Summary
Beschrijven we een protocol voor visualisatie van insuline exocytose in intact eilandjes met behulp van pHluorin, een pH-gevoelige groen fluorescent proteïne. Geïsoleerde eilandjes zijn besmet met adenovirus codering pHluorin gekoppeld aan het blaasje lading neuropeptide Y. Dit zorgt voor de detectie van insuline submodule fusion gebeurtenissen door confocale microscopie.
Abstract
Insuline secretie speelt een centrale rol in de homeostase van de glucose onder normale fysiologische omstandigheden zo goed zoals ziekte. Huidige benaderingen ter studie van insuline submodule exocytose gebruik electrofysiologie of microscopie gekoppeld aan de expressie van fluorescerende verslaggevers. Echter de meeste van deze technieken zijn geoptimaliseerd voor klonen cellijnen of vereisen distantiëren van de alvleesklier eilandjes. Daarentegen voorziet de methode die hier gepresenteerd in real-time visualisatie van insuline submodule exocytose in intact alvleesklier eilandjes. In dit protocol beschrijven we eerst de virale besmetting van geïsoleerde alvleesklier eilandjes met adenovirus die een pH-gevoelige groen fluorescente proteïne (GFP), pHluorin codeert, gekoppeld aan neuropeptide Y (NPY). Ten tweede, beschrijven we de confocal imaging van eilandjes vijf dagen na virale infectie en hoe u kunt controleren de secretie van insuline submodule. De besmette eilandjes zijn kort, geplaatst op een dekglaasje aan op een imaging kamer en beeld onder een rechtop scannen van laser confocal microscoop terwijl wordt voortdurend geperfundeerd met extracellulaire oplossing die verschillende prikkels. Confocale beelden verspreid over 50 µm van het eiland zijn verworven als time-lapse opnamen met behulp van een fast-resonant scanner. De fusie van insuline korrels met het plasma-membraan kan na verloop van tijd worden gevolgd. Deze procedure ook zorgt voor het testen van een batterij van stimuli in een één experiment, is compatibel met zowel muis als menselijke eilandjes en kan gecombineerd worden met verschillende kleurstoffen voor functionele beeldvorming (bijv., membraan potentiële of cytosolische calcium kleurstoffen).
Introduction
Insuline wordt geproduceerd door de beta-cellen van de alvleesklier eiland en is een zeer belangrijke regelgever van glucose metabolisme1. Overlijden of disfunctie van beta cellen glucose homeostase verstoort en leidt tot diabetes2. Insuline is verpakt in dichte-core submodules die worden uitgebracht in een Ca2 +-afhankelijke manier3. Het is van essentieel belang om volledig te begrijpen wat bepaalt insuline secretie en opent nieuwe mogelijkheden voor de identificatie van nieuwe therapeutische doelen voor de behandeling van diabetes ophelderen hoe insuline submodule exocytose is geregeld.
Insuline exocytose is uitgebreid bestudeerd met behulp van elektrofysiologische benaderingen, zoals membraan precisiecapaciteit metingen en microscopische benaderingen in combinatie met fluorescerende moleculen. Membraan precisiecapaciteit metingen hebben goede temporele resolutie en toestaan van eencellige opnames. Echter veranderingen in de capaciteit weerspiegelen de mutatie in de oppervlakte van de cel en niet individuele fusion gebeurtenissen of insuline submodule fusie van andere niet-insuline secretoire blaasjes3onderscheiden. Microscopische benaderingen, zoals twee-foton of totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie in combinatie met fluorescerende sondes en vesikel lading eiwitten, bieden extra detail. Deze technieken vangen enkele exocytotic evenementen en ook de pre- en post exocytotic etappes en kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de exocytotic patronen in populaties van cellen3.
Fluorescerende verslaggevers zijn drie soorten: 1) de extracellulaire, 2) cytoplasmatische of 3) vesiculaire. 1) extracellulaire verslaggevers zijn polar traceurs (bijvoorbeeld, dextrans, sulforhodamine B (SRB), lucifer geel, pyranine) die kunnen worden ingevoerd via de extracellulaire milieu-4. Het gebruik van de polar verklikstoffen zorgt voor het onderzoek van de fusie porie in een bevolking van cellen en vangt diverse intercellulaire structuren zoals bloedvaten. Echter, zij niet meldt op vesikel lading gedrag. 2) cytoplasmatische verslaggevers zijn fluorescerende sondes gekoppeld aan membraan-geassocieerde eiwitten die gezicht van het cytoplasma en zijn betrokken bij docking en exocytose. Voorbeelden zijn leden van de familie oplosbare Nfactor - ethylmaleimide-sensitive bijlage eiwit receptor (SNARE) die met succes zijn gebruikt in de neurowetenschappen voor het bestuderen van de neurotransmitter versie5. Dergelijke eiwitten bevatten meerdere bindende partners en zijn niet insuline-submodule specifieke. 3) vesiculaire verslaggevers zijn fluorescerende sondes gesmolten aan vesiculaire lading eiwitten die voor het onderzoek van lading-specifieke vesikel gedrag toestaan. Insuline-submodule specifieke lading eiwitten bevatten insuline, c-peptide islet amyloïde polypeptide en NPY o.a.6,7. NPY is alleen aanwezig in de insuline die submodules bevatten, en wordt mede uitgebracht met insuline, waardoor het een uitstekende partner voor een fluorescerende verslaggever8.
De fusie van verschillende fluorescente proteïnen te NPY eerder heeft gewerkt aan het bestuderen van de verschillende aspecten van exocytose in neuro-endocriene cellen, zoals bijvoorbeeld het vereiste van specifieke synaptotagmin isoforms9,10 en hoe de tijdsverloop van release hangt af van het cytoskelet actine en myosin II11,12. In deze studie kozen we pHluorin als de fluorescerende verslaggever, die is een gemodificeerde GFP thats niet-belichting fluorescerende bij de zure pH in dichte kern korrels, maar wordt helder fluorescerende bij blootstelling aan de neutrale extracellulaire pH-13. Volwassen insuline korrels hebben een zure pH onder de 5.5. Zodra de submodule met de plasmamembraan en opent smelt, wordt de lading wordt blootgesteld aan de neutrale extracellulaire pH van 7,4, waardoor het gebruik van de pH-gevoelige eiwitten-pHluorin als verslaggever7,14.
Gezien de gevoelige aard van de pH van de pHluorin en de selectieve expressie van NPY in insuline korrels, kan de structuur van de fusie van de NPY-pHluorin worden gebruikt om te bestuderen van de verschillende eigenschappen van insuline submodule exocytose. De virale levering van de fusion constructie zorgt voor een hoge transfectie efficiëntie en werkt op primaire beta cellen of cellijnen en geïsoleerde eilandjes. Deze methode kan ook worden gebruikt als een richtsnoer voor de studie van exocytose in een ander celtype met NPY-bevattende blaasjes. Het kan ook worden gecombineerd met een transgeen muismodel effecten van bepaalde voorwaarden (knockdowns, overexpressie, enz.) te bestuderen op exocytose. Deze techniek is eerder gebruikt voor het karakteriseren van de ruimtelijke en temporele patronen van insuline secretie van de submodule in bèta cel populaties in menselijke eilandjes15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
het Comité dierenethiek van de Universiteit van Miami heeft goedgekeurd alle experimenten.
1. virale besmetting van Intact geïsoleerde menselijke of muis alvleesklier eilandjes
- Islet cultuur: de islet voedingsbodems bereiden: Connaught medische onderzoek laboratoria (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS en 2 mM L-Glutamine.
- Mens alvleesklier eilandjes worden verkregen van de geïntegreerde Islet distributie programma (NIDDK, NIH). Transfer bij aankomst, de eilandjes (~ 500 islet equivalenten) op 35-mm niet-Weefselkweek behandeld petrischaaltjes met 2 mL CMRL voedingsbodems bij 37 ° C, 5% / 95% CO 2/o 2 gedurende 24 uur vóór de virale infectie.
- Muis alvleesklier eilandjes kunnen worden geïsoleerd na eerder vastgestelde protocollen 16. Na isolatie, cultuur ~ 200 islet equivalenten in 35-mm niet-Weefselkweek behandeld petrischaaltjes met 2 mL CMRL voedingsbodems bij 37 ° C, 5% / 95% CO 2/o 2 gedurende 24 uur vóór de virale infectie.
Opmerking: Vermijd het gebruik van transgene muizen met GFP of YFP verslaggevers uitgedrukt op eilandjes te vermijden fluorescentie overlapping met NPY-pHluorin.
- Virus voorbereiding
Opmerking: de NPY-pHluorin-fusie was gekloond in de pcDNA3 vector 10 en subcloned in een adenovirale vector voor adenovirale productie [adenovirus serotype 5 (DE1/E3)] door een recombinant adenovirus productiebedrijf. Het virus werd aliquoted en opgeslagen bij-80 ° C. De virale voorraad wordt geleverd door het bedrijf op titers van 10 12 tot en met 10 13 virale deeltjes (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).- Voor in vitro islet infectie, gebruik 10 6 PFU/mL, resulterend in een geschatte multipliciteit van infectie (MOI) van ongeveer 2 (Zie discussie voor details)
- Virale infectie van de alvleesklier eilandjes
Let op: Werken met adenovirussen vereist Biosafety Level 2 (BSL2) procedures en certificering. Controleer met de institutionele bioveiligheid Officer voor begeleiding en opleiding op BSL2 procedures.- Bereiden mens/muis eilandjes zoals hierboven beschreven.
- 5-10 µL van voorraad virus toevoegen aan elk 35-mm petrischaal met mens/muis eilandjes in 2 mL zuiver CMRL voedingsbodems (met 10% FBS en 2 mM L-Glutamine).
Opmerking: Het volume van de gebruikte volgens de virale titer zoals voorzien door het bedrijf gegevensblad virus. - De kleine eilandjes in het virus-bevattende cultuur media op 37 °C/5% CO 2 voor 24 h.
- Na 24 h, gecombineerd het virus-bevattende media en vervangen met 2 mL CMRL voedingsbodems (met 10% FBS en 2 mM L-Glutamine).
- De eilandjes voor 4-6 dagen bij 37 °C/5% CO 2, ter vervanging van de media om de 3 dagen cultuur.
- Na 4 - 6 dagen van kweken, verwachten ongeveer 30% van de eilandjecellen besmet. Eilandjes kunnen vervolgens worden gebruikt voor levende imaging experimenten.
2. Confocale Imaging van besmet eilandjes
Opmerking: verwijzen naar de Tabel van materialen voor de materialen en het nodige materiaal voor confocal imaging.
- Reagens voorbereiding en experimentele opzet
- bereiden extracellulaire oplossing: toevoegen van 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2.56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7.4, steriele gefilterd.
Opmerking: Deze buffer is normaal bereid zonder glucose en kan tot 1 maand bij 4 ° C worden bewaard. Glucose wordt toegevoegd op de dag van het experiment te bereiken van de gewenste eindconcentratie.- Voorbereiden basale glucose (3 mM) medium: 75 µL van 2 M glucose stock toevoegen aan 50 mL extracellulaire oplossing.
- Hyperglycemic (16 mM) medium: 400 µL van 2 M glucose stock toevoegen aan 50 mL extracellulaire oplossing
- Een extra stimulans (b.v., KCl of adenosinetrifosfaat (ATP)) in extracellulaire oplossing met 3 mM glucose verdunnen.
- Voorbehandeling voordat u begint een experiment, de coverslips met poly-D-lysine door 30 µL van poly-D-Lysine oplossing (1 mg/mL) toe te voegen aan het dekglaasje aan voor 1 h en het grondig te spoelen met H 2 O.
Opmerking: De coverslips van de poly-lysine bekleed kan worden achtergelaten bij kamertemperatuur voor maximaal 6 maanden. - Ten minste 1 uur voordat het experiment, met behulp van een precisiepipet 1 mL, de eilandjes overbrengen in een 35-mm petrischaal met extracellulaire oplossing met 3 mM glucose. Houd de eilandjes op 37 ° C en 5% CO 2.
Opmerking: Indien nodig, het plasma-membraan kan worden aangeduid in deze stap. Om een label met het plasma-membraan, voeg toe 2 µM di-8-ANEPP kleurstof aan de extracellulaire oplossing met 3 mM glucose. Incubeer de eilandjes in de kleurstof oplossing gedurende 1 uur bij 37 °C/5% CO 2. Het plasmamembraan kleurstof kan worden enthousiast op 488 nm en gedetecteerd op 620 nm. - min voordat een experiment, hechten het dekglaasje aan aan de beeldvorming kamer door het afdichten met vacuüm Siliconenvet. De imaging zaal aan het imaging platform vast te stellen. 20-30 eilandjes met behulp van een precisiepipet, plaats op het gebied van poly-D-Lysine-testgroep van het dekglaasje aan en laat de eilandjes aan de oppervlakte voor 20 min.
Opmerking: Het is belangrijk niet te laten het dekglaasje aan volledig opdrogen om islet schade voorkomen. - Terwijl de eilandjes zijn vast te houden aan het dekglaasje aan, bereid de perfusie-systeem door het grondig te spoelen met water. Elke oplossing op een ander kanaal toevoegen: 3 mM glucose (kanaal 1), 16 mM glucose (kanaal 2), 16 mM glucose met 100 µM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) en 10 µM forskolin (kanaal 3), 25 mM KCl 3 mM glucose (kanaal 4), 10 µM ATP in (glucose) 3 mM kanaal 5). Alle bubbels uit het systeem verwijderen door de opening van elk kanaal afzonderlijk en laten de stroom van de oplossing voor een paar minuten, en ervoor te zorgen dat de stroom is consistent (0,5 mL/min) en de slang niet lekt.
- De interne inline oplossing kachel verbinden met de perfusie uitlaat buis en aanpassen van de temperatuur van de uitstromende buffer tot 37 ° C.
- Bereiden de afzuigpomp. Alle bubbels uit het systeem verwijderen en ervoor te zorgen dat de stroom consistent is en de slang niet lekt. De imaging zaal opvullen
- zodra de eilandjes houden aan het oppervlak van het dekglaasje aan, zachtjes met de extracellulaire oplossing met 3 mM glucose. Voorkomen wassen de eilandjes uit de buurt van het oppervlak van het dekglaasje aan.
- Plaats van de imaging platform met de eilandjes op het podium van de Microscoop en het verbinden van de perfusie systeem en de afzuigpomp.
- Beurt op de stroom en voortdurend perfuse de eilandjes met de extracellulaire oplossing van 3G. Het systeem is nu klaar voor confocal imaging.
- bereiden extracellulaire oplossing: toevoegen van 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2.56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7.4, steriele gefilterd.
- Confocal imaging
- Ga naar de eilandjes in het veld microscoop met lagere vergroting. Zodra gericht op de eilandjes, overschakelen naar hogere vergroting doelstellingen (b.v., 63 X water onderdompeling doelstelling (63 X / 0.9 nb)).
- Open de overname softwarematig (Tabel van materialen) en activeer de modus resonant scanner.
- De XYZT imaging-modus selecteren en configureren van de overname-instellingen als volgt:
- draaien op de Argon laser en de 488 nm laser lijn en aanpassen van de kracht van de laser tot 50% voor pHluorin excitatie.
- Verzamelen emissie bij 505-555 nm.
- Kiest u een resolutie van 512 x 512 pixels. Druk op de " Live " knop om te beginnen van beeldvorming en aanpassen van de niveaus van de winst (typisch winst is ongeveer 600 V).
- Stelt u de begin- en eindtijden van de z-stack: focus op de bovenkant van het rotseilandje en kies " begin " en ga naar de laatste vliegtuig dat kan worden gericht en kies " einde ". Gebruik een z-stap grootte van 5 µm. De software berekent automatisch het aantal confocal vliegtuigen.
- Stelt het tijdsinterval voor de overname van elke z-stack dicht bij 1.5-2 s en kies de optie " verwerven totdat deze wordt gestopt " voor continue imaging.
- Druk op de " start " knop aan initialize.
- Verschillende stimulatie protocollen voor het opwekken van de submodule exocytose door zoogdierlevercellen de eilandjes met de gewenste stimuli gebruiken. Stimulatie protocollen kunnen worden aangepast aan de gewenste wetenschappelijk doel (zie hieronder).
- Stimulatie protocollen
Opmerking: In elke stimulatie protocol, beginnen met het opnemen van ten minste 2 min van islet achtergrond activiteit tijdens constante perfusie met extracellulaire oplossing met 3 mM glucose. Perfuse met een stimulans voor de gewenste periode. De volgorde van stimulerende middelen, duur van de stimulatie en duur van de opnames kan worden aangepast aan de gewenste wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt. Zorg ervoor dat eilandjes grondig wassen met extracellulaire oplossing met 3 mM glucose voordat u begint een nieuwe stimulatie. Hieronder vindt u de monster stimulatie protocollen die zijn gebruikt om aan te tonen de mogelijkheden van de methode.- Stimuleren met ammoniumchloride (NH 4 Cl) als positieve controle voor pHluorin pH gevoeligheid en efficiëntie van de virale infectie ( Figuur 3): 3 mM glucose (2 min) → 50 mM NH 4 Cl (2 min) in 3 mM glucose → 3 mM glucose (2 min)
Opmerking: In het NH 4 Cl oplossing, NaCl vervangen op basis van mengsel. - Stimuleren insuline submodule exocytose doordat de concentratie glucose ( Figuur 5 en Figuur 6): 3 mM glucose (2 min) → 16 mM glucose (15-30 min) → 3 mM glucose (2 min
Opmerking: Om te kunnen zien meerdere uitbarstingen van activiteit, de eilandjes voortdurend met de 16 G oplossing voor ten minste 15 min. perfuse
Opmerking: Teneinde de consistentie van secretoire reacties 17, kunnen gebruikers cAMP-raising agenten (100 µM IBMX en 10 µM forskolin) toevoegen aan zowel de 3 G en 16 G oplossingen. Dit verandert niet de temporele patronen van submodule secretie. Voor details zie 15 en discussie.
- Stimuleren met ammoniumchloride (NH 4 Cl) als positieve controle voor pHluorin pH gevoeligheid en efficiëntie van de virale infectie ( Figuur 3): 3 mM glucose (2 min) → 50 mM NH 4 Cl (2 min) in 3 mM glucose → 3 mM glucose (2 min)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De volledige workflow van de techniek is afgebeeld in Figuur 1. Muis of menselijke eilandjes kunnen kort worden besmet met adenovirus codering van NPY-pHluorin en beeld, na paar dagen in cultuur, onder een confocal microscoop. Zoals korrels zekering met plasma-membraan en open, een verhoging van fluorescentie is waargenomen en kunnen worden gekwantificeerd (Figuur 1). Om te bepalen als NPY-pHluorin inderdaad een geschikt hulpmiddel is voor de monitoring van insuline submodule dynamiek, werden besmette eilandjes immunostained met antilichamen tegen GFP en verschillende islet hormonen insuline, glucagon of Somatostatine. De meeste cellen uiten van NPY-pHluorin (GFP positief) beta cellen werden uitgedrukt ze ook insuline (~ 90%; Figuur 2A, 2B). Alleen een paar glucagon-positieve Alfa cellen of Somatostatine-positieve delta cellen waren GFP-label (figuur 2B). Nog belangrijker is, in de geïnfecteerde cellen, de fusie van de NPY colocalized met insuline (de Pearson-correlatiecoëfficiënt van 0.61 ± 0,04 voor GFP en insuline vs. 0.21 ± 0,05 voor GFP en glucagon en 0,07 ± 0,01 voor GFP en Somatostatine).
We laten zien dat pHluorin is een effectieve pH sensor, als de verhoging van de intracellulaire pH met 50 mM NH4Cl resulteerde in een > 500% verhoging van de intracellulaire fluorescentie (figuur 3A, 3B, Video 1). Als de pH binnen de submodule op fusie met het plasmamembraan en de openstelling van de fusion porie toeneemt, zichtbaar korrels met NPY-pHluorin op voorwaarden die het stimuleren van insuline exocytose zoals membraan depolarisatie met KCl (figuur 4, video 2).
Enkele secretoire gebeurtenissen in beta cellen binnen intact eilandjes kunnen worden gevisualiseerd met confocal time-lapse beeldvorming van NPY-pHluorin besmet eilandjes. Deze treden in reactie op directe membraan depolarisatie met KCl of verschillende andere fysiologische stimuli (Figuur 4 en Figuur 7, zie hieronder). In de basale extracellulaire glucose concentratie (3 mM), wordt weinig secretoire activiteit waargenomen. Echter is de submodule fusion met het plasmamembraan aanleiding in reactie op de stimulatie met hoge glucose (16 mM) (figuur 5A, Video 3). Door het plaatsen van de ROI met verschillende maten en in verschillende gebieden, kan de reactie-kinetiek van secretoire korrels worden vergeleken met die van afzonderlijke cellen of groepen cellen in de nabijheid (cluster) (figuur 5B). Dit type analyse ingeschakeld bepalen dat: 1) de individuele secretoire gebeurtenissen zijn zeer gesynchroniseerde en secreted binnen een paar seconden van de gemiddelde cel-reactie, en 2) de beta-cellen in de nabijheid vormen functionele clusters van gesynchroniseerde activiteit.
De secretie van insuline in het lichaam treedt op in een Pulsatiele wijze. Het stimuleren van de NPY-pHluorin-besmet eilandjes met verhoogde glucose concentratie voor langere tijd (15-20 min) gaf aanleiding tot meerdere pulsen (of barst) van secretie (Figuur 6, Video 4). Tijdens elke puls samensmelten individuele korrels met het plasma-membraan op een gesynchroniseerde manier zoals vóór (Figuur 5). Uitbarstingen van de secretoire activiteit kunnen worden gezien van elke 3-4 min.
Voorbijgaande aard stijgingen van de fluorescentie in NPY-pHluorin met korrels kon ook worden waargenomen in reactie op de purinergic-agonist ATP (10 µM) of de muscarinerge agonist acetylcholine (ACh, 10 µM) (Figuur 7), die beide bekend stimulatoren van insuline secretie in menselijke eilandjes. Zoals verwacht, de membraan depolarisatie met KCl (30 mM) ook geactiveerd insuline submodule exocytose (Figuur 5). Verschillende prikkels kunnen worden toegepast op de dezelfde islet voorbereiding, zolang de eilandjes zijn gewassen goed tussen stimuli. Controleer of wijzigt u de volgorde van toepassing wanneer het experiment te herhalen.
Figuur 1. Een regeling ter illustratie van de bepaling ontwikkeld. Adenovirus die codeert een pH-gevoelige GFP (pHluorin) gekoppeld aan de NPY werden geproduceerd en gebruikt voor het infecteren van de muis of menselijke alvleesklier eilandjes. Vier tot zes dagen na de infectie, werden de eilandjes geplaatst op een dekglaasje aan en beeld onder een rechtop scannen van laser confocal microscoop. De NPY-pHluorin-constructie wordt uitgedrukt in insuline korrels in beta cellen. De fluorescentie bij de zure pH van volwassen insuline korrels is uitgeblust maar wordt helder op submodule fusion met het plasmamembraan en de blootstelling aan de extracellulaire neutrale pH van 7,4.
Figuur 2. De bouw van de fusie van de NPY wordt uitgedrukt in insuline korrels. (A) Confocal beelden van intact menselijke eilandjes besmet met NPY-pHluorin, immunostained voor GFP (groen) en insuline (linker paneel, rood), Somatostatine (midden, rood) of glucagon (rechts, rood). De celkernen worden weergegeven in het blauw (DAPI label). Schaal bars = 10 µm. (B) kwantificering van de Fractie van GFP-positieve cellen waarin ook insuline (Ins), Somatostatine (Soma) of glucagon (Glu). Getoond worden de gemiddelde ± SEMs, n = 5 eilandjes. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. NPY-pHluorin is een effectieve pH Sensor. (A) maximale projectie van de confocal beelden van een muis islet geïnfecteerd met NPY-pHluorin in extracellulaire oplossing met 3 mM glucose vóór (bovenste paneel, 3 G) en in het bijzijn van 50 mM NH4Cl (lagere paneel). Schaal bar = 100 µm. (B) Trace de verandering in gemiddelde fluorescentie intensiteit (willekeurige eenheden) in het hele eilandje geïnduceerd door NH4Cl. Dashed lijn tonen geeft NH4Cl toepassing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Korrels met NPY-pHluorin zichtbaar zodra ze met het Plasma-membraan en Open samensmelten. Menselijke isletsinfected met NPY-pHluorin adenovirus werden incubatEd met het plasmamembraan kleurstof di-8-ANEPP (rood). Islet stimulatie met KCl (30 mM) veroorzaakt een plotselinge en voorbijgaande verschijning van fluorescerende korrels op het celoppervlak (afgebeeld in groen). Confocale beelden van cellen in een menselijke eilandje worden weergegeven vóór de exocytotic reactie (t = 0), tijdens (t = 3-9 s) en na (t = 12 s). Contrast werd aangepast om te verwijderen van de achtergrond groene fluorescentie. Schaal bar = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Hoge Glucose Triggers NPY-pHluorin Fusion met het plasmamembraan. (A) maximale projectie van de confocal beelden van een intact menselijke islet geïnfecteerd met NPY-pHluorin in de basale glucose concentratie (3 G - 3 mM Glucose, deelvenster links) of in hoge glucose (16 G - 16 mM Glucose, rechter paneel). Extracellulaire oplossingen bevatte het kamp verhogen agenten forskolin en IBMX (Zie Protocol voor details). Schaal bar = 10 µm. (B) wijzigingen in gemiddelde fluorescentie intensiteiten (willekeurige eenheden) in het groene kanaal in ROIs tonen sporen geplaatst rond één secretoire evenementen (rood, submodule), cellen (groen) of cel clusters (blauw). Hoge glucose werd toegepast voor 5 min na ~ 2,5 min in 3G. Fluorescentie waarden zijn genormaliseerd naar de waarde van de eerste fluorescentie (basislijn). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6. Secretoire gebeurtenissen genereren Discrete pulsen van secretie op hoge Glucose. Sporen met veranderingen in intensiteit van de fluorescentie (willekeurige eenheden) in ROIs geplaatst rond verschillende cellen binnen een intact menselijke islet tijdens aanhoudende stimulatie met 16 mM glucose betekenen. Elke kleur vertegenwoordigt een afzonderlijke cel. Uitbarsting van de secretoire activiteit kan worden gezien van elke 3-4 min. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7. NPY-pHluorin Fusion met het Plasma-membraan wordt geactiveerd door bekend stimulatoren van insuline secretie. Veranderingen in de gemiddelde fluorescentie intensiteit (willekeurige eenheden) tonen in ROIs sporen geplaatst rond afzonderlijke secretoire gebeurtenissen in cellen binnen intact menselijke eilandjes geïnduceerd door KCl (30 mM), ATP (10 µM), hoge glucose (16G, 16 mM) en acetylcholine (Ach, 10 µM). KCl en ATP werden toegepast in de basale glucose concentratie (3 mM). Zwarte lijnen tonen de gemiddelde submodule en grijze lijnen overeen met SEM waarden. Groene sporen Toon de corresponderende cel-reactie. Horizontale tijdschaal (2 min) geldt voor alle grafieken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Video 1. NPY-pHluorin Adenovirus efficiënt infecteren eilandjecellen en zin pH wijzigingen.
Muis eilandjes besmet waren met adenovirus codering van NPY-pHluorin voor 4 dagen. Geïnfecteerde eilandjes werden op een dekglaasje aan geplaatst en gemonteerd op de imaging kamer. De eilandjes werden om intracellulaire pH, geperfundeerd met 50 mM NH4Cl toegevoegd aan de extracellulaire oplossing met 3 mM glucose. Een snelle en sterke stijging van de fluorescentie te zien van NH4Cl toepassing. Schaal bar = 100 µm. film snelheid = 5 bps. Totale duur van de film is 90 s. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 2. Korrels met NPY-pHluorin worden zichtbaar zodra ze met het Plasma-membraan en Open samensmelten.
Menselijke eilandjes geïnfecteerd met NPY-pHluorin adenovirus werden geïncubeerd met het plasmamembraan kleurstof di-8-ANEPP. Islet stimulatie met KCl (30 mM) veroorzaakt een plotselinge en voorbijgaande verschijning van fluorescerende korrels op het celoppervlak. Een maximale projectie van de confocal vliegtuigen wordt weergegeven. Contrast werd aangepast om te verwijderen van de achtergrond groene fluorescentie. Schaal bar = 20 µm. film snelheid = 5 bps. Totale duur van de film is 60 s. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 3. Hoge Glucose Triggers exocytose van korrels met NPY-pHluorin.
Fusie van NPY-pHluorin met submodules wordt geactiveerd in reactie op de stimulatie met hoge glucose (16 mM). In basale extracellulaire glucose concentratie (3 mM), wordt weinig secretoire activiteit waargenomen. Echter bij hoge glucose verschijnen insuline korrels Transient op het plasma-membraan van verschillende cellen van een eilandje op een gesynchroniseerde manier. Hoge glucose werd toegepast na ~ 2,5 min in 3G (16G label wordt weergegeven). Een maximale projectie van de confocal vliegtuigen wordt weergegeven. Schaal bar = 20 µm. film snelheid = 10 fps. Totale duur van de film is 7 min. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 4. Langdurige stimulatie met hoge Glucose Triggers diverse uitbarstingen van exocytose.
Langdurige stimulatie met hoge glucose geeft aanleiding tot meerdere pulsen van secretie eilandjes, gedurende welke korrels Transient verschijnen. Pulsen van secretoire activiteit te zien elke ~ 3-4 min. Confocal vliegtuig van een menselijke islet wordt weergegeven. Een kleurcorrectie regeling werd toegepast voor de intensiteit van de fluorescentie. Schaal bar = 20 µm. film snelheid = 30 fps. Totale duur van de film is 20 min. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript beschrijft een techniek die kan worden gebruikt voor het visualiseren van exocytose van insuline korrels in beta cellen binnen intact alvleesklier eilandjes door confocale microscopie. Het maakt gebruik van NPY-pHluorin als de fluorescerende verslaggever gekloond in adenovirus een hoge transfectie efficiëntie te waarborgen.
Hoewel de methode uiterst efficiënt in onze handen was, het wellicht enkele wijzigingen die vooral afhankelijk zijn van twee parameters: 1) de kwaliteit van islet voorbereiding, en 2) de titer van virale voorraad met optimalisering van de voorwaarden van de infectie. Vóór de virale infectie van de eilandjes, toestaan de islet voorbereiding om te herstellen van isolatie en transport stress's nachts bij 37 ° C. Inspecteren van de morfologie van de eilandje onder een lichte Microscoop gedurende de infectie/expressieperiode en te controleren op tekenen van verminderde levensvatbaarheid zoals cellen uitsteken van de islet oppervlak of aanwezigheid van hypoxische cellen (donkere cellen) van het eilandje center18 . Elke virale voorraad kan variëren in titer en infectie efficiëntie. Zorg ervoor dat het volume van de gebruikte volgens de virale titer en het tijdstip van cultuur vóór de bepaling van de microscopie virus. De meest kritische stap is de optimalisatie van de voorwaarden van de infectie (bijvoorbeeldaantal virale deeltjes, cultuur tijd voordat assay) zodat genoeg van de verslaggever wordt uitgedrukt en het eilandje integriteit en responsiviteit worden gehandhaafd. Bij het optimaliseren van het protocol van de infectie en met iedere nieuwe virale batch, verzamelen van een paar eilandjes op verschillende tijdstippen en controleren of exocytose worden met KCl (30 mM) en/of hoge glucose (16 mM ontlokte kan). We vonden dat de bepaling beter werkt en eilandjecellen gezond blijven en glucose ontvankelijk wanneer de MOI laag (ongeveer 2) en de tijd van de cultuur is is uitgebreid (ongeveer 5 dagen) verhogen van de expressie van de constructie van de fusie. Onze resultaten komen overeen met een eerdere onderzoek waaruit blijkt dat efficiënte uitdrukking van genproducten beter kan worden bereikt bij lagere transfecting concentraties van de adenovirale vector behoud islet functie19.
De techniek heeft echter enkele beperkingen. Een is dat met behulp van NPY-pHluorin als verslaggever, korrels niet kunnen worden gevisualiseerd voordat ze met het plasmamembraan samensmelten en de fusion porie wordt geopend. Studeren insuline submodule mensenhandel in plaats van exocytose, kan adenovirus NPY-eGFP codering worden gebruikt in plaats daarvan. Een andere beperking is dat een lagere mate, NPY-pHluorin kan worden gericht op niet-insuline met korrels. De meerderheid van de cellen die geïnfecteerd waren met NPY-pHluorin uitgedrukt echter ook insuline en minder dan 10% van de cellen die glucagon of Somatostatine. Inderdaad, de afhankelijkheid van de glucose van de submodule secretie, haar Pulsatiele patroon en co localisatie met insuline, aangegeven dat meest secretoire gebeurtenissen vertegenwoordigen lading vrijlating uit insuline korrels. Om te garanderen dat toezicht op insuline zich exocytose voordoet, wordt de test moet worden uitgevoerd onder omstandigheden die insuline secretie (bijvoorbeeld, hoge glucose) te stimuleren. Toch, ter verbetering van de specificiteit van beta cel expressie, NPY-pHluorin kan worden gebracht onder de controle van een selectiever promotor zoals de rat insuline promotor. Een andere beperking van de techniek is dat er uitdrukking van exogene eiwitten in insuline korrels, die hun biogenese en/of gedrag20kunnen erover. Dit moet worden overwogen bij het interpreteren van de resultaten van de experimenten en, indien mogelijk, de conclusies moeten worden gevalideerd met behulp van andere insuline submodule lading eiwitten (bijvoorbeeld, C-peptide, islet amyloïde polypeptide) als verslaggevers.
Dit protocol is ook aangeraden om waaronder cAMP-raising agentia (IBMX en forskolin) naar de effecten van hoge glucose op insuline submodule exocytose versterken. Dit protocol stimulatie bootst de activering van fysiologisch relevante uitdeinende trajecten (veroorzaakt door incretins of paracrine en neurale signalering moleculen) die insuline secretie versterken door het verhogen van de kamp in de alvleesklier beta-cellen. Echter bij het ontbreken van cAMP verhogen van agenten, hoge glucose (16 mM) lokt ook submodule exocytose maar het aantal secretoire gebeurtenissen waargenomen is lager. Korrels nog steeds weergegeven in discrete uitbarstingen, worden gesynchroniseerd met de gemiddelde cel-reactie en Toon soortgelijk burst periodes: 1.4-6.6 min in hoge glucose plus IBMX/forskolin vs. 1.5-10 min in hoge glucose alleen.
De hier beschreven test is veelzeggend ten opzichte van bestaande methoden, aangezien er voldoende ruimtelijke en temporele resolutie te visualiseren één fusion gebeurtenissen in real-time in beta cellen binnen intact eilandjes. Bijvoorbeeld, bleek de hoge synchronisatie met welke insuline korrels worden vrijgegeven in menselijke eilandjes op glucose stimulatie. Bovendien, als eilandjes zijn goed aangesloten op het dekglaasje aan, kunnen ze worden beeld gedurende langere tijd (minstens 15-20 min). Dit werd gebruikt om te laten zien dat in menselijke eilandjes exocytose treedt op in verschillende uitbarstingen die worden weergegeven in perioden vergelijkbaar zijn met die van Pulsatiele in vivo insuline secretie. De bepaling staat ook voor het testen van het effect van verschillende stimuli op insuline exocytose met behulp van lymfkliertest of menselijke eilandjes. Bovendien, omdat het vereist geen eilandje cel dissociatie als andere methoden, het kan worden toegepast om te bestuderen het gedrag van beta cel populaties binnen een eilandje. Inderdaad, we waargenomen dat naburige beta cellen clusters van vormen ~ 5-10 cellen waarin de activiteit wordt gesynchroniseerd. Beta cellen van hetzelfde cluster zijn waarschijnlijk gekoppeld door gap junction kanalen gemaakt van connexin 3621. Hun gesynchroniseerde reactie illustreert de bèta cel connectiviteit die essentieel is voor de juiste insuline secretie22.
In de toekomst, kan deze techniek worden gecombineerd met andere fluorescente kleurstoffen voor functionele denkbaar om te visualiseren in real time hoe veranderingen in cytosolische calcium of membraanpotentiaal, bijvoorbeeld, correleren met de submodule exocytose in beta cellen. In het bijzonder, en nieuwe pH gevoelig rood fluorescerende eiwitten zijn steeds beschikbaar14,23 te NPY of andere insuline submodule lading eiwitten kunnen worden gesmolten, kunnen groene kleurstoffen voor functionele beeldvorming worden gebruikt. Deze techniek kan bovendien worden gecombineerd met een muismodel voor in vivo imaging van gevacuoliseerd eilandjes in de voorste kamer van de muis oog24getransplanteerd. Eilandjes kunnen worden besmet met adenovirussen 48-72 uur vóór de transplantatie in het oog. Immuun-deficiënte muizen moeten worden gebruikt als menselijke eilandjes worden getransplanteerd. Met behulp van dit model, kan de subcellular ruimtelijk patroon van insuline submodule secretie worden gecorreleerd met vasculaire regelingen25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Marcia Boulina uit de DRI imaging core faciliteit voor hulp met de microscopen. Dit werk werd gesteund door de NIH subsidies 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 en R56 DK084321 (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
References
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
- Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
- Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
- Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
- Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478 (2011).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
- Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
- Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
- Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801 (2015).
- Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632 (2015).
- Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
- Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
- Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
- Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target? Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
- Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).
