich durch Gap Junction Kanäle von Connexin 3621gemacht gekoppelt. Ihre synchronisierten Reaktion veranschaulicht die Beta-Zellen-Konnektivität, die für richtige Insulin-Sekretion22unerlässlich.
Diese Technik ist in der Zukunft kombinierbar mit anderen Fluoreszenzfarbstoffen für funktionelle Bildgebung in Echtzeit visualisieren wie Änderungen der zytosolischen Kalzium oder Membrane Potential, zum Beispiel mit Granulat Exozytose in Betazellen korrelieren. Insbesondere, wie neue pH empfindlich, rot fluoreszierende Proteine verfügbar14,23 immer sind und NPY oder anderen Insulin Granulat Ladung Proteine abgesichert werden können, können grüne Farbstoffe für funktionelle Bildgebung verwendet werden. Darüber hinaus kann diese Technik mit einem Maus-Modell für die in-Vivo Bildgebung vaskularisierte Inseln verpflanzt in die Vorderkammer der Maus Auge24kombiniert werden. Inselchen mit Adenoviren infiziert werden können 48-72 h vor der Transplantation ins Auge. Immun mangelhaft Mäuse sollten verwendet werden, wenn menschliche Inselchen transplantiert werden. Mit diesem Modell kann die subzelluläre räumliche Muster der Insulinsekretion Granulat mit vaskulären Vereinbarungen25korreliert werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Marcia Boulina aus der DRI imaging-zentrale Einrichtung für die Hilfe mit den Mikroskopen. Diese Arbeit wurde von NIH Zuschüsse 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 und R56 DK084321 (AC) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
References
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