Summary
Vi beskriver en protokoll for visualisering av insulin exocytosis i intakt holmer med pHluorin, en pH-sensitive grønne fluorescerende protein. Isolerte småøyer er infisert med adenovirus koding pHluorin koblet til vesicle Last blindhet. Dette gir oppdagelsen av insulin granule fusion hendelser av AC confocal mikroskopi.
Abstract
Insulinsekresjon spiller en sentral rolle i glukose homeostase under normale fysiologiske forhold så vel som sykdom. Gjeldende metoder å studere insulin granule exocytosis enten bruke elektrofysiologi eller mikroskopi kombinert til uttrykk for fluorescerende journalister. Men de fleste av disse teknikkene er optimalisert for klonal linjer eller krever dissociating bukspyttkjertelen holmer. Derimot gir metoden presenteres her sanntids visualisering av insulin granule exocytosis i intakt bukspyttkjertelen holmer. I denne protokollen beskriver vi først virus infeksjon av isolerte bukspyttkjertelen holmer med adenovirus som koder et pH-sensitive grønne fluorescerende protein (GFP), pHluorin, koblet til neuropeptide Y (NPY). Andre beskrive vi de AC confocal imaging av holmer fem dager etter viral infeksjon og hvordan å overvåke insulin granule utskillelsen. Kort, infiserte øyene er plassert på en dekkglassvæske på en tenkelig chamber og fotografert under en oppreist laserskanning AC confocal mikroskop mens blir kontinuerlig parfyme med ekstracellulære løsning som inneholder ulike stimuli. AC confocal image over 50 µm av øyen er ervervet som time-lapse opptak bruker en rask-resonans skanner. Fusjon av insulin granulater med plasma membranen kan følges over tid. Denne fremgangsmåten også tillater testing et batteri av stimuli i ett enkelt eksperiment er kompatibel med både mus og menneskelige holmer og kan kombineres med ulike fargestoffer for funksjonell imaging (f.eks, membran potensial eller cytosolic kalsium fargestoffer).
Introduction
Insulin er produsert av beta cellene i bukspyttkjertelen Holme og det er en viktig regulator av glukose metabolisme1. Død eller dysfunksjon av beta-cellene forstyrrer glukose homeostase og fører til diabetes2. Insulin er pakket i tett kjerner granulater som utgis i en Ca2 +-avhengige måte3. Klargjørende hvor insulin granule exocytosis reguleres er viktig å forstå hva bestemmer insulinsekresjon og åpner nye muligheter for identifikasjon av romanen terapeutisk mål for behandling av diabetes.
Insulin exocytosis har vært grundig studert bruker elektrofysiologiske tilnærminger, slik som membran kapasitans målinger og mikroskopiske tilnærminger i kombinasjon med fluorescerende molekyler. Membran kapasitans målinger har god timelige oppløsning og tillate enkeltcelle innspillinger. Imidlertid endringer i kapasitans gjenspeiler overflaten bevegelsen av cellen og ikke fange personlige fusion hendelser eller skille insulin granule fusion fra andre non-insulin sekretoriske blemmer3. Mikroskopiske tilnærminger, slik som to-fotonet eller total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi i kombinasjon med fluorescerende sonder og vesicle Last proteiner, gi flere detaljer. Disse teknikkene fange enkelt exocytotic hendelser og også den pre- og post exocytotic stadier og kan brukes for å studere exocytotic mønstre bestander av celler3.
Fluorescerende journalister kan være av tre typer: 1) ekstracellulære, 2) cytoplasmatiske eller 3) flytande. 1) ekstracellulære journalister er polar tracers (f.eks, dextrans, sulforhodamine B (SRB), lucifer gul, pyranine) som kan bli introdusert til den ekstracellulære miljøet4. Bruk av polar tracers gir etterforskningen av fusion pore i en populasjon av celler og fanger ulike intercellulære strukturer som blodkar. Men rapporterer de ikke vesicle Last oppførsel. 2) cytoplasmatiske journalister er fluorescerende sonder kombinert membran-assosiert proteiner som ansikt cytoplasma og er involvert i dokking og exocytosis. Eksempler er familiemedlemmer løselig N- ethylmaleimide-sensitive faktor vedlegg protein reseptor (SNARE) som har blitt brukt i nevrovitenskap for å studere nevrotransmitter release5. Slike proteiner har flere bindende partnere og ikke insulin-granulen bestemt. 3) vesicula journalister er fluorescerende sonder smeltet vesicula Last proteiner som tillater etterforskningen av Last-spesifikke vesicle atferd. Insulin-granulen bestemt Last proteiner inkluderer insulin, c-peptid, Holme amyloid polypeptid og NPY blant annet6,7. NPY finnes bare i insulin som inneholder granulater og er co utgitt med insulin, gjør den en utmerket partner for fluorescerende reporter8.
Blanding av ulike fluorescerende proteiner til NPY har vært tidligere ansatt å studere ulike aspekter av exocytosis i neuroendocrine celler, for eksempel kravet til bestemte synaptotagmin isoformene9,10 og hvordan gang-løpet av utgivelsen avhenger av utgangen cytoskeleton og myosin II11,12. I denne studien vi valgte pHluorin som fluorescerende reporteren, som er en modifisert GFP som er ikke-fluorescerende surt pH i tett kjernen granulater men blir lyst fluorescerende ved eksponering til nøytral ekstracellulære pH13. Eldre insulin granulater har et surt pH under 5.5. Når granulen sikringer med plasma membranen og åpner, er sin Last utsatt for nøytral ekstracellulære pH i 7.4, tillater bruk av pH-sensitive proteiner pHluorin som reporter7,14.
I lys av pH sensitiv karakter av pHluorin og selektiv uttrykk for NPY i insulin granulater, kan NPY-pHluorin fusion Konstruer brukes å studere ulike egenskaper for insulin granule exocytosis. Viral levering av fusion Konstruer sikrer høy transfection effektivitet og arbeider på primære beta celler eller linjer og isolerte småøyer. Denne metoden kan også brukes som en retningslinje for å studere exocytosis i en annen celle type med NPY inneholder blemmer. Det kan også kombineres med noen transgene musemodell å studere virkningene av visse betingelser (bokseren, overuttrykte, etc.) på exocytosis. Denne teknikken er brukt tidligere å karakterisere romlige og tidsmessige mønstre av insulin granule sekresjon i beta-celle populasjoner i menneskelig holmer15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
dyreetikk komiteen av University of Miami har godkjent alle eksperimenter.
1. viral infeksjon av intakt isolert menneskelige eller musen bukspyttkjertelen holmer
- Holme kultur: forberede Holme kultur media: Connaught medisinsk forskning laboratorier (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS og 2 mM L-glutamin.
- Human bukspyttkjertelen holmer hentes fra integrert Holme distribusjon programmet (NIDDK, NIH). Ved ankomst, transfer øyene (~ 500 Holme ekvivalenter) til 35 mm ikke-vev kultur behandlet Petri retter med 2 mL CMRL kultur medier på 37 ° C, 5/95% CO 2 /O 2 for 24 timer før virusinfeksjon.
- Musen bukspyttkjertelen holmer kan isoleres for følgende tidligere etablerte protokoller 16. Etter isolasjon, kultur ~ 200 Holme tilsvarende i 35 mm ikke-vev kultur behandlet Petri retter med 2 mL CMRL kultur medier på 37 ° C, 5/95% CO 2 /O 2 for 24 timer før virusinfeksjon.
Merk: Unngå bruk av transgene mus med GFP eller YFP journalister på holmer for å unngå fluorescens overlapper med NPY-pHluorin.
- Virus forberedelse
Merk: NPY-pHluorin fusion ble klonet inn pcDNA3 vektor 10 og subcloned i en adenoviral vektor for adenoviral produksjon [adenovirus serotype 5 (DE1/E3)] av en rekombinant adenovirus produksjonsbedrift. Viruset ble aliquoted og lagret på-80 ° C. Viral aksjen leveres av selskapet på titers 10 12 til 10 13 virus partikler (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).- I vitro Holme infisert, bruk 10 6 PFU/mL, resulterer i en omtrentlig mangfold av infeksjon (MOI) av 2 (se diskusjon for detaljer)
- Viral infeksjon av bukspyttkjertelen holmer
Forsiktig: Arbeide med adenoviruses krever grad 2 (BSL2) prosedyrer og sertifisering. Sjekk med institusjonelle biosikkerhet offiser for veiledning og opplæring i BSL2 prosedyrer.- Forberede menneskelige/mus holmer som beskrevet ovenfor.
- Legge til 5-10 µL av lager virus hver 35 mm Petriskål inneholder menneskelige/mus holmer i 2 mL CMRL kultur medier (med 10% FBS og 2 mM L-glutamin).
Merk: Justere volumet på viruset brukt i henhold til viral titer som leveres av selskapet dataarket. - Kultur øyene virus inneholder medier på 37 °C/5% CO 2 for 24 h.
- Etter 24 h, Sug opp virus inneholder media og erstatte med 2 mL CMRL kultur medier (med 10% FBS og 2 mM L-glutamin).
- Kultur øyene for 4-6 dager på 37 °C/5% CO 2, erstatte media hver tredje dag.
- Etter 4 - 6 dager i dyrking, forventer rundt 30% av Holme celler er infisert. Holmer kan brukes for live bildebehandling eksperimenter.
2. AC confocal Imaging av infisert holmer
Merk: bruke Tabellen for materiale for materialer og utstyr som kreves for AC confocal bildebehandling.
- Reagens forberedelser og eksperimentelle oppsett
- forberede ekstracellulære løsning: legge til 125 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 2.56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7.4, sterile filtrert.
Merk: Denne bufferen er normalt forberedt uten glukose og kan lagres på 4 ° C i opptil 1 måned. Glukose legges ved å nå ønsket endelige konsentrasjonen.- Forberede basale glukose (3 mM) medium: legge til 75 µL av 2 M glukose lager 50 mL av ekstracellulære løsning.
- Hyperglycemic (16 mM) medium: legge til 400 µL av 2 M glukose lager 50 mL av ekstracellulære løsning
- Fortynne eventuelle ekstra stimulans (f.eks, KCl eller adenosin trifosfat (ATP)) i ekstracellulære løsning som inneholder 3 mM glukose.
- Før du starter et eksperiment, pretreat coverslips med poly-D-lysine ved å legge 30 µL av poly-D-Lysine løsning (1 mg/mL) dekkglassvæske 1t og grundig skylling det med H 2 O.
Merk: Poly-lysine belagt coverslips kan lagres ved romtemperatur for inntil 6 måneder. - Minst 1 time før eksperimentet, ved hjelp av en 1 mL pipette, overføre øyene til en 35 mm Petriskål inneholder ekstracellulære løsning med 3 mM glukose. Holde øyene på 37 ° C og 5% CO 2.
Merk: Hvis nødvendig, plasma membranen kan merkes i dette trinnet. Hvis etiketten plasma membranen, legge 2 µM di-8-ANEPP fargestoff til ekstracellulære løsningen med 3 mM glukose. Inkuber øyene fargestoff løsning for 1 h 37 °C/5% CO 2. Plasma membranen fargestoff kan være spent på 488 nm og oppdaget på 620 nm. - min før du starter et eksperiment, knytte dekkglassvæske til tenkelig kammeret forsegle den med vakuum silikon fett. Fest tenkelig kammeret tenkelig plattformen. Bruker en pipette, plasserer 20-30 holmer på poly-D-lysin-behandlet området av dekkglassvæske og la øyene overholder overflaten for 20 min.
Merk: Det er viktig ikke å la dekkglassvæske tørke for å unngå Holme skade. - Mens øyene er følge dekkglassvæske, forberede perfusjon systemet ved grundig skylling det med vann. Legge til hver løsning til en annen kanal: 3 mM glukose (kanal 1), 16 mM glukose (kanal 2), 16 mM glukose med 100 µM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) og 10 µM forskolin (kanal 3), 25 mM KCl i 3 mM glukose (kanal 4), 10 µM ATP i 3 mM glukose ( kanal 5). Fjern alle boblene fra systemet ved å åpne hver kanal separat og la løsning flyten i noen minutter, og kontroller at flyten er konsekvent (0,5 mL/min) og slangen ikke lekker.
- Kobler enkelt innebygd løsning ovnen til perfusjon stikkontakt røret og justere temperaturen på utstrømmende bufferen til 37 ° C.
- Forberede inntaks-pumpe. Fjern alle boblene fra systemet, og kontroller at flyten er konsekvent og slangen ikke lekker.
- Når øyene overholder dekkglassvæske overflaten, forsiktig fylle opp tenkelig kammeret med den ekstracellulære løsningen inneholder 3 mM glukose. Unngå å vaske holmer fra overflaten av dekkglassvæske.
- Plass tenkelig plattformen med øyene på mikroskopet scenen og koble den til perfusjon systemet og inntaks-pumpe.
- Slå på strømmen og stadig perfuse holmer med 3G ekstracellulære løsning. Systemet er nå klar for AC confocal bildebehandling.
- forberede ekstracellulære løsning: legge til 125 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 2.56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7.4, sterile filtrert.
- AC confocal imaging
- finne øyene i feltet mikroskop med forstørring. Når fokusert på øyene, bytte til høyere forstørrelse mål (f.eks, 63 X vann nedsenking objektive (63 X / 0.9 NA)).
- Åpne oppkjøpet benytter programvare (Tabell for materiale) og aktivere resonans skanner modus.
- XYZT tenkelig modus og konfigurere oppkjøpet innstillingene på følgende måte:
- slå på Argon laser og 488 nm laser linje og justere laser makt til 50% for pHluorin eksitasjon.
- Samle utslipp på 505-555 nm.
- Velge en 512 x 512 bildepunkter. Trykk på " Live "-knappen for å starte bildebehandling og justerer de gevinst (typisk gevinst er rundt 600 V).
- Sette begynner- og sluttidspunkt i z-stabelen: fokus på Holmen og velge " fra " og flytte til den siste fly som kan være fokusert og velg " slutten ". Bruk punktstørrelse z-trinn på 5 µm. Programmet beregner automatisk antallet AC confocal fly.
- Angir tidsintervallet for oppkjøpet av hver z stabel nær 1,5-2 s, og velg " kjøpe til stoppet " for kontinuerlig bildebehandling.
- Trykk på " start " for å initialize.
- Bruke ulike stimulering protokoller for å indusere granule exocytosis av perfusing holmer med ønsket stimuli. Stimulering protokoller kan tilpasses for å passe det ønskede vitenskapelige formålet (se nedenfor).
- Stimulering protokoller
Merk: I hver stimulering protokollen, starter ved minst 2 min Holme bakgrunn aktivitet under konstant perfusjon ekstracellulære løsning som inneholder 3 mM glukose. Perfuse med en stimulerende for den ønskede perioden. Rekkefølgen av sentralstimulerende midler, varigheten av stimulering og varigheten av opptak kan tilpasses for å passe de ønskede vitenskaplige formålene. Husk å vask holmer med ekstracellulære løsning som inneholder 3 mM glukose før du starter en ny stimulering. Nedenfor finner du eksempler stimulering protokollene som er brukt til å vise metoden mulighetene.- Stimulere med salmiakk (NH 4 Cl) som en positiv for pHluorin pH følsomhet og viral infeksjon effektivitet ( Figur 3): 3 mM glukose (2 min) → 50 mM NH 4 Cl (2 min) i 3 mM glukose → 3 mM glukose (2 min)
Merk: på NH 4 Cl løsning, erstatte NaCl på en ekvimolare basis. - Stimulere insulin granule exocytosis ved å øke glukose konsentrasjonen ( figur 5 og figur 6): 3 mM glukose (2 min) → 16 mM glukose (15-30 min) → 3 mM glukose (2 min
Merk: Hvis du vil se flere serieopptak aktivitet, perfuse øyene kontinuerlig med 16 G løsning i minst 15 min.
Merk: For å øke konsistensen av sekretoriske svar 17, brukere kan legge til cAMP-raising agenter (100 µM IBMX og 10 µM forskolin) både 3 G og 16 G løsninger. Dette endrer ikke den timelige mønstre av granule sekresjon. For detaljer se 15 og diskusjon.
- Stimulere med salmiakk (NH 4 Cl) som en positiv for pHluorin pH følsomhet og viral infeksjon effektivitet ( Figur 3): 3 mM glukose (2 min) → 50 mM NH 4 Cl (2 min) i 3 mM glukose → 3 mM glukose (2 min)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hele arbeidsflyten teknikken er vist i figur 1. Mus eller menneskelig holmer kan kort, infisert med adenovirus koding NPY-pHluorin og avbildes, etter noen dager i kultur, under AC confocal mikroskop. Som granulater sikring med plasma membranen og åpne, en økning i fluorescens er observert og kan kvantifiseres (figur 1). For å finne ut om NPY-pHluorin er faktisk et egnet verktøy for å overvåke insulin granule dynamics, var infiserte holmer immunostained med antistoffer mot GFP og forskjellige Holme hormoner insulin, somatostatin eller glukagon. De fleste celler som uttrykker NPY-pHluorin (GFP positive) var beta-cellene som de uttrykte også insulin (~ 90%. Figur 2A, 2B). Bare noen glukagon-positive alfa celler eller somatostatin-positive delta celler var GFP-merket (figur 2B). Viktigere, i infiserte celler, NPY fusion colocalized med insulin (Pearsons korrelasjonskoeffisienten til 0,61 ± 0,04 for GFP og insulin g. 0.21 ± 0,05 for GFP og glukagon og 0,07 ± 0,01 for GFP og somatostatin).
Vi vist at pHluorin er en effektiv pH sensor, som øker intracellulær pH med 50 mM NH4Cl resulterte i en > 500% økning i intracellulær fluorescens (figur 3A, 3B, Video 1). Som pH inne granulen ved fusjon med plasma membranen og åpningen av fusion pore blir granulater som inneholder NPY-pHluorin synlige ved forhold som stimulerer insulin exocytosis som membran depolarization med KCl (figur 4, video 2).
Enkelt sekretoriske hendelser i beta-cellene i intakt holmer kan visualiseres med AC confocal tidsinnstilt bildebehandling av NPY-pHluorin infisert holmer. Disse opptrer svar direkte membran depolarization med KCl eller flere andre fysiologiske stimuli (Figur 4 og figur 7, se nedenfor). I basale ekstracellulære glukose konsentrasjon (3 mM), er lite sekretoriske aktivitet observert. Imidlertid utløses granule sammensmelting med plasma membranen svar til stimulering med høy glukose (16 mM) (figur 5A, Video 3). Ved å plassere ROIs med forskjellige størrelser og i ulike områder, kan svaret kinetics av sekretoriske granulater sammenlignes med enkeltceller eller grupper av celler i nærheten (cluster) (figur 5B). Denne typen analyse aktivert å bestemme at: 1) de sekretoriske enkelthendelser er veldig synkronisert og utskilles innen få sekunder fra den gjennomsnittlige celle responsen, og 2) beta-cellene i nærheten formen funksjonelle klynger av synkronisert aktivitet.
Insulinsekresjon i kroppen oppstår på en pulsatile måte. Stimulere de NPY-pHluorin-infiserte holmer med forhøyet glukose konsentrasjon for lengre perioder (15-20 min) ga opphav til flere pulser (eller pakker) av sekresjon (figur 6, Video 4). Under hver puls sikring personlige granulater med plasma membranen i en synkronisert måte som før (figur 5). Pakker med sekretoriske aktivitet kan sett hvert 3-4 min.
Forbigående øker i fluorescens i NPY-pHluorin inneholder granulater kan også sees som svar på purinergic Agonistiske ATP (10 µM) eller muscarinic Agonistiske acetylkolin (ACh, 10 µM) (figur 7), er begge kjent stimulators av insulinsekresjon i menneskelig holmer. Som forventet, utløst membran depolarization med KCl (30 mM) også insulin granule exocytosis (figur 5). Flere stimuli kan brukes på samme Holme utarbeidelse som øyene skylt godt mellom stimuli. Sørg for å endre rekkefølgen på programmet når gjenta eksperimentet.
Figur 1. En ordning illustrerer analysen utviklet. Adenovirus som koder en pH-sensitive GFP (pHluorin) koblet til NPY ble produsert og brukes til å infisere mus eller menneskelig bukspyttkjertelen holmer. Fire til seks dager etter smitte, ble øyene plassert på en dekkglassvæske og fotografert under en oppreist laserskanning AC confocal mikroskop. Den NPY-pHluorin-konstruere uttrykkes i insulin granulater i beta-cellene. Dens fluorescens er slukket på surt pH i eldre insulin granulater men blir lyse på granule fusjon med plasma membranen og eksponering for nøytral ekstracellulære pH i 7.4.
Figur 2. Den NPY Fusion konstruere uttrykkes i Insulin granulater. (A) AC Confocal bilder av intakt menneskelige holmer infisert med NPY-pHluorin, immunostained GFP (grønn) og insulin (venstre panel, rød), somatostatin (midten, rød) eller glukagon (rett, rød). Cellen kjerner vises i blått (DAPI merket). Skalere barer = 10 µm. (B) kvantifisering av brøkdelen av GFP-positive celler som også inneholder enten insulin (Ins), somatostatin (Soma) eller glukagon (Glu). Vist er gjennomsnittlig ± søkemotormarkedsførere, n = 5 holmer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. NPY-pHluorin er en effektiv pH Sensor. (A) maksimal prosjektering av AC confocal bilder av en mus Holme infisert med NPY-pHluorin i ekstracellulære løsning som inneholder 3 mM glukose før (øvre panel, 3 G) og i nærvær av 50 mM NH4Cl (nedre panel). Skala bar = 100 µm. (B) spore viser endringen i mener fluorescens intensitet (vilkårlig enheter) i hele øyen indusert av NH4klasse stiplet linje angir NH4Cl program. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Granulater som inneholder NPY-pHluorin blir synlige når de sikringen med Plasma membranen og åpne. Menneskelige isletsinfected med NPY-pHluorin adenovirus ble incubatEd med plasma membranen fargestoff di-8-ANEPP (rød). Holme stimulering med KCl (30 mM) utløst en plutselig og forbigående utseendet på fluorescerende granulater på celleoverflaten (vist i grønt). AC confocal bilder av celler i en menneskelig Holme vises på før exocytotic svaret (t = 0), under (t = 3-9 s) og etter (t = 12 s). Kontrast ble justert for å fjerne bakgrunnen grønn fluorescens. Skala bar = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Høy glukose utløser NPY-pHluorin Fusion med Plasma membranen. (A) maksimal prosjektering av AC confocal bilder av en intakt menneskelige Holme infisert med NPY-pHluorin i basale glukose konsentrasjon (3 G - 3 mM glukose, venstre panel) eller høy glukose (16 G - 16 mM glukose, høyre panel). Ekstracellulære løsninger inneholdt leiren agenter forskolin og IBMX (se protokollen for detaljer). Skala bar = 10 µm. (B) spor viser endringer i mener fluorescens intensiteter (vilkårlig enheter) i den grønne kanalen i ROIs plassert rundt enkelt sekretoriske hendelser (rød, granule) celler (grønn) eller cellen klynger (blå). Høy glukose ble brukt i 5 min etter ~ 2,5 min 3 g. Fluorescens verdier var normalisert første fluorescens verdien (grunnlinje). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Sekretoriske hendelser genererer diskret pulser av sekresjon på høy glukose. Spor viser endringer i mener fluorescens intensitet (vilkårlig enheter) i ROIs plassert rundt ulike celler i en intakt menneskelige Holme under varig stimulering med 16 mM glukose. Hver farge representerer en enkeltcelle. Utbrudd av sekretoriske aktivitet kan sett hver 3-4 min. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. NPY-pHluorin Fusion med Plasma membranen utløses av kjent Stimulators av Insulin Secretion. Spor viser endringer i mener fluorescens intensitet (vilkårlig enheter) i ROIs plassert rundt sekretoriske enkelthendelser i celler i intakt menneskelige holmer indusert av KCl (30 mM), ATP (10 µM), høy glukose (16G, 16 mM) og acetylkolin (Ach, 10 µM). KCl og ATP ble brukt i basale glukose konsentrasjon (3 mM). Svarte linjer viser den gjennomsnittlige granulen og grå linjer gjenspeiler SEM verdier. Grønne spor viser den tilsvarende celle responsen. Vannrett tidsskalaen (2 min) gjelder for alle diagrammer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1. NPY-pHluorin Adenovirus effektivt infisere Holme celler og følelse pH endringer.
Musen holmer var infisert for 4 dager med adenovirus NPY-pHluorin-koding. Infiserte holmer ble plassert på en dekkglassvæske og montert på tenkelig kammeret. For å øke intracellulær pH, var øyene parfyme med 50 mM NH4Cl lagt til den ekstracellulære løsningen inneholder 3 mM glukose. En rask og sterk økning i fluorescens kan sees på NH4Cl program. Skala bar = 100 µm. Movie hastighet = 5 fps. Total varighet av filmen er 90 s. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 2. Granulater som inneholder NPY-pHluorin blir synlige når de sikringen med Plasma membranen og åpne.
Menneskelige holmer infisert med NPY-pHluorin adenovirus ble inkubert med plasma membranen fargestoff di-8-ANEPP. Holme stimulering med KCl (30 mM) utløst en plutselig og forbigående utseendet på fluorescerende granulater på celleoverflaten. En maksimal projeksjon av AC confocal fly vises. Kontrast ble justert for å fjerne bakgrunnen grønn fluorescens. Skala bar = 20 µm. Movie hastighet = 5 fps. Total varighet av filmen er 60 s. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 3. Høy glukose utløsere Exocytosis av granulater som inneholder NPY-pHluorin.
Blanding av NPY-pHluorin inneholder granulater utløses svar til stimulering med høy glukose (16 mM). I basale ekstracellulære glukose konsentrasjon (3 mM), er lite sekretoriske aktivitet observert. Men på høy glukose vises insulin granulater transiently i plasma membranen i ulike celler i en Holme i en synkronisert måte. Høy glukose ble brukt etter ~ 2,5 min med 3G (16G etiketten vises). En maksimal projeksjon av AC confocal fly vises. Skala bar = 20 µm. Movie hastighet = 10 fps. Total varighet av filmen er 7 min. Klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 4. Langvarig stimulering med høy glukose utløser flere serieopptak av Exocytosis.
Langvarig stimulering med høy glukose gir opphav til flere pulser av sekresjon holmer, hvor granulater transiently vises. Pulser sekretoriske aktivitet kan sees hver ~ 3-4 min. AC Confocal planet av en menneskelig Holme vises. En pseudofarger, det vil ordningen ble brukt for fluorescens intensitet. Skala bar = 20 µm. Movie hastighet = 30 fps. Filmens totale varighet er 20 min. Klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskriptet beskriver en teknikk som kan brukes til å visualisere exocytosis av insulin granulater i beta celler i intakt bukspyttkjertelen holmer av AC confocal mikroskopi. Den bruker NPY-pHluorin som fluorescerende reporteren klonet i adenovirus for å sikre en høy transfection effektivitet.
Selv om metoden var svært effektiv i våre hender, det kreve noen endringer som hovedsakelig avhenger av to parametere: 1) kvaliteten på Holme forberedelser og 2) titer viral aksjer med optimalisering av infeksjon. Før viral infeksjon av holmer, tillate Holme utarbeidelse gjenopprette isolasjon og transport stress overnatting på 37 ° C. Inspisere Holme morfologi under lys mikroskop hele infeksjon/uttrykk periode og sjekk for underskriver av redusert levedyktighet som cellene stikker fra Holme overflaten eller tilstedeværelse av hypoxic celler (mørkere celler) i Holme center18 . Hver viral aksje kan variere i titer og infeksjon. Sørg for å justere volumet på viruset brukes viral titer og tidspunktet for kultur før mikroskopi analysen. Det viktigste trinnet er optimalisering av infeksjon (f.eks, antall virus partikler, kultur tid før analysen) slik at nok av reporteren uttrykkes og Holme integritet og reaksjonsevne opprettholdes. Når du optimaliserer infeksjon protokollen og med hvert nye viral parti, samle litt småøyer på forskjellige tidspunkt og sjekk om exocytosis brakt frem med KCl (30 mM) og/eller høy glukose (16 mM). Vi fant at analysen fungerer bedre og Holme celler forblir sunn og glukose responsiv når MOI er lav (2) og kultur tiden er utvidet (rundt 5 dager) for å øke nivåene av fusion Konstruer uttrykket. Resultatene er i tråd med en tidligere studie viser at effektiv uttrykk for genet produkter kan bedre oppnås ved lavere transfecting konsentrasjoner av adenoviral vektoren samtidig bevare Holme funksjonen19.
Teknikken har imidlertid noen begrensninger. En er at ved hjelp av NPY-pHluorin som reporter, granulater kan visualiseres før de sikring med plasma membranen og fusion pore åpnes. For å studere insulin granule menneskehandel i stedet for exocytosis, kan adenovirus NPY-eGFP-koding brukes i stedet. En annen begrensning er at lavere grad, NPY-pHluorin kan være målrettet til non-insulin inneholder granulat. Men uttrykt flertallet av cellene var infisert med NPY-pHluorin også insulin og mindre enn 10% av cellene uttrykte glukagon eller somatostatin. Faktisk indikerte glukose avhengigheten granule sekresjon, pulsatile mønster og co lokalisering med insulin, at mest sekretoriske hendelser representerer Last utgivelse fra insulin granulat. For å garantere overvåking av insulin oppstår exocytosis, analysen bør utføres under forhold som stimulerer insulinsekresjon (f.eks, høy glukose). Likevel, for å forbedre spesifisiteten av beta-celle uttrykk, NPY-pHluorin kunne settes under kontroll av en mer selektiv promoter som rotte insulin arrangøren. En annen begrensning av teknikken er at det krever uttrykk for eksogene proteiner i insulin korn, som kan forurolige deres biogenesis og/eller atferd20. Dette bør vurderes når tolke resultatene av eksperimenter og, hvis mulig, konklusjonene skal valideres bruker andre insulin granule Last proteiner (f.eksC-peptid, Holme amyloid polypeptid) som journalister.
Denne protokollen anbefaler også inkludert cAMP-raising agenter (IBMX og forskolin) å forsterke effekten av høy glukose på insulin granule exocytosis. Denne stimulering protokollen etterligner aktivering av fysiologisk relevante forsterke veier (utløst av incretins eller paracrine og nevrale signalnettverk molekylene) som forsterke insulinsekresjon av økende leir i bukspyttkjertelen beta-cellene. Likevel, i fravær av cAMP heve agenter, høy glukose (16 mM) også utløser granule exocytosis men sekretoriske hendelsene observert er lavere. Granulater vises i separate pakker, synkroniseres med gjennomsnittlig celle respons, og Vis lignende burst perioder: 1,4-6.6 min i høy glukose pluss IBMX/forskolin g. 1.5-10 min i høy glukose alene.
Analysen beskrevet her er betydelig når det gjelder eksisterende metoder som har tilstrekkelig romlige og tidsmessige oppløsning til å visualisere enkelt fusion hendelser i sanntid i beta-cellene i intakt holmer. For eksempel, avslørt det høy synkroniseringen med som insulin granulater er utgitt i menneskelig holmer på glukose stimulering. Videre hvis holmer er godt festet til dekkglassvæske, kan de bli fotografert lengre (minst 15-20 min). Denne ble brukt til å vise at i menneskelig holmer exocytosis forekommer i forskjellige pakker som vises i perioder ligner på pulsatile i vivo insulinsekresjon. Analysen kan også teste effekten av flere stimuli på insulin exocytosis bruker murine eller menneskelig holmer. Videre fordi den ikke krever Holme celle dissosiasjon som andre metoder, kan den brukes for å studere atferden til beta-celle populasjoner i et liten Holme. Faktisk observerte vi at nabokommunene beta cellene danner klynger av ~ 5-10 celler som aktiviteten er synkronisert. Beta-cellene fra samme sektorgruppe er sannsynligvis koblet gapet krysset kanaler av connexin 3621. Deres synkronisert svar illustrerer beta-celle tilkobling som er avgjørende for riktig insulin sekresjon22.
I fremtiden, kan denne teknikken kombineres med andre fluorescerende fargestoffer for funksjonell tenkelig å visualisere i sanntid hvordan endringer i cytosolic kalsium eller membran potensial, for eksempel samsvarer med granule exocytosis i beta-cellene. Spesielt som nye pH følsom røde fluorescerende proteiner blir tilgjengelig14,23 , og kan være smeltet NPY eller andre insulin granule Last proteiner, kan grønne fargestoffer for funksjonell imaging brukes. Videre, denne teknikken kan kombineres med en mus i vivo avbildning av Stangeriaceae holmer transplantert inn i det fremre kammeret musen øye24. Holmer kan være infisert med adenoviruses 48-72 h før transplantasjon inn i øyet. Immun mangelfull mus bør brukes hvis menneskelige holmer transplanteres. Bruker denne modellen, kan subcellular romlige mønster av insulinsekresjon-granulen være korrelert med vaskulær ordninger25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Marcia Boulina fra DRI imaging kjernen anlegg for hjelp med mikroskop. Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 og R56 DK084321 (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
References
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
- Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
- Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
- Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
- Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478 (2011).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
- Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
- Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
- Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801 (2015).
- Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632 (2015).
- Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
- Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
- Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
- Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target? Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
- Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).
