Summary
Biz pHluorin, pH-duyarlı yeşil flüoresan protein kullanarak bozulmamış adacıkları insülin ekzositozu görselleştirme için bir iletişim kuralı tanımlamak. İzole adacıkları adenovirus pHluorin vezikül kargo peptit Y birleştiğinde kodlama ile bulaşmış. Bu confocal mikroskobu tarafından insülin granül füzyon olayları algılama için sağlar.
Abstract
İnsülin salgılanması glikoz homeostazı normal şartlarda fizyolojik de olduğu gibi hastalığı merkezi bir rol oynar. İnsülin granül ekzositozu Elektrofizyoloji veya floresan gazetecilere ifade için birleştiğinde mikroskobu kullanın eğitim için geçerli yaklaşımlar. Ancak bu tekniklerin çoğu klonal hücre hatları için optimize edilmiş veya pankreas adacıkları dissociating gerektirir. Buna ek olarak, burada sunulan yöntemi insülin granül ekzositozu sağlam pankreas adacıkları içinde gerçek zamanlı görselleştirme olanak sağlar. Bu protokol için ilk viral enfeksiyon peptit Y (NPY) birleştiğinde bir pH duyarlı yeşil flüoresan protein (GFP), pHluorin, kodlar adenovirus ile izole pankreas adacıkları tarif. İkinci olarak, confocal adacıkları beş gün sonra viral enfeksiyon ve insülin granül sekresyonunu izlemek nasıl görüntüleme açıklar. Kısaca, virüslü adacıkları bir coverslip bir görüntüleme odası üzerinde yerleştirilir ve bir dik lazer tarama confocal mikroskop altında sürekli olarak çeşitli uyaranlara içeren hücre dışı çözüm ile periosteum süre görüntüsü. Confocal görüntüleri adacık 50 µm kapsayan bir hızlı rezonans tarayıcı kullanarak hızlandırılmış kayıtları elde edilir. İnsülin granülleri plazma zarı ile füzyon zaman içinde izlenebilir. Bu yordamı Ayrıca tek bir deneyde bir pil uyaranların test etmek için izin verir, fare ve insan adacıkları ile uyumludur ve fonksiyonel görüntüleme (örneğin, membran potansiyeli veya sitozolik kalsiyum boyalar) için çeşitli boyalari ile kombine edilebilir.
Introduction
İnsülin pankreas adacık beta hücreleri tarafından üretilen ve glukoz metabolizma1anahtar bir düzenleyicisidir. Ölüm ya da beta hücre fonksiyon bozukluğu glikoz homeostazı rahatsız ediyor ve diyabet2' ye götürür. İnsülin bir Ca2 +içinde yayımlanan çekirdek yoğun granüller içinde paketlenmiştir-bağımlı bir şekilde3. İnsülin granül ekzositozu nasıl düzenlenir elucidating tam olarak ne insülin salgılanması belirler ve diyabet tedavisi için yeni tedavi hedefleri tanımlaması için yeni yollar açar anlamak önemlidir.
İnsülin ekzositozu kapsamlı floresan molekülleri ile birlikte membran kapasitans ölçümleri ve mikroskobik yaklaşımlar gibi Elektrofizyolojik yaklaşımları kullanarak çalışılmıştır. Membran kapasitans ölçümleri iyi temporal çözünürlüğe sahip ve tek hücre kayıtları sağlar. Ancak, kapasite değişimler hücrenin net yüzey değişikliği yansıtmak ve bireysel füzyon olayları yakalamak veya insülin granül füzyon diğer sigara insülin salgı veziküller3ayırt. İki fotonlu veya toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi, floresan problar ve vezikül kargo proteinler, birlikte gibi mikroskobik yaklaşımlar ek ayrıntı sağlar. Bu teknikler tek exocytotic olayları ve ayrıca öncesi ve sonrası exocytotic aşamaları yakalamak ve nüfus hücreleri3exocytotic desen eğitimi için kullanılabilir.
Floresan gazetecilere üç tür olabilir: 1) hücre dışı, 2) sitoplazmik veya 3) veziküler. 1) hücre dışı gazetecilere ekstraselüler ortamın4ten kutup tarayıcıları (örneğin, dextrans, sulforhodamine B (SRB), lucifer sarı, pyranine) vardır. Polar verici kullanımı bir nüfus hücre füzyon gözenek incelenmesi için izin verir ve kan damarları gibi çeşitli hücreler arası yapıları yakalar. Ancak, vezikül kargo davranış bildirmez. 2) sitoplazmik gazetecilere floresan problar sitoplazma yüz ve rıhtım ve ekzositozu dahil membran ilişkili proteinler için birleştiğinde vardır. Örnekler nörotransmitter sürüm5çalışmak için nörolojik başarıyla kullanılan çözünür N- ethylmaleimide-duyarlı faktör ek protein reseptörü (tuzak) aile üyeleri. Bu proteinler birden çok bağlayıcı ortak ve insülin-granül değildir belirli. 3) veziküler gazetecilere floresan problar kargo özel vezikül davranış soruşturma için izin veziküler kargo proteinlere erimiş vardır. İnsülin-granül özel kargo proteinler insülin, c-peptid, adacık amiloid polipeptid ve NPY diğerleri arasında içerir6,7. NPY sadece insülin granülleri içeren mevcuttur ve insülin ile ortak yapım o bir floresan muhabir8için mükemmel bir partner yayımlanır.
Füzyon NPY için farklı floresan proteinlerin daha önce ekzositozu nöroendokrin hücrelerinde, belirli synaptotagmin izoformlarının9,10 şartı gibi çeşitli yönlerini incelemek için istihdam edilmiştir ve nasıl zaman-yayın tabii aktin sitoiskeleti üzerindeki ve myosin II11,12bağlıdır. Bu çalışmada, floresan olmayan değiştirilmiş bir GFP olan flüoresan muhabir pHluorin seçtik yoğun çekirdek içinde asidik pH granül ama olur maruz nötr ekstrasellüler pH13üzerine parlak floresan. Olgun insülin granülleri bir asidik pH 5.5 aşağıda var. Bir kez plazma zarı ve açar ile granül sigortalar, taşıdığı 7.4,7,14muhabir olarak pH duyarlı proteinler pHluorin kullanımına izin nötr ekstrasellüler pH için yararlanılır.
PHluorin pH hassas doğası ve insülin granülleri NPY seçici ifade içinde görüş-in NPY-pHluorin füzyon yapı insülin granül ekzositozu çeşitli özelliklerini incelemek için kullanılabilir. Füzyon yapı viral teslim yüksek transfection verimlilik sağlar ve birincil beta hücreleri veya hücre hatları yanı sıra izole adacıkları üzerinde çalışır. Bu yöntem, bir kılavuz olarak ekzositozu hücreye herhangi bir diğer NPY içeren veziküller ile çalışmak için de kullanılabilir. Ayrıca ekzositozu üzerinde belirli koşullar (nakavtlar, overexpression, vb) etkilerini incelemek için herhangi bir transgenik fare modeli ile birleştirilebilir. Bu teknik daha önce insülin granül sekresyonunu beta hücre popülasyonlarının insan adacıkları15içinde kayma ve temporal desenlerini tanımlamak için kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
University of Miami hayvan Etik Komitesi tüm deneylerin onayladı.
1. viral enfeksiyon, bozulmamış izole insan veya fare pankreas adacıkları
- adacık kültür: adacık kültür ortamı hazırlamak: Connaught tıbbi araştırma laboratuvarları (CMRL) 1066, % 10 (v/v) FBS ve 2 mM L-glutamin.
- İnsan pankreas adacıkları entegre adacık dağıtım programından (NIDDK, NIH) elde edilir. Elimize adacıkları transfer (~ 500 adacık eşdeğerleri) için 35-mm sigara doku kültürü Petri yemekler ile 2 mL CMRL kültür medya 37 ° c, % %5/95 CO 2 /O 2 24 saat önce viral enfeksiyon için tedavi.
- Fare pankreas adacıkları daha önce kurulan protokolleri 16 aşağıdaki ayrılmış olabilir. Yalıtım, kültür ~ 200 adacık eşdeğerleri olarak 35-mm sigara doku kültürü Petri yemekler ile 2 mL CMRL kültür medya 37 ° c, % %5/95 CO 2 /O 2 24 saat önce viral enfeksiyon için tedavi.
Not: transgenik fareler adacıkları üzerinde ifade GFP veya YFP muhabirlerle NPY-pHluorin floresan çakışma önlemek için kullanmaktan kaçının.
- Virüs hazırlık
Not: NPY-pHluorin fusion pcDNA3 vektör 10 kopyalanmış ve adenoviral üretimi için adenoviral bir vektör içine subcloned [adenovirus serotip 5 (DE1/E3)] rekombinant adenovirus tarafından üretim şirketi. Virüs bölünmemeli ve-80 ° C'de saklı Viral stok titreleri 10 şirketi tarafından sağlanan 12-10 13 viral parçacıkların (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).- In vitro adacık enfeksiyon, kullanın 10 6 PFU/mL, kaynaklanan enfeksiyon (MOI) yaklaşık bir çeşitlilik içinde yaklaşık 2 (bkz: tartışma Ayrıntılar için) için
- Pankreas adacıkları viral enfeksiyon
Dikkat: Seviye 2 (BSL2) yordamlar ve sertifika adenovirüse bakın ile çalışma gerektirir. Kurumsal Biyogüvenlik memur rehberlik ve eğitim BSL2 prosedürler ile kontrol edin.- İnsan/fare adacıkları yukarıda açıklandığı şekilde hazırlayın.
- 2 ml (%10 FBS ve 2 mM L-glutamin ile) CMRL kültür ortamının insan/fare adacıkları içeren her 35-mm Petri kabına için 5-10 µL hisse senedi şunun ekleyin.
Not: şirket veri sayfası tarafından sağlanan viral titresi göre kullanılan virüs seviyesini ayarlamak. - Kültür adacıkları, virüs içeren medya 37 °C/5% CO 2 24 h için
- 24 saat sonra virüs içeren medya Aspire edin ve 2 mL CMRL kültür medya (%10 FBS ve 2 mM L-glutamin ile) yerine.
- Medya 3 günde yerine 37 °C/5% CO 2, 4-6 gün için adacıkları kültür.
- Sonra 4 - kültür, 6 gün civarında adacık hücreleri bulaşması için % 30'u bekliyoruz. Adacıkları-ebilmek o zaman var olmak kullanılmış canlı görüntüleme deneyler için.
2. Confocal görüntüleme, enfekte adacıkları
Not: Malzemeler tablo confocal görüntüleme için gerekli ekipman ve malzemeler için başvurmak.
- Reaktif hazırlık ve deneysel kurulum
- hazırlamak ekstraselüler çözüm: 125 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 2.56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, % 0,1 BSA, eklemek filtre pH 7.4, steril.
Not: Bu tampon normal glikoz hazırlanır ve 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanabilir. Glikoz istenen son toplama ulaşmak için deneme günü eklenir.- Hazırla Bazal glikoz (3 mM) orta: hücre dışı çözüm için 50 mL 2 M glikoz stokunun 75 µL ekleyin.
- Hyperglycemic (16 mM) orta: hücre dışı çözüm için 50 mL 2 M glikoz stokunun 400 µL ekleyin
- Herhangi bir ek uyarıcı (örneğin, KCl veya adenozin trifosfat (ATP)) 3 mM glikoz içeren hücre dışı çözümde sulandırmak.
- Bir deney başlamadan önce Poli-D-lizin çözüm (1 mg/mL) 30 µL için 1 h için coverslip ekleyip iyice H 2 ile O. durulama Poli-D-lisin ile coverslips pretreat
Not: Poli-lizin kaplı coverslips 6 aya kadar oda sıcaklığında saklanabilir. - En az 1 saat önce 1 mL pipet kullanarak deney, adacıkları ile 3 mM glikoz hücre dışı solüsyon içeren 35-mm Petri kabına aktarın. Adacıkları 37 ° C ve % 5 CO 2 ' de devam.
Not: gerekirse, bu adımda plazma zarı etiketli. Plazma zarı etiketlemek için 2 µM di-8-ANEPP boya ile 3 mM glikoz hücre dışı çözüm ekleyin. 37 °C/5% CO 2 1 h için boya çözümde adacıkları kuluçkaya. Plazma zarı boya 488 heyecanlı nm ve 620 nm.
bir deney başlamadan önce - min vakum silikon gres ile sızdırmazlık tarafından coverslip görüntüleme odasına iliştirin. Görüntüleme platformu görüntüleme odasına düzeltmek. Bir pipet kullanarak adacıkları uygun 20 dakika süreyle yüzeye coverslip ve poli-D-lizin-tedavi alan üzerinde 20-30 adacıklar yer
Not: Kurumasını adacık zarar görmemesi için coverslip izin önemlidir.
Adacıkları coverslip için uygun iken - iyice su ile durulama tarafından perfüzyon sistemi hazırlamak. Her çözüm için başka bir kanal eklemek: 3 mM glikoz (Kanal 1), 16 mM glikoz (2 kanal), 100 µM 3-İzobütil-1-methylxanthine (IBMX) ve 10 µM forskolin (Kanal 3), 25 mM KCl 3 mM glikoz (Kanal 4), 3 mM glikoz (10 µM ATP ile 16 mM glukoz Kanal 5). Tüm kabarcıklar her kanalı ayrı ayrı açarak ve çözüm akışı için bir kaç dakika izin sistemden kaldırmak ve akışını tutarlı (0.5 mL/dak) ve tüp değil sızdırıyor emin olun.
- Tek satır içi çözüm ısıtıcı perfüzyon çıkış tüp bağlamak ve 37 outflowing arabellek sıcaklığını ayarlamak ° C.
- Emme pompası hazırlayın. Tüm kabarcıklar sistemden kaldırmak ve akışını tutarlı ve tüp değil sızdırıyor emin olun. Coverslip yüzeye adacıkları uygun bir kez
- yavaşça görüntüleme odasını 3 mM glikoz içeren hücre dışı çözüm ile doldurun. Coverslip yüzey uzak adacıkları yıkama kaçının.
- Görüntüleme platformu mikroskop Sahne Alanı'na adacıkları ile yere takıp perfüzyon sistemi ve emme pompası bağlayın.
- Dönüş akışını ve sürekli adacıkları ile 3 G ekstraselüler eriyik sıvı. Sistem confocal görüntüleme için hazırdır.
- hazırlamak ekstraselüler çözüm: 125 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 2.56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, % 0,1 BSA, eklemek filtre pH 7.4, steril.
- Confocal görüntüleme
- alt büyütme ile mikroskop alanındaki adacıkları bulun. Sonra adacıkları üzerinde duruldu, daha yüksek büyütme hedefleri için geçiş (örneğin, 63 X su daldırma amaç (63 X / 0.9 NA)).
- Yazılımı (Tablo reçetesi) kullanarak edinme açın ve rezonans tarayıcı kipi etkin kılın.
- XYZT görüntüleme modu seçin ve aşağıdaki gibi satın alma ayarlarını yapılandırın:
- çevirmek Argon lazer ve 488 nm lazer çizgi ve lazer güç pHluorin uyarma için % 50'ye ayarlayın.
- Toplamak emisyon, 505-555 nm.
- , 512 x 512 piksel çözünürlüğü seçin. Basın " Live " görüntüleme başlatın ve (tipik kazanç ise yaklaşık 600 V) kazanç düzeylerini ayarlamak için düğmesini.
- Ayarla BEGIN ve end z yığının: odak üstünde adacık ve seçin " başlangıç " ve son odaklı olabilir ve Seç uçak gitme " son ". 5 mikron z-adım boyutunu kullanın. Yazılım otomatik olarak confocal uçak sayısını hesaplar.
- Her z-yığın 1.5-2 s yakın edinimi için zaman aralığı ayarlarken ve seçeneği " durdurulana kadar elde " için sürekli düşsel.
- Basın " başlangıç " ini düğmetialize.
- Granül ekzositozu adacıkları ile istenen uyaranlara Ventriküler tarafından ikna etmek için çeşitli stimülasyon iletişim kurallarını kullanır. Stimulasyon protokolleri istenen bilimsel amaç (aşağıya bakın) uyacak şekilde özelleştirilebilir.
- Stimulasyon protokolleri
Not: adacık arka plan etkinliği en az 2 dakika sürekli perfüzyon 3 mM glikoz içeren hücre dışı çözüm ile kaydederek her stimülasyon Protokolü başlatın. Bir uyarıcı ile istenen süre için sıvı. Uyarıcılar sırasını, stimülasyon süresi yanı sıra kayıtları süresi istenen bilimsel amaçlar uyacak şekilde özelleştirilebilir. Yeni bir stimülasyon başlamadan önce 3 mM glikoz içeren hücre dışı çözüm adacıkları iyice yıkayın emin olun. Aşağıda yöntemi yetenekleri göstermek için kullanılan örnek stimulasyon protokolleri bulabilirsiniz.- Teşvik pHluorin pH duyarlılık ve viral enfeksiyon verimliliği ( şekil 3) pozitif kontrol olarak amonyum klorür (NH 4 Cl) ile: 3 mM glikoz (2 dk) → 50 mM NH 4 Cl (2 dk) 3 mM glikoz → 3 mM glikoz (2 dk)
Not: ın NH 4 Cl çözüm, eski yerine koymak NaCl ekimolar bazda. - Stimulate insülin granül ekzositozu glikoz konsantrasyonu ( şekil 5 ve şekil 6) artırarak: 3 mM glikoz (2 dk) → 16 mM glikoz (15-30 dakika) → 3 mM glikoz (2 dk
Not: etkinlik birkaç patlamaları görmek için en az 15 dakika süreyle 16 G Çözümle sürekli adacıkları sıvı
Not: salgı yanıt-e doğru 17 tutarlılığını artırmak için kullanıcıları kampı yükselterek ajanlar (100 µM IBMX ve 10 µM forskolin) 16 G ve 3 G çözüm ekleyebilirsiniz. Bu granül sekresyonunu zamansal şekillerinin değiştirmez. Ayrıntılar 15 ve tartışma için bkz.
- Teşvik pHluorin pH duyarlılık ve viral enfeksiyon verimliliği ( şekil 3) pozitif kontrol olarak amonyum klorür (NH 4 Cl) ile: 3 mM glikoz (2 dk) → 50 mM NH 4 Cl (2 dk) 3 mM glikoz → 3 mM glikoz (2 dk)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tüm iş akışı tekniği Resim 1' de gösterilen. Kısaca, fare veya insan adacıkları olabilir NPY-pHluorin kodlama adenovirus ile enfekte ve yansıma, kültür, confocal mikroskop altında birkaç gün sonra. Granül sigorta plazma zarı ve açık olarak, floresan bir artış görülmektedir ve sayısal (şekil 1). NPY-pHluorin gerçekten de insülin granül dynamics izlemek için uygun bir araç olup olmadığını belirlemek için virüslü adacıkları GFP ve farklı adacık hormon insülin, somatostatin veya glukagon karşı antikor ile immunostained vardı. Onlar da insülin ifade olarak beta hücreleri en hücreleri NPY-pHluorin (GFP pozitif) ifade edildi (~ % 90'ı; Şekil 2A, 2B). Sadece bir kaç glukagon pozitif alfa hücreleri veya somatostatin-pozitif delta hücreleri GFP etiketli (şekil 2B) olduğunu. Önemlisi, enfekte hücreleri içinde insülin (0,61 ± 0,04 GFP ve insülin vs 0,21 ± 0,05 GFP ve glukagon ve GFP ve somatostatin 0,07 ± 0,01 için Pearson korelasyon katsayısı) ile colocalized NPY füzyon.
O pHluorin bir etkili pH sensörü olduğunu gösterdi sonuçlandı Cl 50 mM NH4ile hücre içi pH artan olarak bir > hücre içi floresan (şekil 3A, 3B, Video 1) artış %500. Granül içinde pH füzyon plazma zarı ve füzyon gözenek açılması üzerine arttıkça NPY-pHluorin içeren tanecikler insülin ekzositozu membran depolarizasyon KCl (şekil ile gibi teşvik koşulları üzerine görünür hale gelir 4, video 2).
Tek salgı olayları olduğu gibi adacıklar içinde beta hücrelerindeki NPY-pHluorin enfekte adacıkları ile confocal hızlandırılmış görüntülemede görüntülenmeyecektir. Bunlar doğrudan membran depolarizasyon KCl veya birkaç diğer fizyolojik uyaranlar (şekil 4 ve Şekil 7aşağıya bakın,) ile yanıt olarak ortaya çıkar. Bazal Hücre dışı glikoz konsantrasyonu (3 mM), küçük salgı faaliyet görülmektedir. Ancak, granül füzyon plazma zarı ile stimülasyonu yüksek glikoz (16 mM) (şekil 5A, Video 3) ile yanıt olarak harekete geçirilir. Farklı boyutları ile ROIs yerleştirerek ve farklı alanlarda, salgı granül yanıt Kinetik o bireysel veya grup hücreleriyle yakın (küme) (şekil 5B) ile karşılaştırılabilir. Bu belirlemede etkin analiz bu tür: 1) bireysel salgı ortalama hücre yanıt birkaç saniye içinde çok eşitlenmiş ve salgılanan olaylardır ve 2) yakın beta hücreleri eşitlenmiş aktivite işlev kümeleri oluşturur.
İnsülin salgılanması vücutta pulsatil bir şekilde oluşur. Uzun süre (15-20 dk) doğuran salgı (şekil 6, Video 4) birden fazla bakliyat (veya patlamaları) için için yükseltilmiş glikoz konsantrasyonu ile NPY pHluorin enfekte adacıkları uyarıcı. Her darbe sırasında daha önce (şekil 5) gösterildiği gibi bireysel granül plazma zarı eşitlenmiş bir moda ile sigorta. Salgı faaliyet patlamaları-ebilmek var olmak her 3-4 dk gördün.
Geçici artırır Floresans NPY-pHluorin içeren tanecikler de gözlenen purinergic agonist ATP yanıt olarak (10 µM) veya muscarinic agonist asetilkolin (ACh, 10 µM) (Şekil 7), ikisi de Bitikilerin bilinen insan adacıkları içinde insülin salgılanması. Beklendiği gibi membran depolarizasyon KCl (30 mM) ile insülin granül ekzositozu (şekil 5) da tetikledi. Adacıkları iyi bir çekim gücü arasında yıkanır sürece çeşitli uyaranlara aynı adacık hazırlık için uygulanabilir. Ne zaman deneme yinelenen uygulama sırasını değiştirmek emin olun.
Şekil 1. Tahlil gösteren bir düzeni geliştirilen. NPY için birleştiğinde bir pH duyarlı GFP (pHluorin) kodlar adenovirus üretilen ve fare veya insan pankreas adacıkları bulaştırmak için kullanılır. 4-6 gün sonra enfeksiyon, adacıkları üzerinde bir coverslip yerleştirilir ve bir dik lazer tarama confocal mikroskop altında görüntüsü. NPY-pHluorin yapı beta hücrelerindeki insülin granülleri ile ifade edilir. Onun Floresans olgun insülin granülleri asidik pH söndürülür ama plazma zarı ve etkilenme olasılığını tarafsız ekstrasellüler pH 7.4 ile granül fusion üzerine parlak olur.
Şekil 2. İnsülin granülleri NPY füzyon oluşturmak dile getirdi. (A) Confocal olduğu gibi insan adacıkları görüntülerini NPY-pHluorin, immunostained GFP (yeşil) ve insülin (sol kapı aynası, kırmızı), somatostatin (orta, kırmızı) veya glukagon (doğru kırmızı) bulaşmış. Hücre çekirdeği (etiketli DAPI) mavi renkle gösterilir. Ölçek çubukları 10 µm. (B) = miktar da insülin (Ins), somatostatin (Soma) veya (Glu) glukagon içeren GFP pozitif hücre fraksiyonunun. Gösterilen misin ortalama ± SEM'ler, n = 5 adacıkları. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. NPY-pHluorin etkili bir pH sensör mı. (A) maksimal projeksiyon (üst paneli, 3 G) önce 3 mM glikoz içeren hücre dışı çözüm NPY-pHluorin ile enfekte bir fare adacık confocal görüntülerin ve 50 mM NH4Cl (alt paneli) huzurunda. Ölçek çubuğu 100 µm. (B) = ortalama Floresans yoğunluğu (rasgele adet) NH4tarafından lı kesik çizgili hattı indüklenen bütün adacık içinde değişiklik gösteren izleme NH4Cl uygulama gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Onlar sigorta ile plazma zarı ve açık bir kez NPY-pHluorin içeren tanecikler görünür olmak. NPY-pHluorin adenovirus ile insan isletsinfected olduğunu incubatEd plazma zarı ile boya di-8-ANEPP (kırmızı). Adacık stimülasyon KCl (30 mM) ile floresan granül (yeşil renkle gösterilmiştir) hücre yüzeyinde ani ve geçici görünümünü tetikledi. İnsan bir adacık hücre confocal görüntüleri exocytotic yanıt önce gösterilir (t = 0), sırasında (t = 3-9 s) ve sonra (t = 12 s). Kontrast arka plan yeşil Floresans kaldırmak için ayarlandı. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5. Yüksek glikoz NPY-pHluorin füzyon plazma zarı ile tetikler. (A) maksimal projeksiyon Bazal glikoz konsantrasyonu (paneli yaptı 3 G - 3 mM glikoz) veya yüksek glikoz (16 G - 16 mM glikoz, doğru kapı aynası) NPY-pHluorin ile enfekte olduğu gibi bir insan adacık confocal görüntüleri. Hücre dışı çözümler yer alan aracıları forskolin ve IBMX (ayrıntılı bilgi için bkz: Protokolü) yetiştirme kampı. Ölçek çubuğu 10 µm. (B) = ortalama Floresans yoğunluklarda (rasgele adet) ROIs yeşil kanaldaki değişiklikleri gösteren izleri yer tek salgı olayları (kırmızı, granül), hücreleri (yeşil) veya hücre kümeleri (mavi). Yüksek glikoz için 5 dakika sonra uygulandığı ~ 2.5 min 3 g. Floresans değerleri ilk floresan değerine (temel) normalleştirilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6. Salgı olayları oluşturmak üzerine yüksek glukoz salgılanmasını ve ayrık darbeleri. Değişiklikleri gösterilen izleri 16 mM glikoz ile sürekli stimülasyon sırasında olduğu gibi bir insan adacık içinde farklı hücrelerin etrafındaki yerleştirilen ROIs floresan yoğunluğu (rasgele adet) demek. Her renk tek bir hücre temsil eder. Salgı faaliyet patlama olabilir her 3-4 dk. gördün Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7. Plazma zarı ile NPY-pHluorin Fusion bilinen uyarıcılar insülin salgılanması tarafından tetiklenir. Değişiklikleri ortalama Floresans yoğunluğu (rasgele adet) ROIs içinde gösterilen izlemeler yerleştirilen salgı olayları olduğu gibi insan adacıkları indüklenen tarafından KCl (30 mM), ATP hücrenin etrafında (10 µM), yüksek glikoz (16G, 16 mM) ve asetilkolin (Ach, 10 µM). KCl ve ATP Bazal glikoz konsantrasyonu (3 mM) uygulandı. Siyah çizgiler ortalama granül göstermek ve gri çizgiler SEM değerleri yansıtır. Yeşil karşılık gelen hücre tepki göstermektedir. Yatay zaman ölçeği (2 dk) tüm grafiklere uygulanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Video 1. NPY-pHluorin Adenovirus verimli bir şekilde bulaştırmak adacık hücreleri ve anlamda pH değişiklikleri.
Fare adacıkları 4 gündür NPY-pHluorin kodlama adenovirus ile bulaşmış. Virüslü adacıkları üzerinde bir coverslip yer ve görüntüleme odası monte. Hücre içi pH artırmak için adacıkları ile 50 mM NH4Cl 3 mM glikoz içeren hücre dışı çözüm eklendi periosteum. NH4Cl uygulama Floresans hızlı ve güçlü bir artış görülebilir. Ölçek çubuğu 100 µm. film hızı = 5 fps =. Toplam süresi filmin bu videoyu izlemek için 90 s. lütfen tıklayın olduğunu. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video 2. Bir kez onlar sigorta ile plazma zarı ve açık NPY-pHluorin içeren tanecikler görünür hale gelir.
İnsan adacıkları NPY-pHluorin adenovirus ile enfekte plazma zarı boya di-8-ANEPP ile inkübe. Adacık stimülasyon KCl (30 mM) ile floresan granül hücre yüzeyinde ani ve geçici görünümünü tetikledi. Confocal uçakların maksimum projeksiyon gösterilir. Kontrast arka plan yeşil Floresans kaldırmak için ayarlandı. Ölçek çubuğu 20 µm. film hızı = 5 fps =. Toplam süresi filmin bu videoyu izlemek için 60 s. lütfen tıklayın olduğunu. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video 3. Granül NPY-pHluorin içeren yüksek glikoz Tetikleyicileri ekzositozu.
NPY-pHluorin içeren tanecikler füzyonu stimülasyon yüksek glikoz (16 mM) ile yanıt olarak harekete geçirilir. Bazal Hücre dışı glikoz konsantrasyonu (3 mM), küçük salgı faaliyet görülmektedir. Ancak, yüksek glikoz insülin granülleri geçici bir adacık senkronize bir şekilde farklı hücrelerinin plazma zarı görünür. Yüksek glikoz sonra uygulandığı ~ 2.5 min 3 g (16G etiketi görünür). Confocal uçakların maksimum projeksiyon gösterilir. Ölçek çubuğu 20 µm. film hızı = 10 kare/sn =. Film toplam süresi 7 dk. bu videoyu izlemek için buraya tıklayın lütfen kadardır. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video 4. Yüksek glikoz ile uzun süreli stimülasyon ekzositozu birkaç patlamaları tetikler.
Yüksek glikoz ile uzun süreli stimülasyon sırasında geçici granül görüntülendiği salgı adacıkları, birden fazla bakliyat açmaktadır. Salgı faaliyet ve darbeleri görülebilir her ~ 3-4 dk. Confocal insan bir adacık boyutunda gösterilir. Bir yalancı düzeni floresan yoğunluğu için uygulandı. Ölçek çubuğu 20 µm. film hızı = 30 kare/sn =. Film toplam süresi 20 dk. bu videoyu izlemek için buraya tıklayın lütfen kadardır. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu el yazması tarafından confocal mikroskobu sağlam pankreas adacıkları içinde beta hücrelerindeki insülin granülleri ekzositozu görselleştirmek için kullanılabilir bir teknik anlatılmaktadır. Bu NPY-pHluorin adenovirus klonlanmış floresan muhabir olarak yüksek transfection verimliliği sağlamak için kullanılır.
Yöntem bizim ellerimizde yüksek verimli olmasına rağmen öncelikle iki parametre bağlı bazı değişiklikler gerektirebilir: 1) adacık hazırlık ve viral stok 2) titresi enfeksiyon koşulları duruma getirilmesi ile kalitesi. Önce viral enfeksiyon adacıklar adacık hazırlık yalıtım ve ulaşım stres gecede 37 ° C'de kurtarmak izin Adacık Morfoloji adacık yüzey veya adacık Merkezi18 hipoksik hücrelerin (koyu hücreleri) varlığı çıkıntılı hücreleri gibi azalmış canlılık belirtileri için enfeksiyon/deyim dönemi ve onay boyunca hafif bir mikroskop altında incelemek . Her viral stok titresi ve enfeksiyon verimliliği değişebilir. Viral titresi ve kültür mikroskobu tahlil önce zamana göre kullanılan virüs seviyesini ayarlamak emin olun. En önemli adım, yeterli bir muhabir ifade edilir ve adacık bütünlüğü ve yanıt korunur enfeksiyon koşulları (örneğin, viral parçacıkların sayısı, kültür zaman tahlil önce) optimizasyonu olmasıdır. Enfeksiyon protokolü en iyileştirirken ve her yeni viral toplu iş ile birkaç adacıkları farklı zaman noktalarda toplamak ve ekzositozu KCl (30 mM) ve/veya yüksek glikoz (16 mM) ile elicited olup olmadığını kontrol edin. Tahlil daha iyi çalışır ve adacık hücreleri sağlıklı kalmak ve glikoz MOI olduğunda düşük (2) ve kültür zaman duyarlı (yaklaşık 5 gün) füzyon yapı ifade düzeylerini artırmak için genişletilmiş bulduk. Gen ürünlerinin verimli ifade daha iyi adenoviral vektör alt transfecting konsantrasyonları adacık işlevi19koruyarak elde edilebilir gösterilen bir önceki çalışma doğrultusunda bizim sonuçlarıdır.
Bu teknik, ancak, bazı sınırlamalar vardır. Biri NPY-pHluorin bir muhabir olarak kullanarak, granül plazma zarı ile sigorta ve füzyon gözenek açılır önce görüntülenmeyecektir edemem ki. İnsülin granül ekzositozu yerine kaçakçılığı çalışmaya NPY-eGFP kodlama adenovirus bunun yerine kullanılabilir. İnsülin içeren tanecikler için NPY-pHluorin daha düşük bir dereceye hedeflenebilir başka bir kısıtlamadır. Ancak, NPY-pHluorin ile enfekte hücreleri çoğunluğu aynı zamanda insülin ve daha az % 10'dan ifade hücreleri glukagon veya somatostatin ifade. Nitekim, glikoz bağımlılık granül sekresyonunu, pulsatil desen ve insülin ile birlikte yerelleştirme belirtilen en salgı olaylar insülin granülleri yayınlamasını kargo temsil. İnsülin izleme güvence altına almak için ekzositozu meydana gelen, tahlil insülin salgılanması (örneğin, yüksek glikoz) teşvik koşullar altında yapılmalıdır. Yine de, beta hücre ifade özgüllüğü artırmak için NPY-pHluorin sıçan insülin organizatörü gibi daha seçici bir organizatörü kontrol altına koymak olabilir. Tekniğin başka sınırlama ifade onların Biyogenez ve/veya davranışı20huzursuz insülin granülleri eksojen proteinlerin gerektirmesidir. Bu deneylerin sonuçlarını yorumlarken düşünülmesi gereken ve mümkünse, sonuçlar diğer insülin granül kargo proteinler kullanarak doğrulanması gerektiğini (örneğin, C-peptid, adacık amiloid polipeptid) muhabir olarak.
Bu iletişim kuralı da kamp yükselterek ajanlar (IBMX ve forskolin) insülin granül ekzositozu yüksek glikoz etkilerini artırmak için eklenmesini önerir. Bu stimülasyon Protokolü pankreas beta hücreleri kampta artırarak insülin salgılanmasını artırmak (incretins veya parakrin ve sinir sinyal molekülleri tarafından tetiklenen) fizyolojik ilgili yükseltme yolları aktivasyonu taklit eder. Yine de, ajanlar yetiştirme kampı olmaması, yüksek glikoz (16 mM) de granül ekzositozu aydınlığa çıkartıyor ama gözlenen salgı olay sayısı düşüktür. Granül görünmeye devam ayrık patlamaları, ortalama hücre yanıt ile eşitlenir ve benzer patlama süreleri göster: yüksek glikoz artı IBMX/forskolin 1.4-6,6 min 1,5-10 dk içinde yüksek glikoz yalnız vs.
Burada açıklanan tahlil varolan yöntemleri ile ilgili olarak önemli olduğu tek füzyon olaylar gerçek zamanlı olarak beta hücreleri içinde sağlam adacıkları görselleştirmek için yeterli kayma ve temporal çözünürlüğe sahip. Örneğin, hangi insülin ile glikoz stimülasyon üzerine insan adacıkları granül salınır yüksek eşitleme saptandı. Adacıkları coverslip için de iliştirilmişse, Ayrıca, onlar uzun süre (en az 15-20 dk) yansıması. Bu insan adacıkları dönemlerde pulsatil vivo içinde insülin salgılanması benzer görünür farklı öbek halinde ekzositozu oluşur göstermek için kullanıldı. Tahlil de insülin ekzositozu fare veya insan adacıkları kullanarak çeşitli uyaranlara etkisini test etmek için izin verir. Adacık hücre ayrılma gibi diğer yöntemler gerektirmediğinden, Ayrıca, bu bir adacık içinde beta hücre popülasyonlarının davranışını eğitim için uygulanabilir. Nitekim, biz komşu beta hücreleri kümeleri oluşturur gözlenen ~ 5-10 hücre içinde faaliyet senkronize. Beta hücreleri aynı kümesinden muhtemelen connexin 3621inci yapılan gap junction kanalları tarafından birleştiğinde. Eşitlenmiş onların yanıt için uygun insülin salgısı22esastır beta hücre bağlantısı gösterilmiştir.
Gelecekte, bu teknik gerçek zamanlı olarak nasıl değişiklikler sitozolik kalsiyum veya membran potansiyeli, örneğin, granül ekzositozu beta hücrelerindeki ile ilişkilendirmek görselleştirmek için fonksiyonel görüntüleme için diğer floresan boyalar ile kombine edilebilir. Özellikle, yeni pH hassas kırmızı floresan protein mevcut14,23 hale gelmektedir ve NPY veya diğer insülin granül kargo proteinler için erimiş gibi yeşil boyalar fonksiyonel görüntüleme için kullanılabilir. Ayrıca, bu teknik bir fare modeli için in vivo düşsel fare göz24ön odanın içine nakledilen bozukluklarına adacıkları ile kombine edilebilir. Adacıkları adenovirüse bakın ile enfekte olabilir 48-72 saat önce göz içine nakli. İnsan adacıkları nakli bağışıklık eksik fareler kullanılmalıdır. Bu modeli kullanarak, insülin granül salgısı hücre altı kayma desen vasküler düzenlemeler25ile ilişkili olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Yazarlar Marcia Boulina yardım için çekirdek özelliği mikroskoplar sayesinde görüntüleme DRI dan teşekkür ederiz. Bu eser NIH hibe 1K01DK111757-01 tarafından (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 ve R56 DK084321 (AC) destek verdi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
References
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
- Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
- Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
- Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
- Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478 (2011).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
- Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
- Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
- Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801 (2015).
- Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632 (2015).
- Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
- Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
- Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
- Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target? Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
- Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).
