Summary
يمكننا وصف بروتوكول للتصور للرقابة الأنسولين في الجزيرات سليمة باستخدام فلورين، بروتين فلوري أخضر حساسة لدرجة الحموضة. الجزر الصغيرة المعزولة مصابون بترميز فلورين بالإضافة إلى البضائع حويصلة neuropeptide Y إتش. وهذا يسمح للكشف عن أحداث الانصهار الحبيبية الأنسولين بالفحص المجهري [كنفوكل].
Abstract
إفراز الأنسولين يلعب دوراً مركزياً في التوازن الجلوكوز في ظل الظروف الفسيولوجية العادية، فضلا عن المرض. النهج الحالي لدراسة الرقابة الحبيبية الأنسولين أما استخدام الكهربية أو مجهرية بالإضافة إلى التعبير عن الصحفيين الفلورسنت. ولكن معظم هذه التقنيات قد تم الأمثل لخطوط الخلايا الاستنساخ أو تتطلب الناي جزيرات البنكرياس. وفي المقابل، يسمح الطريقة المعروضة هنا للوقت الحقيقي التصور للأنسولين الحبيبية للرقابة في جزيرات البنكرياس سليمة. في هذا البروتوكول، يصف لنا أولاً العدوى الفيروسية من جزيرات البنكرياس المعزول مع إتش ترميز حساسة لدرجة الحموضة أخضر نيون بروتين (التجارة والنقل)، فلورين، بالإضافة إلى neuropeptide Y (نبي). وثانيا، يصف لنا [كنفوكل] التصوير من الجزيرات خمسة أيام بعد العدوى الفيروسية وكيفية مراقبة إفراز الأنسولين الحبيبية. بإيجاز، توضع على ساترة في دائرة تصوير للجزر المصابة وتصويرها تحت مجهر [كنفوكل] تستقيم المسح الضوئي الليزر بينما يجري perfused باستمرار مع الحل خارج الخلية التي تحتوي على المنبهات المختلفة. [كنفوكل] الصور التي تغطي 50 ميكرون من جزيرة ليلى تكتسب كالوقت الفاصل بين التسجيلات باستخدام ماسح ضوئي سريع رنانة. يمكن أن يتبع انصهار حبيبات الأنسولين مع غشاء البلازما على مر الزمن. هذا الإجراء يسمح لاختبار بطارية محفزات في تجربة واحدة أيضا ومتوافق مع الماوس والجزيرات البشرية، ويمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع الأصباغ المختلفة لتصوير الوظيفية (مثلاً، غشاء الأصباغ الكالسيوم المحتملة أو سيتوسوليك).
Introduction
يتم إنتاج الأنسولين خلايا بيتا من البنكرياس جزيرة ليلى ومنظم رئيسي الجلوكوز الأيض1. الموت أو خلل وظيفي لخلايا بيتا يخل بالتوازن السكر ويؤدي إلى مرض السكري2. هي معبأة الأنسولين في الحبيبات الكثيفة الأساسية التي يتم إصدارها في Ca2 +-تعتمد طريقة3. توضيح كيف ينظم الرقابة الحبيبية الأنسولين ضروري للفهم الكامل لما يحدد إفراز الأنسولين، ويفتح آفاقاً جديدة لتحديد أهداف علاجية جديدة لعلاج مرض السكري.
وتم درس الرقابة الأنسولين على نطاق واسع استخدام نهج الكهربية، مثل الغشاء السعة القياسات، والنهج المجهرية في تركيبة مع جزيئات الفلورسنت. غشاء السعة قياسات الأزمنة جيدة وتسمح تسجيلات خلية مفردة. بيد التغيرات في السعة يعكس صافي التغيير السطحي في الخلية ولا التقاط الأحداث الفردية الانصهار أو التمييز بين الانصهار الحبيبية الأنسولين من الحويصلات الافرازية غير الأنسولين الأخرى3. الطرق المجهرية، مثل انعكاس الداخلية اثنين-فوتون أو مجموع الأسفار (TIRF) مجهرية في تركيبة مع تحقيقات الفلورسنت والبروتينات البضائع حويصلة، توفر تفاصيل إضافية. هذه التقنيات التقاط أحداث اكسوسيتوتيك واحد، وأيضا في مراحل ما قبل وما بعد اكسوسيتوتيك، ويمكن استخدامها لدراسة أنماط اكسوسيتوتيك في السكان من الخلايا3.
الفلورسنت الصحفيين يمكن أن تكون من ثلاثة أنواع: 1) خارج الخلية أو 2) هيولى 3) حويصلية. 1) الصحافيين خارج الخلية هي تتبع القطبية (مثلاً، ديكسترانس، سولفورهوداميني ب (SRB)، إبليس الأصفر، بيرنيني) التي يمكن تقديمها من خلال الوسط خارج الخلية4. استخدام تتبع القطبية يسمح لتحقيق المسام الانصهار في عدد أن خلايا ويلتقط الهياكل بين الخلايا المختلفة مثل الأوعية الدموية. بيد أنها لا تبلغ عن السلوك البضائع حويصلة. 2) هيولى الصحفيين هي تحقيقات الفلورسنت بالإضافة إلى البروتينات المرتبطة بالغشاء الذي يواجه السيتوبلازم، وهي تشارك في الالتحام والرقابة. وتشمل الأمثلة أعضاء نالقابلة للذوبان-اثيلماليميدي-يراعي عامل مرفق البروتين مستقبلات (الفخ) الأسرة التي استخدمت بنجاح في علم الأعصاب لدراسة العصبي الإصدار5. هذه البروتينات متعددة الشركاء ملزمة وليست الحبيبية الأنسولين المحددة. 3) حويصلية الصحفيين هي الفلورية المسابير تنصهر فيها البضائع حويصلية البروتينات التي تسمح لتحقيق سلوك حويصلة الخاصة بالبضائع. البروتينات الحبيبية الأنسولين بضائع محددة تشمل الأنسولين، ج-الببتيد وجزيرة ببتيد اميلويد ونبي بينها6،7. نبي موجودة فقط في الأنسولين الذي يحتوي على حبيبات، ويطلق يشترك مع الأنسولين، يجعلها شريكا ممتازا ل مراسل نيون8.
انصهار مختلف البروتينات الفلورية إلى نبي قد استخدمت سابقا لدراسة الجوانب المختلفة للرقابة في خلايا الغدد الصم العصبية، مثل شرط محدد سينابتوتاجمين إيسوفورمس9،10 وكيف يعتمد الوقت-الدورة التدريبية للإفراج على cytoskeleton أكتين وعلى الميوسين الثاني11،12. في هذه الدراسة، اخترنا فلورين كمراسل الفلورسنت، وهي بروتينات فلورية خضراء معدلة التي غير الفلورية على درجة الحموضة الحمضية داخل الأساسية كثيفة ولكن يصبح الزاهية الفلورسنت عند التعرض ل درجة الحموضة خارج الخلية محايدة13حبيبات. حبيبات الأنسولين ناضجة بدرجة حموضة حمضية أدناه 5.5. مرة واحدة الحبيبية الصمامات بغشاء البلازما ويفتح، يتعرض حمولتها الهيدروجيني المحايدة خارج الخلية من 7.4، السماح باستخدام فلورين البروتينات حساسة لدرجة الحموضة كمراسل7،14.
نظراً لطبيعة حساسة pH فلورين والتعبير الانتقائي لنبي في حبيبات الأنسولين، يمكن استخدامها في بناء الانصهار نبي-فلورين لدراسة الخصائص المختلفة للأنسولين الحبيبية للرقابة. إنجاز بناء الانصهار الفيروسية يضمن تعداء عالية الكفاءة ويعمل على خلايا بيتا أولية أو خطوط الخلايا وكذلك على الجزر الصغيرة المعزولة. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب كمبدأ توجيهي لدراسة الرقابة في أي نوع آخر من أنواع الخلايا مع الحويصلات المحتوية على نبي. فإنه يمكن أيضا أن يقترن مع أي نموذج الفأر وراثيا لدراسة آثار شروط معينة (كنوكدوونس، أوفيريكسبريشن، إلخ) على الرقابة. هذه التقنية قد استخدمت سابقا لوصف الأنماط المكانية والزمانية لإفراز الحبيبية الأنسولين في خلايا بيتا السكان في الجزر البشرية15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
لجنة الأخلاقيات الحيوان من جامعة ميامي قد وافقت جميع التجارب-
1. الفيروسي العدوى سليمة معزولة الإنسان أو الماوس جزيرات البنكرياس
- ثقافة الجزيرة: إعداد وسائل الإعلام ثقافة جزيرة ليلى: كونوت طبية أبحاث المختبرات (كمرل) 1066، 10% (v/v) FBS ومم 2 لتر-الجلوتامين.
يتم الحصول على جزيرات البنكرياس
- الإنسان من "برنامج توزيع جزيرة متكاملة" (نيدك، المعاهد الوطنية للصحة). لدى وصوله، نقل الجزيرات (~ 500 جزيرة مكافئات) إلى 35 ملم غير-زراعة الأنسجة تعامل أطباق بيتري مع 2 مل كمرل ثقافة الإعلام عند 37 درجة مئوية، 5/95% CO 2 &/O 2 ل 24 ساعة قبل العدوى الفيروسية.
- الماوس جزيرات البنكرياس يمكن عزل عقب البروتوكولات المحددة سابقا 16. بعد العزلة والثقافة ~ 200 جزيرة مكافئات في 35 ملم غير-زراعة الأنسجة تعامل أطباق بيتري مع 2 مل كمرل ثقافة الإعلام عند 37 درجة مئوية، 5/95% CO 2 &/O 2 ل 24 ساعة قبل العدوى الفيروسية.
ملاحظة: تجنب استخدام الفئران المعدلة وراثيا مع الصحفيين بروتينات فلورية خضراء أو يفب أعرب في الجزر الصغيرة لتجنب التداخل الأسفار مع فلورين نبي.
- إعداد الفيروسات
ملاحظة: الانصهار نبي-فلورين المستنسخة في ناقلات pcDNA3 10 وسوبكلونيد إلى متجه أدينوفيرال لإنتاج أدينوفيرال [إتش النمط المصلي المسيطر 5 (DE1/E3)] من إتش المؤتلف الشركة المصنعة. وكان الفيروس اليكووتيد والمخزنة في-80 درجة مئوية. الأسهم الفيروسية يتم توفيرها من قبل الشركة في التتر 10 12 إلى 10 13 الجسيمات الفيروسية (~ 10 3 × 10-3 × 10 11 [بفو]).- للإصابة في المختبر جزيرة ليلى، باستخدام 10 6 بفو/mL، أدى تعدد تقريبي للإصابة (وزارة الداخلية) لحوالي 2 (انظر المناقشة للحصول على التفاصيل)
- العدوى الفيروسية من جزيرات البنكرياس
تنبيه: العمل مع غدية يتطلب إجراءات السلامة البيولوجية المستوى 2 (BSL2) وإصدار الشهادات. تحقق مع موظف السلامة المؤسسية للتوجيه والتدريب على إجراءات BSL2.- إعداد الإنسان/الماوس الجزر الصغيرة كما هو موضح أعلاه.
- إضافة 5-10 ميليلتر من الفيروسات الأسهم لكل طبق بتري 35 ملم تحتوي على الجزر الإنسان/الماوس في 2 مل وسائط الثقافة كمرل (مع 10% FBS ومم 2 لتر-الجلوتامين).
ملاحظة: ضبط حجم الفيروس المستخدمة وفقا لعيار الفيروسية كما هو منصوص عليه بورقة البيانات الشركة. - ثقافة الجزر في احتواء الفيروس وسائط الإعلام في 37 °C/5% CO 2 ل 24 h.
- بعد 24 ساعة، نضح الوسائط التي تحتوي على الفيروسات واستبدال مع 2 مل كمرل ثقافة وسائل الإعلام (مع 10% FBS ومم 2 لتر-الجلوتامين).
- الثقافة في الجزر لمدة 4-6 أيام في 37 °C/5% CO 2، الاستعاضة عن وسائل الإعلام كل 3 أيام-
- بعد 4-6 أيام لاستزراع، نتوقع حوالي 30% خلايا الجزيرة للإصابة. ثم يمكن استخدام الجزر لتجارب التصوير حية.
2. [كنفوكل] "التصوير من المصابين جزيرات"
ملاحظة: الرجوع إلى الجدول للمواد اللازمة للمواد والمعدات اللازمة للتصوير [كنفوكل]-
إعداد- كاشف والإعداد التجريبية
- إعداد الحل خارج الخلية: إضافة 125 ملم كلوريد الصوديوم، 5.9 ملم بوكل، مم 2.56 كاكل 2، 1 مم مجكل 2، 25 مم هيبيس، 0.1% جيش صرب البوسنة، درجة الحموضة 7.4، عقيمة تصفيتها.
ملاحظة: هذا المخزن المؤقت هو إعداد عادة دون الجلوكوز ويمكن تخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. يتم إضافة السكر في اليوم من هذه التجربة للوصول إلى التركيز النهائي المطلوب.- تحضير الجلوكوز القاعدي (3 مم) المتوسطة: إضافة ميليلتر 75 م 2 الجلوكوز المخزون إلى 50 مل من محلول خارج الخلية.
- المتوسطة هايبرجليسيميك (16 مم): إضافة ميليلتر 400 م 2 الجلوكوز المخزون إلى 50 مل من محلول خارج الخلية
- تمييع أي حافز إضافية (مثلاً، بوكل أو الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)) في الحل خارج الخلية التي تحتوي على الجلوكوز 3 مم-
- قبل البدء تجربة، بريتريت كوفيرسليبس مع بولي-د-يسين بإضافة 30 ميليلتر من بولي-د-يسين الحل (1 ملغ/مل) إلى ساترة ح 1 ودقة الشطف مع ح 2 أولمبيك
ملاحظة: يمكن تخزين كوفيرسليبس بولي-يسين المغلفة في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
نقل - على الأقل 1 ساعة قبل هذه التجربة، باستخدام ماصة 1 مل، الجزر الصغيرة إلى طبق بتري 35 ملم تحتوي على الحل خارج الخلية مع الجلوكوز 3 مم. الاحتفاظ الجزر الصغيرة في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-
ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن أن يكون المسمى غشاء البلازما في هذه الخطوة. لتسمية غشاء البلازما، إضافة 2 ميكرومتر دي-8-عنب صبغ للحل خارج الخلية مع الجلوكوز 3 مم. احتضان الجزيرات في صبغ الحل ح 1 في 37 °C/5% CO 2. يمكن أن تكون متحمس صبغ غشاء البلازما في 488 نانومتر والكشف على 620 نانومتر.
إرفاق - دقيقة قبل البدء تجربة، ساترة قاعة التصوير بختم أنه مع الشحوم سيليكون فراغ. إصلاح قاعة التصوير إلى منصة التصوير. استخدام ماصة، ضع الجزيرات 20-30 في منطقة بولي-د-يسين-يعامل ساترة وترك الجزيرات الانضمام إلى السطح ل 20 دقيقة
ملاحظة: من المهم عدم السماح ساترة جاف تماما لتجنب الأضرار جزيرة ليلى. - في حين الجزر هي التمسك ساترة، إعداد نظام التروية قبل الشطف جيدا أنه بالمياه. إضافة كل حل لقناة مختلفة: الجلوكوز 3 مم (القناة الأولى)، 16 مم الجلوكوز (القناة الثانية)، الجلوكوز 16 ملم مع 100 ميكرومتر 3-إيسوبوتيل-1-زانتين (إيبمكس) وفورسكولين 10 ميكرون (القناة الثالثة)، 25 مم بوكل في الجلوكوز 3 مم (قناة 4)، 10 ميكرون ATP في 3 مم (الجلوكوز قناة 5). إزالة جميع فقاعات من النظام بفتح كل قناة على حدة، والسماح تدفق الحل لبضع دقائق، ويجب التأكد من أن التدفق متسقة (0.5 مل/دقيقة) وهو عدم حدوث أي تسرب الأنابيب-
- الاتصال سخان حل واحد مضمنة إلى أنبوب منفذ نضح وضبط درجة حرارة المخزن المؤقت الفائضة إلى 37 درجة مئوية. إعداد
- مضخة شفط. إزالة كافة الفقاعات من النظام، والتأكد من أن التدفق يتمشى وهو عدم حدوث أي تسرب الأنابيب-
- مجرد الجزيرات التمسك بالسطح ساترة، بلطف تملأ قاعة التصوير مع الحل خارج الخلية التي تحتوي على الجلوكوز 3 مم. تجنب غسل الجزر بعيداً عن سطح ساترة-
- وضع منهاج التصوير مع الجزر على خشبة المسرح مجهر وتوصيله إلى نظام التروية ومضخة شفط.
- بدوره على التدفق واستمرار نتخلل الجزر مع الجيل الثالث 3g الحل خارج الخلية. النظام جاهز الآن لتصوير [كنفوكل]-
- إعداد الحل خارج الخلية: إضافة 125 ملم كلوريد الصوديوم، 5.9 ملم بوكل، مم 2.56 كاكل 2، 1 مم مجكل 2، 25 مم هيبيس، 0.1% جيش صرب البوسنة، درجة الحموضة 7.4، عقيمة تصفيتها.
- [كنفوكل] تصوير
- تحديد موقع الجزر الصغيرة في مجال مجهر مع التكبير أقل. مرة واحدة تركز على الجزر الصغيرة، قم بالتبديل إلى أعلى تكبير الأهداف (مثلاً، والهدف غمر المياه X 63 (63 X/0.9 غ)).
- فتح الحصول على استخدام البرمجيات (جدول المواد)، وتنشيط وضع الماسح الضوئي رنانة.
- تحديد وضع التصوير إكسيزت وتكوين إعدادات اقتناء كما يلي:
- بدوره الأرجون ليزر والليزر 488 نانومتر خط وضبط السلطة الليزر إلى 50% للإثارة فلورين.
- جمع الانبعاثات في 505-555 نانومتر.
- اختر دقة 512 × 512 بكسل. اضغط " لايف " زر لبدء التصوير وضبط مستويات الربح (الربح نموذجي هو حوالي 600 V).
- تعيين بداية ونهاية z-المكدس: التركيز على رأس هذه الجزيرة الصغيرة، واختر " تبدأ " والانتقال إلى آخر الطائرة التي يمكن أن تركز وتختار " نهاية ". استخدام حجم z-خطوة 5 ميكرومتر. سيقوم البرنامج تلقائياً بحساب عدد الطائرات [كنفوكل]-
- تعيين الفاصل الزمني للحصول على كل كومة ض ما يقرب من 1.5-2 s واختر الخيار " اكتساب حتى توقف " للتصوير المستمر-
- اضغط " ابدأ " زر iniتياليزي.
- استخدام البروتوكولات التحفيز المختلفة لحمل الرقابة الحبيبية من بيرفوسينج الجزر مع المحفزات المطلوبة. بروتوكولات التحفيز يمكن تخصيصها لتناسب الغرض العلمي المنشود (انظر أدناه)-
- البروتوكولات التحفيز
ملاحظة: في كل بروتوكول التحفيز، ابدأ بتسجيل مالا يقل عن 2 دقيقة من جزيرة ليلى خلفية النشاط أثناء التروية المستمرة مع الحل خارج الخلية التي تحتوي على الجلوكوز 3 مم. نتخلل بمثابة منبه للفترة الزمنية المطلوبة. يمكن تخصيص النظام للمنشطات، والمدة للتحفيز وكذلك مدة التسجيلات لتناسب الأغراض العلمية المطلوبة. تأكد من يغسل الجزر جيدا مع الحل خارج الخلية التي تحتوي على الجلوكوز 3 مم قبل البدء تحفيز جديدة. أدناه تجد البروتوكولات التحفيز العينة التي استخدمت لإثبات قدرات أسلوب.- الحث مع كلوريد الأمونيوم (NH 4 Cl) كعنصر إيجابي فلورين الأس الهيدروجيني حساسية وكفاءة العدوى الفيروسية ( الشكل 3): الجلوكوز 3 مم (2 دقيقة) → 50 ملم NH 4 Cl (2 دقيقة) في الجلوكوز 3 مم → الجلوكوز 3 مم (2 دقيقة)
ملاحظة: استبدال في NH 4 الحل Cl، كلوريد الصوديوم على أساس اكويمولار- - الحث الأنسولين الحبيبية للرقابة عن طريق زيادة تركيز الجلوكوز ( رقم 5 و رقم 6): الجلوكوز 3 مم (2 دقيقة) → الجلوكوز 16 مم (15-30 دقيقة) → الجلوكوز 3 مم (2 دقيقة
ملاحظة: من أجل مشاهدة عدة رشقات نارية من النشاط، نتخلل الجزيرات باستمرار مع الحل ز 16 على الأقل 15 دقيقة
ملاحظة: من أجل زيادة الاتساق بين الاستجابات الافرازية 17، يمكن للمستخدمين إضافة عوامل رفع مخيم (100 ميكرومتر إيبمكس و 10 ميكرون فورسكولين) بحلول 16 الجيل الثالث والخاص على حد سواء. هذا لا يغير من أنماط الزمانية لإفراز الحبيبية. للاطلاع على التفاصيل انظر 15 و مناقشة-
- الحث مع كلوريد الأمونيوم (NH 4 Cl) كعنصر إيجابي فلورين الأس الهيدروجيني حساسية وكفاءة العدوى الفيروسية ( الشكل 3): الجلوكوز 3 مم (2 دقيقة) → 50 ملم NH 4 Cl (2 دقيقة) في الجلوكوز 3 مم → الجلوكوز 3 مم (2 دقيقة)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
العمل كله من الأسلوب الذي يظهر في الشكل 1. بإيجاز، يمكن المصابين إتش ترميز نبي-فلورين الماوس أو الجزر البشرية وتصويرها، بعد أيام قليلة في الثقافة، تحت مجهر [كنفوكل]. حبيبات تلتحم مع غشاء البلازما وفتح، يلاحظ زيادة في الأسفار ويمكن قياسها كمياً (الشكل 1). لتحديد ما إذا كان نبي-فلورين في الواقع أداة مناسبة لرصد ديناميات الحبيبية للأنسولين، كانت الجزر المصابة إيمونوستينيد مع الأجسام المضادة ضد التجارة والنقل، وجزيرة ليلى مختلف الهرمونات الأنسولين، سوماتوستاتين أو الجلوكاجون. وكانت معظم الزنزانات معربا عن نبي-فلورين (بروتينات فلورية خضراء إيجابية) خلايا بيتا كما أعربوا أيضا عن الأنسولين (~ 90 في المائة؛ الشكل 2 أ، 2). عدد قليل من خلايا ألفا الجلوكاجون-الإيجابية أو خلايا دلتا سوماتوستاتين-إيجابية كانت بروتينات فلورية خضراء المسمى (الشكل 2). ومن المهم، في الخلايا المصابة، الانصهار نبي كولوكاليزيد مع الأنسولين (معامل ارتباط Pearson لمن 0.61 ± 0.04 للأنسولين مقابل 0.21 ± 0.05 للتجارة والنقل والجلوكاجون و ± 0.07 0.01 السوماتوستاتين والتجارة والنقل والتجارة والنقل).
أظهرنا أن فلورين مجس pH فعالة، كزيادة درجة الحموضة داخل الخلايا مع 50 ملم NH4Cl أدى > زيادة 500% في الأسفار داخل الخلايا (الشكل 3A, 3B, 1 الفيديو). كما يزيد درجة الحموضة داخل الحبيبية عند الانصهار مع غشاء البلازما، وفتح المسام الانصهار، الحبيبات المحتوية على فلورين نبي تصبح مرئية على الظروف التي تحفز الأنسولين الرقابة مثل غشاء depolarization مع بوكل (الشكل 4، فيديو 2).
يمكن تصور أحداث الافرازية واحد في خلايا بيتا داخل الجزيرات سليمة مع تصوير مرور الزمن [كنفوكل] من الجزيرات نبي-فلورين المصابة. تحدث هذه ردا على depolarization الغشاء مباشرة مع بوكل أو عدة المنبهات الفسيولوجية الأخرى (رقم 4 و رقم 7، انظر أدناه). في تركيز الغلوكوز خارج الخلية القاعدية (3 مم)، لوحظ نشاط افرازي قليلاً. ومع ذلك، يتم تشغيل الحبيبية الانصهار مع غشاء البلازما استجابة للتحفيز مع ارتفاع الجلوكوز (16 ملم) (الشكل 5A، 3 فيديو). عن طريق وضع رويس بأحجام مختلفة وفي مناطق مختلفة، ويمكن مقارنة حركية استجابة حبيبات افرازية مع خلايا فردية أو مجموعات من الخلايا على مقربة من (الكتلة) (الشكل 5 (ب)). هذا النوع من التحليل مكن تحديد أن: 1) الأحداث الافرازية الفردية متزامنة ويفرزها للغاية في غضون ثوان قليلة من الاستجابة لخلية متوسط، وخلايا بيتا 2) على مقربة من تشكيل مجموعات وظيفية من النشاط متزامنة.
يحدث إفراز الأنسولين في الجسم بشكل نابض. حفز الجزيرات فلورين المصابات نبي مع تركيز الجلوكوز مرتفعة لفترات طويلة (15-20 دقيقة) أدت إلى البقول متعددة (أو رشقات نارية) لإفراز (الشكل 6، 4 الفيديو). أثناء كل نبضة، تلتحم الحبيبات الفردية مع غشاء البلازما بطريقة متزامنة كما هو موضح من قبل (الشكل 5). رشقات نارية من نشاط افرازي يمكن أن ينظر إلى كل دقيقة 3-4.
زيادة عابرة في الأسفار في نبي-فلورين يمكن أيضا ملاحظة حبيبات تحتوي على استجابة لمؤثر بورينيرجيك ATP (10 ميكرون) أو أستيل مؤثر المسكارينيه (منظمة العمل ضد الجوع، 10 ميكرون) (الشكل 7)، اللتين معروفة المنبهات من إفراز الأنسولين في الجزيرات البشرية. ديبولاريزيشن الغشاء مع بوكل (30 مم) كما هو متوقع، كما آثار الأنسولين الحبيبية الرقابة (الشكل 5). محفزات عدة يمكن تطبيقها على إعداد جزيرة ليلى نفسها طالما أن الجزر الصغيرة يتم غسلها جيدا ما بين المحفزات. تأكد من تغيير ترتيب التطبيق عند تكرار التجربة.
رقم 1. وضع مخطط يوضح المقايسة. إتش أن ترميز حساسة لدرجة الحموضة التجارة والنقل (فلورين) بالإضافة إلى نبي أنتجت واستخدمت لتصيب الماوس أو جزيرات البنكرياس البشرية. أربعة إلى ستة أيام بعد الإصابة، على ساترة الجزر الصغيرة وتصويرها تحت مجهر [كنفوكل] تستقيم المسح الضوئي الليزر. يتم التعبير عن بناء نبي-فلورين في حبيبات الأنسولين في خلايا بيتا. في الأسفار هو مروي في درجة الحموضة الحمضية حبيبات الأنسولين ناضجة ولكن يصبح مشرق عند الانصهار الحبيبية بغشاء البلازما والتعرض لدرجة الحموضة خارج الخلية محايد من 7.4.
رقم 2. بناء الانصهار نبي هو المعرب عنها في "حبيبات الأنسولين". (أ) الصور [كنفوكل] من الجزيرات البشرية سليمة المصابين نبي-فلورين، إيمونوستينيد للتجارة والنقل (الأخضر) والإنسولين (اللوحة اليسرى، أحمر)، سوماتوستاتين (الأوسط، أحمر) أو الجلوكاجون (حق، الأحمر). نواة الخلية تظهر باللون الأزرق (DAPI المسمى). تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. (ب) التحديد الكمي لجزء صغير من بروتينات فلورية خضراء-إيجابية الخلايا التي تحتوي أيضا على الأنسولين (Ins)، سوماتوستاتين (سوما) أو الجلوكاجون (غلو). SEMs ± يعني هو مبين، n = 5 الجزر الصغيرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. نبي-فلورين درجة حموضة فعالة استشعار. (أ) إسقاط القصوى للصور [كنفوكل] من جزيرة ليلى الماوس المصابين نبي-فلورين في الحل خارج الخلية التي تحتوي على الجلوكوز 3 مم قبل (اللوحة العلوية، الجيل الثالث 3g) وفي حضور 50 مم NH4Cl (أسفل اللوحة). شريط المقياس = 100 ميكرومتر- (ب) تتبع عرض التغيير في الأسفار متوسط كثافة (وحدات التعسفي) في جزيرة ليلى كله فعل NH4خط متقطع ألغ يشير إلى تطبيق Cl NH4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. الحبيبات المحتوية على فلورين نبي تصبح مرئية بمجرد أنها تلتحم مع غشاء البلازما وفتح- وقد إيسليتسينفيكتيد البشرية مع إتش نبي-فلورين إينكوباتاد مع غشاء البلازما صبغ دي-8-عنب (أحمر). جزيرة التحفيز مع بوكل (30 ملم) تسبب ظهور مفاجئ وعابر حبيبات الفلورسنت في سطح الخلية (يظهر باللون الأخضر). تظهر الصور [كنفوكل] من الخلايا داخل جزيرة ليلى بشرية في قبل الرد اكسوسيتوتيك (t = 0)، خلال (t = s 3-9) وبعد (t = 12 s). تم تعديل التباين لإزالة الخلفية الخضراء الأسفار. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5. مشغلات الجلوكوز عالية الانصهار فلورين نبي مع غشاء البلازما. (أ) إسقاط القصوى من الصور [كنفوكل] من جزيرة ليلى البشرية سليمة المصابين نبي-فلورين في تركيز الغلوكوز القاعدي (الجلوكوز ز 3-3 مم، غادر الفريق) أو في ارتفاع الجلوكوز (السكر ز 16-16 مم، اللوحة اليمنى). حلول خارج الخلية الواردة المخيم رفع وكلاء فورسكولين وإيبمكس (انظر البروتوكول للحصول على التفاصيل). شريط المقياس = 10 ميكرون. (ب) آثار عرض التغييرات في الأسفار متوسط كثافة (وحدات التعسفي) في قناة الأخضر في رويس توضع حول أحداث الافرازية واحد (الأحمر، الحبيبية)، خلايا (الأخضر) أو مجموعات خلايا (أزرق). طبق الجلوكوز مرتفعة لمدة 5 دقائق بعد ~ 2.5 دقيقة في الجيل الثالث 3g. تم تطبيع القيم الأسفار إلى قيمة الأسفار الأولى (الأساس). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6. أحداث الافرازية توليد نبضات منفصلة من إفراز عند ارتفاع الجلوكوز. يعني آثار عرض التغييرات في كثافة الفلورية (وحدات التعسفي) في رويس توضع حول خلايا مختلفة ضمن جزيرة بشرية سليمة خلال التحفيز المستمر مع الجلوكوز 16 مم. يمثل كل لون خلية مفردة. يمكن أن يكون انفجار نشاط افرازي ينظر كل دقيقة 3-4 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7. نبي-فلورين الانصهار مع غشاء البلازما يتم تشغيلها بواسطة "المنبهات المعروفة لإفراز الأنسولين". آثار عرض التغييرات في الأسفار متوسط الشدة (وحدات التعسفي) في رويس توضع حول الأحداث الافرازية الفردية في الخلايا داخل سليمة الجزيرات البشرية الناجمة عن بوكل (30 مم)، ATP (10 ميكرومتر)، ارتفاع الجلوكوز (ز 16، 16 مم) واستيل (منظمة العمل ضد الجوع، 10 ميكرومتر). وطبقت بوكل و ATP في تركيز الغلوكوز القاعدي (3 مم). إظهار خطوط سوداء الحبيبية متوسط وخطوط رمادية تعكس القيم ووزارة شؤون المرأة. وتظهر آثار الأخضر استجابة الخلايا المطابقة. مقياس الوقت الأفقي (2 دقيقة) ينطبق على جميع الرسوم البيانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
فيديو 1. نبي-فلورين إتش كفاءة تصيب جزيرة الخلايا وتغيرات درجة الحموضة الإحساس.
أصيبوا الجزيرات الماوس لمدة 4 أيام مع إتش ترميز نبي-فلورين. كانت الجزر الصغيرة المصابة على ساترة والتي شنت على قاعة التصوير. لزيادة درجة الحموضة داخل الخلايا، كانت perfused في الجزر الصغيرة مع 50 ملم NH4Cl يضاف إلى الحل خارج الخلية التي تحتوي على الجلوكوز 3 مم. ويمكن رؤية حدوث زيادة سريعة وقوية في الأسفار عند تطبيق Cl NH4. شريط المقياس = 100 ميكرومتر-سرعة الفيلم = 5 fps. المدة الإجمالية للفيلم 90 س. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
فيديو 2. الحبيبات المحتوية على فلورين نبي تصبح مرئية بمجرد أنها تلتحم مع غشاء البلازما ومفتوحة.
كانت المحتضنة الجزيرات البشرية المصابة مع إتش فلورين نبي مع غشاء البلازما صبغ دي-8-عنب. التحفيز جزيرة ليلى مع بوكل (30 ملم) تسبب ظهور مفاجئ وعابر حبيبات الفلورسنت على سطح الخلية. ويرد إسقاط قصوى للطائرات [كنفوكل]. تم تعديل التباين لإزالة الخلفية الخضراء الأسفار. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. فيلم السرعة = 5 fps. المدة الإجمالية للفيلم 60 س. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
فيديو 3. الرقابة المشغلات الجلوكوز عالية من الحبيبات المحتوية على فلورين نبي.
يتم تشغيل انصهار حبيبات المحتوية على فلورين نبي استجابة للتحفيز مع ارتفاع الجلوكوز (16 مم). في تركيز الغلوكوز خارج الخلية القاعدية (3 مم)، لوحظ نشاط افرازي قليلاً. ومع ذلك، عند ارتفاع السكر، حبيبات الأنسولين تظهر عابر في غشاء بلازما خلايا مختلفة في جزيرة ليلى بطريقة متزامنة. طبق الجلوكوز عالية بعد ~ 2.5 دقيقة في الجيل الثالث 3g (تظهر التسمية ز 16). ويرد إسقاط قصوى للطائرات [كنفوكل]. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. سرعة الفيلم = 10 إطارا في الثانية. المدة الإجمالية للفيلم هو الحد الأدنى 7 الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
فيديو 4. التحفيز طويلة مع ارتفاع الجلوكوز مشغلات عدة رشقات نارية من الرقابة.
التحفيز طويلة مع ارتفاع الجلوكوز يثير نبضات متعددة من الجزيرات إفراز، يظهر من خلالها حبيبات عابر. يمكن رؤية النبضات نشاط افرازي كل ~ تظهر الطائرة [كنفوكل] 3-4 الحد الأدنى من جزيرة ليلى البشرية. تم تطبيق نظام بسيودوكولور لشدة الأسفار. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. فيلم السرعة = 30 إطارا في الثانية. المدة الإجمالية للفيلم 20 دقيقة الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويصف هذه المخطوطة تقنية التي يمكن استخدامها لتصور الرقابة حبيبات الأنسولين في خلايا بيتا في جزيرات البنكرياس سليمة بالفحص المجهري [كنفوكل]. فإنه يستخدم فلورين نبي كمراسل الفلورسنت المستنسخة في إتش للتأكد من كفاءة تعداء عالية.
ورغم أن الأسلوب كفاءة عالية في أيدينا، قد تتطلب بعض التعديلات التي تعتمد أساسا على معلمتين من معلمات: 1) نوعية إعداد جزيرة ليلى، وعيار 2) المخزون الفيروسية مع الاستغلال الأمثل لظروف الإصابة. قبل العدوى الفيروسية للجزر الصغيرة، السماح بإعداد جزيرة ليلى للتعافي من الإجهاد العزل والنقل بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. فحص مورفولوجية الجزيرة تحت مجهر خفيفة طوال فترة العدوى/التعبير والاختيار لعلامات على استمرارية انخفاض مثل خلايا بارزة من سطح جزيرة ليلى أو وجود خلايا التاكسج (أغمق الخلايا) في مركز جزيرة ليلى18 . قد تختلف كل الأسهم الفيروسية في كفاءة عيار والعدوى. تأكد من ضبط مستوى الصوت للفيروس المستخدمة وفقا لعيار الفيروسية والوقت من الثقافة قبل الفحص المجهري. أن الخطوة الأكثر أهمية هي الأمثل لظروف الإصابة (مثلاً، عدد الجسيمات الفيروسية، وقت الثقافة قبل الفحص) حيث أن تعرب اللجنة ما يكفي من المراسل وهي الحفاظ على سلامة جزيرة ليلى والقدرة على الاستجابة. عند تحسين البروتوكول العدوى، ومع كل دفعة جديدة الفيروسية، جمع بعض الجزر الصغيرة في نقاط زمنية مختلفة والتحقق من ما إذا كان يمكن أثارت الرقابة مع بوكل (30 مم) و/أو ارتفاع الجلوكوز (16 مم). وجدنا أن الإنزيم يعمل بشكل أفضل وخلايا الجزيرة تبقى صحية ومدد الجلوكوز تستجيب عند وزارة الداخلية منخفضة (حوالي 2) والوقت الثقافة (حوالي 5 أيام) لزيادة مستويات التعبير بناء الانصهار. وتتماشى النتائج التي توصلنا إليها دراسة سابقة تبين أن التعبير الفعال لمنتجات الجينات يمكن تحقيق أفضل في تركيزات أقل ترانسفيكتينج ناقل أدينوفيرال مع الحفاظ على جزيرة ليلى الدالة19.
بيد أن هذه التقنية على بعض القيود. واحد أنه باستخدام فلورين نبي كمراسل، لا يمكن تصور حبيبات قبل أنها تلتحم مع غشاء البلازما ويفتح المسام الانصهار. دراسة الاتجار الحبيبية الأنسولين بدلاً من الرقابة، يمكن استخدام إتش ترميز نبي-اجفب بدلاً من ذلك. قيد آخر، إلى حد أقل، يمكن أن تكون مستهدفة نبي-فلورين إلى حبيبات تحتوي على غير الأنسولين. ومع ذلك، معظم الخلايا التي كانوا مصابين بنبي-فلورين أعرب أيضا عن الأنسولين وأقل من 10% من الخلايا وأعرب عن الجلوكاجون أو سوماتوستاتين. والواقع أن التبعية الجلوكوز إفراز الحبيبية، ونمط نابض والتعريب المشارك مع الأنسولين، أشارت إلى أن تمثل أهم الأحداث الافرازية الإفراج عن البضائع من حبيبات الأنسولين. لضمان رصد الأنسولين يحدث الرقابة، يجب القيام الفحص تحت الظروف التي تحفز إفراز الأنسولين (مثل، ارتفاع الجلوكوز). ومع ذلك، يمكن أن تحسين خصوصية التعبير خلية بيتا، نبي-فلورين تحت سيطرة أحد المروجين أكثر انتقائية مثل المروج الأنسولين الفئران. قيد آخر من هذا الأسلوب هو أنه يتطلب التعبير عن البروتينات الخارجية في حبيبات الأنسولين، الذي يمكن التشويش على نشوء حيوي و/أو السلوك20. ينبغي النظر في ذلك عند تفسير نتائج التجارب، وإذا كان ذلك ممكناً، الاستنتاجات التي يجب التحقق من استخدام البروتينات البضائع الحبيبية الأنسولين الأخرى (مثلاً، ج-الببتيد، ببتيد اميلويد جزيرة ليلى) كالصحفيين.
كما يوصي هذا البروتوكول بما في ذلك عوامل رفع مخيم (إيبمكس وفورسكولين) تحفيز آثار ارتفاع السكر على الأنسولين الحبيبية للرقابة. يحاكي هذا البروتوكول تنشيط تفعيل سبل زيادة الناحية الفسيولوجية ذات الصلة (المشغلة بواسطة إينكريتينس أو باراكريني وجزيئات إرسال الإشارات العصبية) تحفيز إفراز الأنسولين عن طريق زيادة معسكر في خلايا بيتا البنكرياس. ومع ذلك، نظراً لغياب معسكر رفع وكلاء، يتسبب ارتفاع الجلوكوز (16 ملم) أيضا الرقابة الحبيبية لكن عدد الأحداث الافرازية ولاحظ أقل. لا تزال تظهر حبيبات رشقات نارية منفصلة، متزامنة مع استجابة الخلية متوسط، وإظهار فترات الاندفاع مماثلة: دقيقة 1.4-6.6 في ارتفاع الجلوكوز بالإضافة إلى إيبمكس/فورسكولين مقابل 1.5-10 دقيقة في ارتفاع الجلوكوز وحدها.
الفحص الموصوفة هنا هامة فيما يتعلق بالأساليب القائمة كما كان القرار المكانية والزمانية يكفي لتصور الأحداث الانصهار واحد في الوقت الحقيقي في خلايا بيتا داخل الجزيرات سليمة. على سبيل المثال، كشفت التزامن عالية مع الأنسولين التي تم إصدارها حبيبات في الجزيرات البشرية عند تنشيط الجلوكوز. وعلاوة على ذلك، إذا تم إرفاق الجزيرات جيدا ساترة، أنهم يمكن تصويرها لفترات طويلة (15-20 دقيقة على الأقل). هذا وكان يستخدم لإظهار أن الرقابة في الجزيرات البشرية يحدث في رشقات نارية المتميزة التي تظهر في فترات مماثلة لتلك التي نابض في فيفو إفراز الأنسولين. كما يسمح الفحص لاختبار أثر العديد من المحفزات على الرقابة الأنسولين استخدام الجزر مورين أو البشرية. وعلاوة على ذلك، نظراً لأنها لا تتطلب جزيرة خلية الانفصال مثل أساليب أخرى، يمكن تطبيقها لدراسة سلوك السكان خلية بيتا داخل جزيرة ليلى. وفي الواقع، لاحظنا أن خلايا بيتا المجاورة تشكيل مجموعات من ~ 5-10 خلايا التي يتم مزامنة النشاط. خلايا بيتا من نفس الكتلة ربما تقترن بالفجوة تقاطع القنوات المصنوعة من كونيكسين 3621. ويوضح استجابتها متزامنة اتصال خلايا بيتا التي لا غنى عنها ل إفراز الأنسولين المناسب22.
في المستقبل، يمكن دمج هذه التقنية مع سائر الأصباغ الفلورية للتصوير الوظيفي لتصور في الوقت الحقيقي كيف التغييرات في الكالسيوم سيتوسوليك أو غشاء المحتملة، على سبيل المثال، ترتبط بالرقابة الحبيبية في خلايا بيتا. على وجه الخصوص، أصبحت تتوفر14،23 الجديدة الرقم الهيدروجيني الحساسة الأحمر نيون البروتينات ويمكن أن تنصهر فيها إلى نبي أو البروتينات البضائع الحبيبية الأنسولين الأخرى، يمكن استخدام الأصباغ الخضراء لتصوير الوظيفية. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع نموذج ماوس للتصوير في فيفو من الجزيرات vascularized زرعها في الغرفة الأمامية ل العين الماوس24. الجزر الصغيرة يمكن أن تكون مصابة غدية ح 48-72 قبل زرعها في العين. وينبغي استخدام الفئران القصور المناعي إذا هي زرع الجزيرات البشرية. باستخدام هذا النموذج، يمكن أن يرتبط نمط إفراز الأنسولين الحبيبية سوبسيلولار المكانية مع ترتيبات الأوعية الدموية25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن الكتاب لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون مارسيا بولينا من حديد الاختزال المباشر التصوير المرافق الأساسية للحصول على مساعدة مع المجاهر. وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منح 1K01DK111757-01 (جا)، F31668418 (ملم)، R01 DK111538، R33 ES025673 و R56 DK084321 (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
References
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
- Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
- Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
- Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
- Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478 (2011).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
- Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
- Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
- Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801 (2015).
- Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632 (2015).
- Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
- Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
- Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
- Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target? Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
- Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).
![[كنفوكل] التصوير من Neuropeptide Y-فلورين: تقنية لتصور الأنسولين الحبيبية للرقابة في الجزيرات سليمة مورين والبشرية](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/56089.jpg)
