Confocal Neuropeptide Y-pHluorin의 이미징: 그대로 Murine 인간과 독도에 인슐린과 립 Exocytosis를 시각화 하는 기법
Summary
우리는 pHluorin, pH에 민감한 녹색 형광 단백질을 사용 하 여 그대로 독도에 인슐린 exocytosis의 시각화를 위한 프로토콜을 설명 합니다. 격리 된 독도 소포 화물 neuropeptide Y에 결합 하는 pHluorin를 인코딩 하는 아 데 노 바이러스와 감염 됩니다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 인슐린과 립 퓨전 이벤트의 검출에 대 한 수 있습니다.
Abstract
인슐린 분 비 뿐만 질병에서 정상적인 생리 적인 조건 하에서 포도 당 항상성에서 중심 역할을 한다. 전기 생리학 또는 현미경 형광 기자 들의 표현에 결합 하거나 사용 하는 인슐린과 립 exocytosis 공부를 현재 접근. 그러나 이러한 기술의 대부분 클론 세포 라인에 대 한 최적화 되었습니다 또는 췌 장 독도 해리 요구. 대조적으로, 여기에 제시 된 방법 그대로 췌 장 독도에 인슐린과 립 exocytosis의 실시간으로 시각화 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 먼저 인코딩하는 pH에 민감한 녹색 형광 단백질 (GFP), pHluorin, neuropeptide Y (NPY)에 결합 된 아 데 노 바이러스와 격리 된 췌 장 독도의 바이러스 성 감염을 설명 합니다. 둘째, 우리는 confocal 이미징 독도의 5 일 후에 바이러스 성 감염 및 인슐린과 립 분 비를 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 간단히, 감염 된 독도 이미징 챔버에 coverslip에 배치 되며 지속적으로 다양 한 자극을 포함 하는 extracellular 솔루션과 끼얹는다 되 하는 동안 똑바로 레이저 검사 confocal 현미경 아래 몇 군데. 공초점 이미지는 섬의 50 µ m에 걸친 빠른 공명 스캐너를 사용 하 여 시간 경과 녹음으로 획득 됩니다. 시간이 지남에 따라 인슐린과 립 원형질 막으로 융합을 다음 수 있습니다. 이 절차 또한 단일 실험에서 자극의 배터리를 테스트 가능, 마우스와 인간의 독도 이며 기능적인 화상 진 찰 (예를 들어, 막 잠재력 또는 cytosolic 칼슘 염료)에 대 한 다양 한 염료와 결합 될 수 있다.
Introduction
인슐린은 췌 장의 작은 섬의 베타 세포에 의해 생산 하 고 포도 당 물질 대사1의 키 레 귤 레이 터 이다. 죽음 또는 베타 세포의 기능 장애 포도 당 항상성을 방해 하 고 당뇨병2리드. 인슐린은 캘리포니아2 +에서 출시 된 코어 조밀한과 립에 포장-종속 방식3. 인슐린과 립 exocytosis 규제 어떻게 elucidating 완벽 하 게 이해 어떤 인슐린 분 비를 결정 하 고 당뇨병의 치료에 대 한 새로운 치료 대상의 식별에 대 한 새로운 경로 열 며 필수적 이다.
인슐린 exocytosis는 광범위 하 게 연구 되었습니다 형광 분자와 함께에서 막 커패시턴스 측정 등 미세한 접근 electrophysiological 접근을 사용 하 여. 막 커패시턴스 측정 좋은 시간적 해상도 있고 단일 셀 레코딩을 허용. 그러나, 커패시턴스에 변경 셀의 net 표면 변화를 반영 고 할 하지 개별 퓨전 이벤트를 캡처 또는 다른 비 인슐린 분 비 소포3에서 인슐린과 립 퓨전을 구별. 형광 프로브 및 소포 화물 단백질와 함께 2 광자 또는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 등 미세한 방법을 추가 정보를 제공합니다. 이러한 기술은 단일 exocytotic 이벤트 및 사전 및 사후 exocytotic 단계를 캡처하고 셀3의 인구에 있는 exocytotic 패턴을 공부 하 고 사용할 수 있습니다.
형광 기자 세 가지 유형의 수: 1) extracellular, 2) 세포질, 또는 3) 나노미터. 1) extracellular 기자는 extracellular 환경4를 통해 소개 될 수 있는 폴라 추적기 (예를 들어, dextrans, sulforhodamine B (연료 부스터), 루시퍼 노란색, pyranine). 폴라 추적기를 사용 하 여 셀의 인구에는 퓨전의 조사 가능 하며 혈관 등 다양 한 세포 구조를 캡처합니다. 그러나, 그들은 소포 화물 동작에 보고 하지 않습니다. 2) 세포질 기자는 세포질 얼굴과 도킹 및 exocytosis에 참여 막 관련 단백질에 결합 하는 형광 프로브. 예는 신경 전달 물질 방출5공부에 대 한 신경 과학에서 성공적으로 사용 된 성 N-ethylmaleimide-민감한 요소 첨부 단백질 수용 체 (무) 가족 구성원을 포함 합니다. 이러한 여러 바인딩 파트너는 단백질과 인슐린과 립 하지 않습니다 특정. 3) 기공을 기자는 화물 전용 기 행동의 조사에 대 한 허용 하는 기공을 화물 단백질을 융합 하는 형광 프로브. 인슐린과 립 특정 화물 단백질 등이 인슐린, c-펩 티 드, 작은 섬 녹말 체 폴 리 펩 티 NPY 등6,7. NPY는 인슐린과 립, 포함에 이며 공동 출시, 인슐린과 형광 기자8에 대 한 우수한 파트너 만들기.
Exocytosis 신경 내 분 비 세포, 특정 synaptotagmin isoforms9,10 의 요구 등의 다양 한 측면을 연구 NPY 다른 형광 단백질의 융합 이전 고용 방법 방출의 시간-과정에 따라 다릅니다 말라 골격 myosin II11,12. 이 연구에서 우리는 비 형광은 수정 된 GFP가 형광 기자로 pHluorin를 선택 고밀도 코어 내부 산 성 pH에서과 립 하지만 된다 중립 extracellular pH13에 노출 되 면 밝은 형광. 성숙한 인슐린과 립 산 성 pH를 5.5 아래 있다. 일단은 립 원형질 막 및 열립니다 퓨즈, 그것의 화물 수 기자로 서 pH에 민감한 단백질 pHluorin 사용 하 여7,147.4의 extracellular 중립 pH에 노출 됩니다.
PH 민감한 성격의 pHluorin 그리고 인슐린과 립에 있는 NPY의 선택적 식에 비추어 NPY pHluorin 퓨전 구문 인슐린과 립 exocytosis의 다양 한 속성을 공부를 사용할 수 있습니다. 융해 구성의 바이러스 배달 높은 transfection 효율을 보장 하 고 고립 된 섬에 뿐만 아니라 기본 베타 셀 또는 셀 라인에 작동 합니다. 이 방법은 exocytosis NPY 포함 된 소포와 다른 세포 유형에서 공부에 대 한 지침으로 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 exocytosis에 어떤 유전자 변형 마우스 모델 연구 특정 조건 (knockdowns, overexpression, 등)의 효과를 결합할 수 있습니다. 이 기술은 이전 인간의 독도15베타 세포 인구에서 인슐린과 립 분 비의 공간 및 시간 패턴을 특성화 하기 위해 사용 되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고는 confocal 현미경 검사 법에 의해 exocytosis 그대로 췌 장 독도 내 베타 세포에서 인슐린 알갱이의 시각화를 사용할 수 있는 기술을 설명 합니다. 그것은 높은 transfection 효율을 보장 하기에 아 데 노비 루스 복제 형광 기자로 NPY-pHluorin를 사용 합니다.
방법은 우리 손에 고효율, 그것은 주로 두 개의 매개 변수 의존 하는 몇 가지 수정 해야 할 수도 있습니다: 1) 섬 준비, 및 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 현미경으로 도움말에 대 한 핵심 시설을 이미징 DRI에서 마 샤 Boulina 감사 합니다. 이 작품은 NIH 교부 금 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 및 R56 DK084321 (AC)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22×40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
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