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Biology

Neuropeptide Y-pHluorin की फोकल इमेजिंग: बरकरार Murine और मानव टाप में इंसुलिन दाना Exocytosis कल्पना करने के लिए एक तकनीक

Published: September 13, 2017 doi: 10.3791/56089
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1
1Department of Medicine, University of Miami, 2Department of Medicine, University of Toronto

Summary

हम बरकरार pHluorin, एक पीएच के प्रति संवेदनशील हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग कर टाप में इंसुलिन exocytosis के दृश्य के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । पृथक टाप पुटिका कार्गो neuropeptide Y को युग्मित pHluorin एडीनोवायरस एंकोडिंग से संक्रमित होते हैं । यह फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा इंसुलिन दाना फ्यूजन की घटनाओं का पता लगाने के लिए अनुमति देता है ।

Abstract

इंसुलिन स्राव सामान्य शारीरिक स्थितियों के तहत ग्लूकोज homeostasis में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है और साथ ही रोग में. इंसुलिन दाना exocytosis का अध्ययन करने के लिए वर्तमान दृष्टिकोण या तो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट पत्रकारों की अभिव्यक्ति के लिए युग्मित का उपयोग करें । हालांकि इन तकनीकों के अधिकांश क्लोनिंग सेल लाइनों के लिए अनुकूलित किया गया है या dissociating अग्नाशय के टाप की आवश्यकता होती है । इसके विपरीत, यहाँ प्रस्तुत विधि बरकरार अग्नाशय के टाप में इंसुलिन दाना exocytosis के वास्तविक समय दृश्य के लिए अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल में, हम पहले एडीनोवायरस के साथ पृथक अग्नाशय के टाप के वायरल संक्रमण का वर्णन है कि encodes एक पीएच-संवेदनशील ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP), pHluorin, neuropeptide Y (NPY) के लिए युग्मित । दूसरा, हम वायरल संक्रमण के बाद पांच दिनों के टाप के फोकल इमेजिंग का वर्णन है और कैसे इंसुलिन दाना स्राव की निगरानी करने के लिए । संक्षेप में, संक्रमित टाप एक coverslip पर एक इमेजिंग चैंबर पर रखा जाता है और एक ईमानदार लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप के तहत imaged करते हुए लगातार विभिंन उत्तेजनाओं युक्त extracellular समाधान के साथ perfused जा रहा है । फोकल छवियां फैले ५० टाप के µm एक फास्ट-गुंजयमान स्कैनर का उपयोग कर समय-चूक रिकॉर्डिंग के रूप में प्राप्त कर रहे हैं । प्लाज्मा झिल्ली के साथ इंसुलिन granules का फ्यूजन समय के बाद किया जा सकता है । यह प्रक्रिया भी एक प्रयोग में उत्तेजनाओं की बैटरी के परीक्षण के लिए अनुमति देता है, दोनों माउस और मानव के साथ संगत है, और कार्यात्मक इमेजिंग के लिए विभिंन रंगों के साथ जोड़ा जा सकता है (उदा., झिल्ली की क्षमता या cytosolic कैल्शियम रंजक) ।

Introduction

अग्नाशय के टाप की बीटा कोशिकाओं द्वारा इंसुलिन का उत्पादन किया जाता है और यह ग्लूकोज चयापचय1का एक प्रमुख नियामक है । मौत या बीटा कोशिकाओं की शिथिलता ग्लूकोज homeostasis परेशान करता है और मधुमेह के लिए सुराग2. इंसुलिन एक Ca2 +-निर्भर तरीके से3में जारी कर रहे हैं कि घने कोर granules में पैक किया जाता है । Elucidating कैसे इंसुलिन दाना exocytosis विनियमित है इंसुलिन स्राव निर्धारित करता है और मधुमेह के उपचार के लिए उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान के लिए नए रास्ते को खोलता है क्या पूरी तरह से समझने के लिए आवश्यक है.

इंसुलिन exocytosis बड़े पैमाने पर इस तरह झिल्ली समाई माप के रूप में electrophysiological दृष्टिकोण, का उपयोग कर अध्ययन किया गया है, और फ्लोरोसेंट अणुओं के साथ संयोजन में सूक्ष्म दृष्टिकोण. झिल्ली समाई माप अच्छा लौकिक संकल्प किया है और एकल सेल रिकॉर्डिंग की अनुमति देते हैं । हालांकि, समाई में परिवर्तन सेल के शुद्ध सतह परिवर्तन को प्रतिबिंबित और व्यक्तिगत संलयन घटनाओं पर कब्जा नहीं है या अन्य गैर इंसुलिन स्रावी बुलबुले से इंसुलिन दाना संलयन भेद3. सूक्ष्म दृष्टिकोण, जैसे दो फोटॉन या कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) फ्लोरोसेंट जांच और पुटिका कार्गो प्रोटीन के साथ संयोजन में माइक्रोस्कोपी, अतिरिक्त विस्तार प्रदान करते हैं । इन तकनीकों एकल exocytotic घटनाओं पर कब्जा और भी पूर्व और बाद exocytotic चरणों और कोशिकाओं की आबादी में exocytotic पैटर्न का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है3.

फ्लोरोसेंट रिपोर्टर तीन प्रकार के हो सकते हैं: 1) extracellular, 2) cytoplasmic, या 3) vesicular । 1) Extracellular संवाददाताओं ध्रुवीय अनुरेखक हैं (जैसे, dextrans, sulforhodamine बी (SRB), लूसिफ़ेर पीला, pyranine) कि Extracellular वातावरण4के माध्यम से पेश किया जा सकता है. ध्रुवीय अनुरेखकों का उपयोग कोशिकाओं की आबादी में फ्यूजन ताकना की जांच के लिए अनुमति देता है और इस तरह के रक्त वाहिकाओं के रूप में विभिन्न सेलुलर संरचनाओं कब्जा. हालांकि, वे पुटिका कार्गो व्यवहार पर रिपोर्ट नहीं है । 2) Cytoplasmic पत्रकारों फ्लोरोसेंट जांच झिल्ली-जुड़े प्रोटीन है कि कोशिका चेहरा और डॉकिंग और exocytosis में शामिल है करने के लिए युग्मित कर रहे हैं । उदाहरण घुलनशील N-ethylmaleimide-संवेदनशील कारक अनुलग्नक प्रोटीन रिसेप्टर (जाल) परिवार है कि सफलतापूर्वक न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज5अध्ययन के लिए तंत्रिका विज्ञान में इस्तेमाल किया गया है के सदस्यों में शामिल हैं । इस तरह के प्रोटीन कई बाध्यकारी भागीदारों है और इंसुलिन-granules विशिष्ट नहीं हैं । 3) Vesicular पत्रकारों फ्लोरोसेंट जांच कार्गो विशिष्ट पुटिका व्यवहार की जांच के लिए अनुमति देते है कि Vesicular कार्गो प्रोटीन से जुड़े रहे हैं । इंसुलिन-दाना विशिष्ट कार्गो प्रोटीन शामिल इंसुलिन, सी पेप्टाइड, टाप amyloid पॉलीपेप्टाइड, और NPY दूसरों के बीच में6,7. NPY केवल इंसुलिन युक्त granules में मौजूद है, और इंसुलिन के साथ सह-जारी है, यह एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर8के लिए एक उत्कृष्ट भागीदार बना ।

NPY के लिए अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन का फ्यूजन पहले neuroendocrine कोशिकाओं में exocytosis के विभिंन पहलुओं का अध्ययन करने के लिए कार्यरत किया गया है, जैसे विशिष्ट synaptotagmin isoforms की आवश्यकता के रूप में9,10 और कैसे समय-रिहाई के पाठ्यक्रम actin cytoskeleton पर और मायोसिन द्वितीय11,12पर निर्भर करता है । इस अध्ययन में, हम फ्लोरोसेंट रिपोर्टर, जो एक संशोधित GFP है कि गैर घने कोर granules के अंदर अंलीय पीएच पर फ्लोरोसेंट है लेकिन तटस्थ extracellular पीएच13के लिए जोखिम पर चमकीले फ्लोरोसेंट हो जाता है के रूप में pHluorin चुना । परिपक्व इंसुलिन granules ५.५ नीचे एक अंलीय पीएच है । एक बार granules प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ़्यूज़ और खोलता है, इसके कार्गो ७.४ के तटस्थ extracellular पीएच को उजागर कर रहा है, पीएच-संवेदनशील प्रोटीन के उपयोग की अनुमति एक रिपोर्टर7,14के रूप में pHluorin ।

pHluorin के पीएच संवेदनशील प्रकृति और इंसुलिन granules में NPY की चयनात्मक अभिव्यक्ति को ध्यान में रखते हुए, NPY-pHluorin संलयन निर्माण इंसुलिन दाना exocytosis के विभिन्न गुणों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । फ्यूजन की वायरल डिलिवरी का निर्माण उच्च अभिकर्मक दक्षता सुनिश्चित करता है और प्राथमिक बीटा कोशिकाओं या सेल लाइनों पर के रूप में अच्छी तरह के रूप में पृथक टाप पर काम करती है । इस विधि भी NPY युक्त बुलबुले के साथ किसी भी अंय कोशिका प्रकार में exocytosis अध्ययन के लिए एक दिशानिर्देश के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । यह भी कुछ शर्तों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किसी भी ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के साथ संयुक्त किया जा सकता है (knockdowns, एक्सप्रेस, आदि) exocytosis पर. इस तकनीक को पहले मानव टाप15में बीटा कोशिका आबादी में इंसुलिन दाना स्राव के स्थानिक और लौकिक पैटर्न की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया है ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > मियामी यूनिवर्सिटी की एनिमल एथिक्स कमेटी ने सभी प्रयोगों को मंजूरी दे दी है ।

< p class = "jove_title" > 1. बरकरार पृथक मानव या माउस के वायरल संक्रमण अग्नाशय टाप करता है

  1. टाप कल्चर: टाप कल्चर मीडिया तैयार करें: कनाट मेडिकल रिसर्च लेबोरेटरीज (CMRL) १०६६, 10% (v/v) FBS और 2 mM L-Glutamine ।
    1. मानव अग्नाशय टाप इंटीग्रेटेड टाप डिस्ट्रीब्यूशन प्रोग्राम (NIDDK, NIH) से प्राप्त कर रहे हैं । आगमन पर, टाप (~ ५०० टाप समकक्ष) करने के लिए ३५ मिमी गैर ऊतक संस्कृति इलाज पेट्री व्यंजन 2 एमएल CMRL कल्चरल मीडिया के साथ ३७ & #176; सी, 5%/95% कं 2 /O 2 के लिए 24 ज वायरल संक्रमण से पहले ।
    2. माउस अग्नाशय के टाप पहले स्थापित प्रोटोकॉल के बाद अलग किया जा सकता < सुप वर्ग = "xref" > १६ . अलगाव के बाद, संस्कृति ~ २०० टाप समकक्षों में ३५-mm नॉन-टिशू कल्चर का इलाज पेट्री डिश के साथ 2 एमएल CMRL कल्चरल मीडिया में ३७ & #176; सी, 5%/95% कं 2 /O 2 के लिए 24 ज वायरल संक्रमण से पहले.
      नोट: GFP या YFP NPY के साथ प्रतिदीप्ति ओवरलैप से बचने के लिए टाप पर व्यक्त पत्रकारों के साथ ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करने से बचें pHluorin.
  2. विषाणु वडा
    नोट: NPY-pHluorin फ्यूजन pcDNA3 वेक्टर में क्लोन किया गया था < सुप वर्ग = "xref" > 10 और adenoviral उत्पादन के लिए एक adenoviral वेक्टर में उपक्लोन [एडीनोवायरस सीरोटाइप 5 (DE1/E3)] द्वारा एक संयोजक एडीनोवायरस निर्माण कंपनी । वायरस aliquoted और संग्रहित किया गया था-८० & #176; C. वायरल शेयर कंपनी द्वारा 10 12 से 10 13 वायरल कणों (~ 3 एक्स 10 10 -3 एक्स 10 11 PFU) के titers पर उपलब्ध कराया गया है ।
    1. for इन विट्रो में टाप इंफेक्शन, प्रयोग 10 6 PFU/एमएल, लगभग 2 के संक्रमण (मुि) की एक अनुमानित बहुलता में जिसके परिणामस्वरूप (देखें चर्चा के लिए विवरण)
    3. अग्नाशय के टाप
    का
  3. वायरल इंफेक्शन चेतावनी: एडिनोवायरस के साथ काम करने के लिए सुरक्षा स्तर 2 (BSL2) प्रक्रियाओं और प्रमाणन की आवश्यकता है । BSL2 प्रक्रियाओं पर मार्गदर्शन और प्रशिक्षण के लिए संस्थागत सुरक्षा अधिकारी के साथ की जाँच करें ।
    1. ऊपर बताए अनुसार मानव/माउस टाप तैयार करें ।
    2. Add 5-10 & #181; स्टॉक वायरस के प्रत्येक ३५-mm पेट्री डिश को CMRL कल्चरल मीडिया के 2 एमएल (10% FBS और 2 मिमी L-Glutamine के साथ) में मानव/
      नोट: कंपनी डेटा पत्रक द्वारा प्रदान की गई के रूप में वायरल titer के अनुसार इस्तेमाल किया वायरस की मात्रा को समायोजित करें ।
    3. कल्चर ऑन वायरस युक्त टाप ऑफ मीडिया में ३७ & #176; C/5% कं 2 के लिए 24 ज.
    4. 24 एच के बाद, वायरस युक्त मीडिया महाप्राण और 2 मिलीलीटर CMRL संस्कृति मीडिया के साथ प्रतिस्थापित (10% FBS और 2 मिमी एल-Glutamine के साथ).
    5. कल्चर को 4-6 दिन के लिए टाप पर ३७ & #176; C/5% कं 2 , मीडिया की जगह हर 3 दिन.
      6. संवर्धन के 4-6 दिनों के बाद
    6. , टाप कोशिकाओं के 30% के आसपास की अपेक्षा संक्रमित होना । इसके बाद लाइव इमेजिंग प्रयोगों के लिए टाप का इस्तेमाल किया जा सकता है ।
< p class = "jove_title" > 2. संक्रमित टाप की फोकल इमेजिंग

< p class = "jove_content" > नोट: सामग्री और फोकल इमेजिंग के लिए आवश्यक उपकरणों के लिए सामग्री के तालिका को देखें ।

  1. रिएजेंट वडा र प्रयोगात्मक सेटअप
    1. तैयार extracellular समाधान: जोड १२५ mm NaCl, ५.९ mm KCl, २.५६ mm CaCl 2 , 1 mm MgCl 2 , 25 mm HEPES, ०.१% BSA, पीएच ७.४, बाँझी छान.
      नोट: इस बफर ग्लूकोज के बिना सामान्य रूप से तैयार है और 4 & #176; C पर 1 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है । वांछित अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए प्रयोग के दिन ग्लूकोज जोड़ा जाता है ।
      1. तैयार बेसल ग्लूकोज (3 मिमी) मध्यम: जोड़ें ७५ & #181; एल के 2 एम ग्लूकोज स्टॉक करने के लिए ५० मिलीलीटर की extracellular समाधान.
      2. Hyperglycemic (16 एमएम) मीडियम: add ४०० & #181; एल ऑफ 2 एम ग्लूकोज स्टॉक टू ५० एमएल ऑफ extracellular सॉल्यूशन
    2. 3 मिमी ग्लूकोज युक्त KCl समाधान में किसी भी अतिरिक्त उत्तेजना ( जैसे , adenosine या ट्राइफॉस्फेट extracellular (एटीपी)) को पतला.
      3. एक प्रयोग शुरू करने से पहले
    3. , पाली-डी-lysine के साथ coverslips को जोड़कर 30 & #181; पाली-डी-lysine सॉल्यूशन (1 mg/एमएल) के एल coverslip को 1 ज के लिए और अच्छी तरह से यह h 2 के साथ धोने के लिए.
      नोट: पाली-lysine लेपित coverslips को 6 महीने तक कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है ।
      4. प्रयोग करने से पहले कम से
    4. 1 ज, एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर, 3 मिमी ग्लूकोज के साथ extracellular समाधान युक्त एक ३५ मिमी पेट्री डिश के लिए टाप स्थानांतरण । टाप पर रखें ३७ & #176; ग र 5% सह 2 .
      नोट: यदि आवश्यक हो, प्लाज्मा झिल्ली इस कदम में लेबल किया जा सकता है । प्लाज्मा झिल्ली को लेबल करने के लिए, 3 मिमी ग्लूकोज के साथ extracellular समाधान के लिए 2 & #181; M di-8-ANEPP डाई जोड़ें । डाई समाधान में टाप 1 ज के लिए ३७ & #176; C/5% कं 2 । प्लाज्मा झिल्ली डाई ४८८ एनएम पर उत्साहित किया जा सकता है और ६२० एनएम पर पता लगाया ।
      5. एक प्रयोग शुरू करने से पहले
    5. मिन, यह वैक्यूम सिलिकॉन तेल के साथ सील करके इमेजिंग चैंबर के लिए coverslip संलग्न । इमेजिंग कक्ष इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म को ठीक करें । एक पिपेट का प्रयोग, coverslip के पाली-डी-Lysine-इलाज क्षेत्र पर 20-30 टाप प्लेस और दो टाप 20 मिनट के लिए सतह के लिए पालन करते हैं ।
      नोट: टाप नुकसान से बचने के लिए coverslip को पूरी तरह सूखने नहीं देना जरूरी है ।
    6. जबकि टाप coverslip का पालन कर रहे हैं, इसे पानी के साथ अच्छी तरह से कुल्ला करके छिड़काव प्रणाली तैयार करें । एक अलग चैनल के लिए प्रत्येक समाधान जोड़ें: 3 मिमी ग्लूकोज (चैनल 1), 16 मिमी ग्लूकोज (चैनल 2), १०० & #181 के साथ 16 मिमी ग्लूकोज; एम 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) और 10 & #181; m forskolin (चैनल 3), 25 मिमी KCl में 3 मिमी ग्लूकोज (चैनल 4), 10 & #181; एम एटीपी 3 मिमी ग्लूकोज में ( चैनल 5) । प्रत्येक चैनल अलग खोलने और कुछ मिनट के लिए समाधान प्रवाह दे द्वारा सिस्टम से सभी बुलबुले निकालें, और सुनिश्चित करें कि प्रवाह संगत है (०.५ मिलीलीटर/) और टयूबिंग लीक नहीं कर रहा है ।
    7. छिड़काव आउटलेट ट्यूब के लिए एक इनलाइन समाधान हीटर कनेक्ट और बहिर्वाह बफर के तापमान को समायोजित करने के लिए ३७ & #176; C.
    8. सक्शन पंप तैयार करते हैं । सिस्टम से सभी बुलबुले निकालें, और सुनिश्चित करें कि प्रवाह संगत है और टयूबिंग लीक नहीं कर रहा है ।
    9. एक बार टाप coverslip सतह का पालन, धीरे extracellular 3 मिमी ग्लूकोज युक्त समाधान के साथ इमेजिंग चैंबर भरें । coverslip की सतह से दूर टाप धोने से बचें ।
    10. माइक्रोस्कोप मंच पर टाप के साथ इमेजिंग मंच जगह और यह छिड़काव प्रणाली और सक्शन पंप से कनेक्ट.
    11. को फ्लो पर टर्न करता है और लगातार perfuse को 3जी extracellular सॉल्यूशन के साथ टाप करता है । सिस्टम अब फोकल इमेजिंग के लिए तैयार है ।
  2. फोकल इमेजिंग
    1. कम आवर्धन के साथ माइक्रोस्कोप क्षेत्र में टाप का पता लगाएँ । एक बार टाप पर केंद्रित, उच्च आवर्धन उद्देश्यों के लिए स्विच ( जैसे , 63X जल विसर्जन उद्देश्य (63X/0.9 NA)) ।
    2. सॉफ्टवेयर (सामग्री के तालिका) का उपयोग कर अधिग्रहण खोलें और गुंजयमान स्कैनर मोड को सक्रिय करें ।
    3. XYZT इमेजिंग मोड का चयन करें और प्राप्ति सेटिंग्स निम्नानुसार कॉन्फ़िगर:
      1. आर्गन लेजर और ४८८ एनएम लेजर लाइन पर बारी और pHluorin उत्तेजना के लिए ५०% करने के लिए लेजर पावर समायोजित करें ।
      2. ५०५-५५५ एनएम में उत्सर्जन इकट्ठा ।
      3. ५१२ x ५१२ पिक्सेल का रिज़ॉल्यूशन चुनें । दबाएँ & #34; Live & #34; बटन इमेजिंग शुरू करने के लिए और लाभ के स्तर को समायोजित (ठेठ लाभ ६०० वी के आसपास है).
      4. z-स्टैक के आरंभ और अंत को सेट करें: टाप के शीर्ष पर फ़ोकस करना और & #34 का चयन करना; आरंभ & #34; और अंतिम विमान में ले जाएं जिसे ध्यान केंद्रित किया जा सके और & #34; end & #34; । z-step आकार का उपयोग 5 & #181; m. सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से फोकल विमानों की संख्या की गणना करेगा ।
      5. १.५-2 s के लिए करीब प्रत्येक z-स्टैक के अधिग्रहण के लिए समय अंतराल सेट करें और विकल्प & #34 चुनें; मोल तक रोके & #34; सतत इमेजिंग के लिए.
      6. प्रेस द & #34; स्टार्ट & #34; बटन को initialize
    4. वांछित उत्तेजनाओं के साथ टाप perfusing द्वारा दाना exocytosis प्रेरित करने के लिए विभिन्न उत्तेजना प्रोटोकॉल का उपयोग करें । उत्तेजना प्रोटोकॉल वांछित वैज्ञानिक उद्देश्य फिट अनुकूलित किया जा सकता है (नीचे देखें) ।
  3. उत्तेजना चलत
    नोट: हर उत्तेजना प्रोटोकॉल में, 3 मिमी ग्लूकोज युक्त छिड़काव समाधान के साथ लगातार extracellular के दौरान टाप पृष्ठभूमि गतिविधि के कम से 2 मिनट रिकॉर्डिंग द्वारा शुरू करते हैं । समय की वांछित अवधि के लिए एक उत्तेजक के साथ Perfuse । उत्तेजक, उत्तेजना की अवधि के साथ ही रिकॉर्डिंग की अवधि के आदेश वांछित वैज्ञानिक प्रयोजनों फिट करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । एक नई उत्तेजना शुरू करने से पहले 3 मिमी ग्लूकोज युक्त extracellular समाधान के साथ अच्छी तरह से टाप धोने के लिए सुनिश्चित करें. नीचे नमूना उत्तेजना प्रोटोकॉल है कि विधि क्षमताओं का प्रदर्शन किया गया है लगता है ।
    1. pHluorin पीएच संवेदनशीलता और वायरल संक्रमण दक्षता के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में अमोनियम क्लोराइड (NH 4 सीएल) के साथ उत्तेजित (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 ): 3 मिमी ग्लूकोज (2 min) & #8594; ५० मिमी NH 4 सीएल (2 min) में 3 mm ग्लूकोज & #160; & #8594; 3 मिमी ग्लूकोज (2 मिनट)
      नोट: एनएच 4 सीएल समाधान में, एक equimolar आधार पर NaCl बदलें ।
    2. ग्लूकोज एकाग्रता बढ़ाने से इंसुलिन दाना exocytosis को उत्तेजित (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ५ र < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा ६ ): 3 मिमी ग्लूकोज (2 min) & #160; & #8594; 16 एमएम ग्लूकोज (15-30 min) & #160; & #8594; 3 एमएम ग्लूकोज (2 min
      नोट: गतिविधि के कई पटाखों को देखने के लिए, perfuse के लिए 16G समाधान के साथ लगातार कम से 15 min.
      नोट: स्रावी प्रतिसादों की एकरूपता बढ़ाने के लिए < सुप वर्ग = "xref" > 17 , उपयोगकर्ता शिविर-स्थापना अभिकर्ता जोड़ सकते हैं (१०० & #181; m IBMX और 10 & #181; m forskolin) दोनों 3g और 16G समाधान के लिए । इस दाना स्राव के लौकिक पैटर्न बदल नहीं करता है । विवरण के लिए देखें < सुप वर्ग = "xref" > १५ आणि चर्चा .

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Representative Results

तकनीक का संपूर्ण कार्यप्रवाह चित्रा 1में दिखाया गया है । संक्षेप में, माउस या मानव टाप एडीनोवायरस एंकोडिंग NPY-pHluorin और imaged, संस्कृति में कुछ दिनों के बाद, एक फोकल माइक्रोस्कोप के तहत के साथ संक्रमित किया जा सकता है । granules प्लाज्मा झिल्ली और खुले, प्रतिदीप्ति में वृद्धि के साथ फ्यूज के रूप में मनाया जाता है और मात्रा जा सकता है (चित्रा 1) । NPY-pHluorin इंसुलिन दाना गतिशीलता की निगरानी करने के लिए वास्तव में एक उपयुक्त उपकरण है, तो यह निर्धारित करने के लिए, संक्रमित टाप GFP और अलग टाप हार्मोन इंसुलिन, सोमेटोस्टेटिन या ग्लूकागन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ immunostained थे. अधिकांश NPY व्यक्त कोशिकाओं-pHluorin (GFP सकारात्मक) बीटा कोशिकाओं के रूप में वे भी इंसुलिन व्यक्त (~ ९०% थे; चित्र 2a, b बी) । केवल कुछ ग्लूकागन-धनात्मक अल्फ़ा कक्षों या सोमेटोस्टेटिन-धनात्मक डेल्टा कक्षों को GFP-लेबल किया गया (चित्र b) । महत्वपूर्ण बात, संक्रमित कोशिकाओं में, इंसुलिन के साथ NPY फ्यूजन colocalized (पियरसन के सहसंबंध गुणांक के लिए ०.६१ ± ०.०४ के लिए GFP और इंसुलिन बनाम ०.२१ ± ०.०५ के लिए GFP और ग्लूकागन और ०.०७ ± ०.०१ के लिए GFP और सोमेटोस्टेटिन).

हम प्रदर्शन किया है कि pHluorin एक प्रभावी पीएच सेंसर है, के रूप में ५० mM NH4सीएल के साथ intracellular पीएच में वृद्धि एक & #62 के परिणामस्वरूप; intracellular प्रतिदीप्ति में ५००% की वृद्धि (चित्र 3, 4 बी, वीडियो 1) । प्लाज्मा झिल्ली और फ्यूजन ताकना के उद्घाटन के साथ संलयन पर दाना बढ़ जाती है के रूप में पीएच के रूप में, NPY युक्त granules-pHluorin स्थितियों है कि KCl के साथ झिल्ली ध्रुवीकरण जैसे इंसुलिन exocytosis को उत्तेजित करने पर दिखाई दे (चित्रा 4, वीडियो 2) ।

बरकरार टाप के भीतर बीटा कोशिकाओं में एकल स्रावी घटनाओं NPY-pHluorin संक्रमित टाप के फोकल समय चूक इमेजिंग के साथ visualized किया जा सकता है । ये KCl या कई अंय शारीरिक उत्तेजनाओं के साथ प्रत्यक्ष झिल्ली ध्रुवीकरण के जवाब में होते है (चित्रा 4 और चित्रा 7, नीचे देखें) । बेसल extracellular ग्लूकोज एकाग्रता में (3 मिमी), थोड़ा स्रावी गतिविधि मनाया जाता है । हालांकि, प्लाज्मा झिल्ली के साथ granules संलयन उच्च ग्लूकोज (16 मिमी) (चित्र 5 ए, वीडियो 3) के साथ उत्तेजना के जवाब में शुरू हो रहा है । विभिन्न आकारों के साथ और विभिन्न क्षेत्रों में ROIs रखकर, स्रावी granules की प्रतिक्रिया कैनेटीक्स की तुलना में अलग कोशिकाओं या बंद निकटता (क्लस्टर) (चित्रा 5B) में कोशिकाओं के समूहों के साथ किया जा सकता है । इस प्रकार के विश्लेषण का निर्धारण सक्षम है कि: 1) व्यक्तिगत स्रावी घटनाओं बहुत सिंक्रनाइज़ और औसत सेल प्रतिक्रिया से कुछ सेकंड के भीतर स्रावित कर रहे हैं, और 2) बंद निकटता फार्म सिंक्रनाइज़ गतिविधि के कार्यात्मक समूहों में बीटा कोशिकाओं ।

शरीर में इंसुलिन स्राव एक गुणवाला तरीके से होता है. उत्तेजक NPY-pHluorin-लंबे समय तक (15-20 मिनट) के लिए ऊंचा ग्लूकोज एकाग्रता के साथ संक्रमित टाप स्राव के कई दालों (या फटने) को जन्म दिया(चित्रा 6 ,वीडियो 4). प्रत्येक पल्स के दौरान, व्यक्तिगत granules एक सिंक्रनाइज़ फैशन में प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ्यूज के रूप में (चित्रा 5) से पहले दिखाया गया है । स्रावी गतिविधि के फटने हर 3-4 मिनट में देखा जा सकता है ।

NPY में प्रतिदीप्ति में क्षणिक वृद्धि-pHluorin युक्त granules भी purinergic एगोनिस्ट एटीपी (10 µ एम) या मस्करीनिक एगोनिस्ट acetylcholine (2, 10 µ एम) के जवाब में देखा जा सकता है (चित्रा 7), दोनों जिनमें से जाना जाता है के उत्तेजितकों मानव टाप में इंसुलिन स्राव. उंमीद के रूप में, KCl (30 मिमी) के साथ झिल्ली ध्रुवीकरण भी इंसुलिन granules exocytosis (चित्रा 5) ट्रिगर । कई उत्तेजनाओं के रूप में एक ही टाप तैयारी के लिए लागू किया जा सकता है जब तक कि टाप अच्छी तरह से उत्तेजनाओं के बीच में धोया जाता है । प्रयोग दोहराते समय आवेदन के क्रम में परिवर्तन करना सुनिश्चित करें ।

Figure 1
चित्र 1. एक योजना विकसित की परख illustrated । एडीनोवायरस कि एक पीएच-संवेदनशील GFP (pHluorin) NPY करने के लिए युग्मित सांकेतिक शब्दों का उत्पादन किया और माउस या मानव अग्नाशय के टाप को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे थे । चार से छह दिनों के संक्रमण के बाद, इस टाप एक coverslip पर रखा गया था और एक ईमानदार लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप के तहत छवि । NPY-pHluorin का निर्माण बीटा कोशिकाओं में इंसुलिन granules में व्यक्त किया जाता है । इसके प्रतिदीप्ति परिपक्व इंसुलिन granules के अंलीय पीएच पर बुझती है, लेकिन प्लाज्मा झिल्ली और ७.४ के तटस्थ extracellular पीएच के लिए जोखिम के साथ granules संलयन पर उज्ज्वल हो जाता है ।

Figure 2
चित्र 2. NPY संलयन निर्माण इंसुलिन granules में व्यक्त किया जाता है । (क) अक्षुण्ण मानव NPY-pHluorin, GFP के लिए immunostained (हरा) और इंसुलिन (बाएँ पैनल, लाल), सोमेटोस्टेटिन (मध्य, लाल) या ग्लूकागन (दाएँ, लाल) के साथ संक्रमित का... कक्ष नाभिक नीले (DAPI लेबल) में दिखाए जाते हैं । स्केल पट्टियां = 10 µm. (B) GFP-धनात्मक कक्षों के भिंन के ठहराव जिनमें या तो इंसुलिन (Ins), सोमेटोस्टेटिन (सोमा) या ग्लूकागन (Glu) भी शामिल हैं । दर्शाए गए अर्थ ± SEMs, n = 5 टाप हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. NPY-pHluorin एक प्रभावी पीएच सेंसर है । ( ऊपरी पैनल, 3 जी) और ५० मिमी एनएच4सीएल (निचले पैनल) की उपस्थिति में NPY-pHluorin extracellular समाधान में 3 मिमी ग्लूकोज युक्त के साथ संक्रमित एक माउस की फोकल छवियों के अधिक से अधिक प्रक्षेप टाप । स्केल बार = १०० µm. (B) ट्रेस दिखाती है मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (मनमानी इकाइयों) में बदलाव को दर्शाता एनएच4सीएल से प्रेरित पूरे टाप में है । डैश्ड लाइन एनएच4सीएल आवेदन इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. NPY युक्त granules-pHluorin एक बार वे प्लाज्मा झिल्ली और खुले साथ फ्यूज दिखाई बन जाते हैं । NPY के साथ मानव isletsinfected-pHluorin एडीनोवायरस थेप्लाज्मा झिल्ली डाई di-8-ANEPP (लाल) के साथ एड । KCl (30 मिमी) के साथ टाप उत्तेजना सेल सतह पर फ्लोरोसेंट granules की अचानक और क्षणिक उपस्थिति ट्रिगर (हरे रंग में दिखाया गया है) । exocytotic प्रतिक्रिया (t = 0), के दौरान (t = 3-9 s) और उसके बाद (t = 12 s) से पहले एक मानव टाप के भीतर कोशिकाओं की फोकल छवियों पर दिखाए जाते हैं । कंट्रास्ट को हटाने के लिए समायोजित किया गया था पृष्ठभूमि ग्रीन प्रतिदीप्ति । स्केल बार = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5. उच्च ग्लूकोज प्लाज्मा झिल्ली के साथ NPY-pHluorin संलयन ट्रिगर । (ए) एक बरकरार मानव टाप के फोकल छवियों के अधिक से अधिक प्रक्षेपण बेसल ग्लूकोज एकाग्रता में NPY-pHluorin से संक्रमित (3 जी 3 मिमी ग्लूकोज, बाएँ पैनल) या उच्च ग्लूकोज में (16G-16 मिमी ग्लूकोज, सही पैनल). Extracellular समाधान शिविर एजेंटों forskolin और IBMX स्थापना समाहित (विवरण के लिए प्रोटोकॉल देखें) । स्केल बार = 10 µm. (ख) (लाल, granules), कोशिकाओं (हरा) या सेल क्लस्टर (नीला) के चारों ओर रखा ROIs में ग्रीन चैनल में मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (मनमानी इकाइयों) में परिवर्तन दिखा निशान । उच्च ग्लूकोज 5 मिनट के लिए 3 जी में ~ २.५ मिनट के बाद लागू किया गया था । प्रारंभिक प्रतिदीप्ति मान (आधार रेखा) के लिए प्रतिदीप्ति मान normaled थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. स्रावी घटनाओं उच्च ग्लूकोज पर स्राव के असतत दालों उत्पन्न करते हैं । 16 मिमी ग्लूकोज के साथ निरंतर उत्तेजना के दौरान एक अक्षुण्ण मानव टाप के भीतर विभिन्न कोशिकाओं के आसपास रखा ROIs में मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (मनमानी इकाइयों) में परिवर्तन दिखा निशान. प्रत्येक रंग एक अलग कक्ष का प्रतिनिधित्व करता है । स्रावी गतिविधि के फूटने हर 3-4 मिनट देखा जा सकता है . इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7. प्लाज्मा झिल्ली के साथ NPY-pHluorin फ्यूजन इंसुलिन स्राव के ज्ञात उत्तेजितताओं द्वारा ट्रिगर है । KCl (30 मिमी), एटीपी (10 µ एम), उच्च ग्लूकोज (16G, 16 मिमी) और acetylcholine (10 µ एम) द्वारा प्रेरित बरकरार मानव टाप के भीतर कोशिकाओं में व्यक्तिगत स्रावी घटनाओं के आसपास रखा ROIs में मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (मनमाना इकाइयों) में परिवर्तन दिखा निशान । KCl और एटीपी बेसल ग्लूकोज एकाग्रता में लागू किया गया (3 मिमी). ब्लैक लाइंस औसत दाना और ग्रे लाइनों शो SEM मूल्यों को प्रतिबिंबित करते हैं । हरे निशान इसी सेल प्रतिक्रिया दिखाते हैं । क्षैतिज समय स्केल (2 min) सभी ग्राफ़ पर लागू होता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Video 1
वीडियो 1. NPY-pHluorin एडीनोवायरस कुशलता से संक्रमित टाप सेल और भाव pH बदलता है ।
माउस टाप 4 दिनों के लिए एडीनोवायरस एंकोडिंग NPY-pHluorin के साथ संक्रमित थे । संक्रमित टाप एक coverslip पर रखा गया था और इमेजिंग चैंबर पर मुहिम शुरू की । intracellular पीएच बढ़ाने के लिए टाप 3 एमएम ग्लूकोज युक्त extracellular सॉल्यूशन में ५० एमएम एनएच4सीएल जोड़ा के साथ perfused किया गया । प्रतिदीप्ति में एक तेज और मजबूत वृद्धि एनएच4सीएल आवेदन पर देखा जा सकता है । स्केल बार = १०० µm. Movie गति = 5 एफपीएस । फिल्म की कुल अवधि ९० s है । इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video 2
वीडियो 2. NPY युक्त granules-pHluorin एक बार वे प्लाज्मा झिल्ली और खुले साथ फ्यूज दिखाई बन जाते हैं ।
मानव NPY से संक्रमित टाप-pHluorin एडीनोवायरस प्लाज्मा झिल्ली डाई di-8-ANEPP के साथ मशीन थे । KCl (30 मिमी) के साथ टाप उत्तेजना सेल सतह पर फ्लोरोसेंट granules की अचानक और क्षणिक उपस्थिति ट्रिगर । फोकल विमानों का एक अधिक से अधिक प्रक्षेपण दिखाया गया है । कंट्रास्ट को हटाने के लिए समायोजित किया गया था पृष्ठभूमि ग्रीन प्रतिदीप्ति । स्केल बार = 20 µm । मूवी की गति = 5 एफपीएस । फिल्म की कुल अवधि ६० s है । इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video 3
वीडियो 3. उच्च ग्लूकोज NPY-pHluorin युक्त granules के Exocytosis ट्रिगर ।
NPY के फ्यूजन-pHluorin युक्त granules उच्च ग्लूकोज (16 मिमी) के साथ उत्तेजना के जवाब में शुरू हो रहा है । बेसल extracellular ग्लूकोज एकाग्रता में (3 मिमी), थोड़ा स्रावी गतिविधि मनाया जाता है । हालांकि, उच्च ग्लूकोज पर, इंसुलिन granules क्षणिक किसी सिंक्रनाइज़ फैशन में एक टाप में विभिन्न कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली पर दिखाई देते हैं । उच्च ग्लूकोज 3 जी में ~ २.५ मिनट के बाद लागू किया गया था (16G लेबल प्रकट होता है) । फोकल विमानों का एक अधिक से अधिक प्रक्षेपण दिखाया गया है । स्केल बार = 20 µm । मूवी की गति = 10 एफपीएस । फिल्म की कुल अवधि 7 मिनट है. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video 4
वीडियो 4. उच्च ग्लूकोज के साथ लंबे समय तक उत्तेजना Exocytosis के कई फटने चलाता है ।
उच्च ग्लूकोज के साथ लंबे समय तक उत्तेजना स्रावी टाप के कई दालों को जन्म देता है, जिसके दौरान granules क्षणिक दिखाई देते हैं । स्रावी गतिविधि के दलहन हर ~ 3-4 मिनट देखा जा सकता है । एक मानव टाप के फोकल विमान को दिखाया गया है । प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए एक pseudocolor योजना लागू की गई । स्केल बार = 20 µm. Movie गति = 30 एफपीएस । फिल्म की कुल अवधि 20 मिनट है. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

इस पांडुलिपि में फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा बरकरार अग्नाशय के टाप के भीतर बीटा कोशिकाओं में इंसुलिन granules के exocytosis कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक तकनीक का वर्णन । यह एक उच्च अभिकर्मक दक्षता सुनिश्चित करने के लिए एडीनोवायरस में क्लोन फ्लोरोसेंट संवाददाता के रूप में NPY-pHluorin का उपयोग करता है ।

हालांकि विधि हमारे हाथों में अत्यधिक कुशल था, यह कुछ संशोधनों कि मुख्य रूप से दो मापदंडों पर निर्भर की आवश्यकता हो सकती है: 1) टाप तैयारी की गुणवत्ता, और 2) संक्रमण की स्थिति के अनुकूलन के साथ वायरल स्टॉक के titer । टाप के वायरल संक्रमण से पहले, टाप तैयारी अलगाव और परिवहन ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर तनाव से उबरने के लिए अनुमति देते हैं । संक्रमण/अभिव्यक्ति अवधि के दौरान एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत टाप आकृति विज्ञान का निरीक्षण और टाप की सतह या hypoxic कोशिकाओं की उपस्थिति (गहरा कोशिकाओं) के टाप सेंटर18 में से फैलाई गई कोशिकाओं के रूप में घटी हुई व्यवहार्यता के संकेतों के लिए जांच करें . प्रत्येक वायरल शेयर titer और संक्रमण दक्षता में भिंन हो सकते हैं । वायरल titer और संस्कृति के समय के लिए सूक्ष्म परख से पहले के अनुसार इस्तेमाल वायरस की मात्रा को समायोजित करने के लिए सुनिश्चित करें । सबसे महत्वपूर्ण कदम संक्रमण की स्थिति का अनुकूलन है (जैसे, वायरल कणों की संख्या, परख से पहले संस्कृति समय) इतना है कि रिपोर्टर के लिए पर्याप्त व्यक्त की है और टाप अखंडता और जवाबदेही बनाए रखा है । जब संक्रमण प्रोटोकॉल और प्रत्येक नए वायरल बैच के साथ अनुकूलन, अलग समय अंक पर कुछ टाप इकट्ठा और जांच करें कि क्या exocytosis KCl (30 मिमी) और/या उच्च ग्लूकोज (16 मिमी) के साथ प्राप्त किया जा सकता है । हमने पाया है कि परख बेहतर काम करता है और टाप कोशिकाओं स्वस्थ और ग्लूकोज उत्तरदायी जब मुि कम है (लगभग 2) और संस्कृति समय (लगभग 5 दिन) के लिए संलयन के स्तर को बढ़ाने के लिए विस्तारित है निर्माण । हमारे परिणाम एक पिछले दिखा रहा है कि जीन उत्पादों की कुशल अभिव्यक्ति बेहतर adenoviral वेक्टर के कम transfecting सांद्रता में हासिल कर सकते है जबकि टाप समारोह19के संरक्षण के अध्ययन के साथ लाइन में हैं ।

तकनीक है, तथापि, कुछ सीमाएं हैं । एक रिपोर्टर के रूप में NPY-pHluorin का उपयोग करके, granules वे प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ्यूज और फ्यूजन ताकना खुलता है इससे पहले कि कल्पना नहीं की जा सकती है । exocytosis के बजाय इंसुलिन दाना तस्करी का अध्ययन करने के लिए, एडीनोवायरस एंकोडिंग NPY-eGFP के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है । एक और सीमा है कि, एक कम सीमा तक, NPY-pHluorin गैर इंसुलिन युक्त granules के लिए लक्षित किया जा सकता है । हालांकि, कोशिकाओं है कि NPY-pHluorin से संक्रमित थे के बहुमत भी इंसुलिन व्यक्त किया और कोशिकाओं के 10% से कम ग्लूकागन या सोमेटोस्टेटिन व्यक्त की । दरअसल, granules स्राव की ग्लूकोज निर्भरता, अपने गुणवाला पैटर्न और इंसुलिन के साथ सह स्थानीयकरण, संकेत दिया कि सबसे स्रावी घटनाओं इंसुलिन granules से कार्गो रिलीज का प्रतिनिधित्व करते हैं । इंसुलिन exocytosis की निगरानी की गारंटी करने के लिए उत्पन्न हो रही है, परख शर्तों के तहत किया जाना चाहिए कि इंसुलिन स्राव को उत्तेजित (उदा, उच्च ग्लूकोज). फिर भी, बीटा सेल अभिव्यक्ति की विशिष्टता में सुधार करने के लिए, NPY-pHluorin ऐसे चूहे इंसुलिन प्रमोटर के रूप में एक अधिक चयनात्मक प्रमोटर के नियंत्रण में रखा जा सकता है । तकनीक की एक और सीमा है कि यह इंसुलिन granules में exogenous प्रोटीन की अभिव्यक्ति की आवश्यकता है, जो उनकी उत्पत्ति और/या व्यवहार20perturb कर सकते हैं । यह जब प्रयोगों के परिणामों की व्याख्या पर विचार किया जाना चाहिए और, यदि संभव हो तो, निष्कर्ष अन्य इंसुलिन दाना कार्गो प्रोटीन का उपयोग कर मान्य किया जाना चाहिए (जैसे, सी-पेप्टाइड, टाप amyloid पॉलीपेप्टाइड) पत्रकारों के रूप में.

इस प्रोटोकॉल भी शिविर बढ़ाने एजेंटों (IBMX और forskolin) इंसुलिन दाना exocytosis पर उच्च ग्लूकोज के प्रभाव को शक्ति करने के लिए सहित की सिफारिश की । यह उत्तेजना प्रोटोकॉल शारीरिक रूप से प्रासंगिक बढ़ाना रास्ते के सक्रियकरण नकल (incretins या paracrine और तंत्रिका संकेत अणुओं द्वारा ट्रिगर) कि अग्नाशय बीटा कोशिकाओं में वृद्धि शिविर द्वारा इंसुलिन स्राव शक्ति । फिर भी, शिविर स्थापना एजेंटों के अभाव में, उच्च ग्लूकोज (16 मिमी) के अलावा granules exocytosis, लेकिन मनाया स्रावी घटनाओं की संख्या कम है । granules अभी भी असतत फटने में दिखाई देते हैं, औसत सेल प्रतिक्रिया के साथ सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं, और इसी तरह के फटने के समय: १.४-६.६ उच्च ग्लूकोज प्लस IBMX/forskolin बनाम १.५-10 में उच्च ग्लूकोज अकेले में मिनट ।

परख यहां वर्णित मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्वपूर्ण है के रूप में यह पर्याप्त स्थानिक और लौकिक संकल्प को बरकरार टाप के भीतर बीटा कोशिकाओं में वास्तविक समय में एकल संलयन घटनाओं कल्पना है । उदाहरण के लिए, यह इंसुलिन granules ग्लूकोज उत्तेजना पर मानव टाप में जारी कर रहे हैं, जिसके साथ उच्च तुल्यकालन से पता चला. इसके अलावा, यदि टाप coverslip से अच्छी तरह से जुड़े हुए हैं, वे लंबे समय तक के लिए imaged किया जा सकता है (ंयूनतम 15-20 मिनट) । यह दिखाने के लिए प्रयोग किया जाता है कि मानव टाप में exocytosis अलग फटने कि vivo इंसुलिन स्राव में गुणवाला के उन लोगों के समान समय में दिखाई देते हैं में होता है । परख भी इंसुलिन exocytosis पर कई उत्तेजनाओं के प्रभाव का परीक्षण murine या मानव टाप का उपयोग करने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, क्योंकि यह अंय तरीकों की तरह टाप सेल पृथक्करण की आवश्यकता नहीं है, यह एक टाप के भीतर बीटा कोशिका आबादी के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । दरअसल, हमने देखा है कि पड़ोसी बीटा कोशिकाओं ~ 5-10 कोशिकाओं में जो गतिविधि सिंक्रनाइज़ है के फार्म क्लस्टर । एक ही क्लस्टर से बीटा कोशिकाओं शायद गैप जंक्शन connexin ३६21के बने चैनलों द्वारा युग्मित कर रहे हैं । उनके सिंक्रनाइज़ प्रतिक्रिया उचित इंसुलिन स्राव22के लिए आवश्यक है कि बीटा सेल कनेक्टिविटी दिखाता है.

भविष्य में, इस तकनीक कार्यात्मक इमेजिंग के लिए अन्य फ्लोरोसेंट रंजक के साथ जोड़ा जा सकता है वास्तविक समय में कल्पना कैसे cytosolic कैल्शियम या झिल्ली की क्षमता में परिवर्तन, उदाहरण के लिए, बीटा कोशिकाओं में दाना exocytosis के साथ सहसंबंधी बनाना. विशेष रूप से, के रूप में नए पीएच संवेदनशील लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन उपलब्ध हो रहे है14,23 और NPY या अंय इंसुलिन granules कार्गो प्रोटीन से जुड़े हो सकते हैं, कार्यात्मक इमेजिंग के लिए हरी रंजक इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, इस तकनीक के लिए एक माउस मॉडल के साथ जोड़ा जा सकता है vivo इमेजिंग में संवहनी टाप माउस नेत्र24के पूर्वकाल कक्ष में प्रत्यारोपित । टाप आंखों में रोपाई से पहले एडिनोवायरस ४८-७२ ज से संक्रमित हो सकते हैं । मानव टाप प्रत्यारोपण कर रहे हैं, तो प्रतिरक्षा की कमी चूहों इस्तेमाल किया जाना चाहिए । इस मॉडल का उपयोग करना, इंसुलिन दाना स्राव के उपसेलुलर स्थानिक पैटर्न संवहनी व्यवस्था के साथ संबंधित किया जा सकता है25.

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Disclosures

लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

लेखकों ने माइक्रोस्कोप के साथ मदद के लिए ड्राइ इमेजिंग कोर सुविधा से मेरिको Boulina का शुक्रिया अदा किया । इस काम को NIH पलाश 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 और R56 DK084321 (AC) ने सपोर्ट किया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Upright laser-scanning confocal microscope Leica Microsystems, Wetzlar, Germany TCS-SP5 includes LAS AF, the image acquisition software
Imaging chamber Warner instruments RC-26
Imaging chamber platform Warner instruments PH-1
22 x 40 glass coverslips Daiggerbrand G15972H
Vacuum silicone grease Sigma Z273554-1EA
Multichannel perfusion system Warner instruments VC-8
Single inline solution heater Warner instruments SH-27B
Temperature controller Warner instruments TC-324C
Peristaltic Suction pump Pharmacia P-1
35 mm Petri dish, non-tissue culture treated VWR 10861-586
CMRL Medium, no glutamine ThermoFisher 11530037
FBS, heat inactivated ThermoFisher 16140071
L-Glutamine 200 mM ThermoFisher 25030081
5 M NaCl solution Sigma S5150
3 M KCl solution Sigma 60135
1 M CaCl2 solution Sigma 21115
1 M MgCl2 solution Sigma M1028
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
1 M HEPES solution Sigma H0887
Vacuum filter VWR 431098
D-Glucose Sigma G8270
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-aldrich P6407
Di-8-ANNEP ThermoFisher D3167
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma I5879
Forskolin Sigma F3917

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक १२७ इंसुलिन दाना exocytosis neuropeptide Y pHluorin गुणवाला स्राव अग्नाशय के टाप एडीनोवायरस
Neuropeptide Y-pHluorin की फोकल इमेजिंग: बरकरार Murine और मानव टाप में इंसुलिन दाना Exocytosis कल्पना करने के लिए एक तकनीक
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Makhmutova, M., Liang, T., Gaisano, H., Caicedo, A., Almaça, J. Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets. J. Vis. Exp. (127), e56089, doi:10.3791/56089 (2017).

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