IκB kinaz 1/α (IKK1/α CHUK) hücresel etkinliklerle öncelikle NF-κB transkripsiyon faktörleri aktivasyonu sayısız ilgilenmektedir Ser/Thr protein kinaz olduğunu. Burada, üretim ve kristal yapısı bu protein tayini için gerekli ana adımları açıklar.
Bir sınıf hücre dışı uyaranların bir NF-κB alt birimi, p52, onun öncü p100 işlenmesi yoluyla nesil ikna etmek için IKK1/α aktivasyonu gerektirir. bir homodimer veya başka bir NF-κB alt birimi, RelB ile heterodimerdir P52 görür. Bu dimer sırayla genler inflamasyon, hücre hayatta kalma ve hücre döngüsü dahil yüzlerce ifade düzenler. IKK1/α öncelikle üçlü bir kompleks olarak IKK2/β ve NEMO ile ilişkili olarak kalır. Ancak, küçük bir havuz da düşük molekül ağırlıklı complex(es) görülmektedir. Bilinmeyen mi p100 işleme faaliyet IKK1/α aktivasyonu içinde daha büyük veya daha küçük karmaşık havuzu tarafından tetiklenir. IKK1/α bünye faaliyet çeşitli kanserler ve inflamatuar hastalıklarda algılandı. IKK1/α aktivasyonu mekanizmasını anlamak ve bir uyuşturucu hedef olarak kullanılmasını etkinleştirmek için biz rekombinant IKK1/α E. coligibi farklı ana bilgisayar sistemleri ifade böcek ve memeli hücreleri. Biz başarılı çözünür IKK1/α baculovirus içinde ifade son derece saf protein miktarda mg alma, huzurunda inhibitörleri crystallizing ve x-ışını kristal yapısını belirleme böcek hücreleri enfekte. Burada, Rekombinant protein, onun kristalizasyon ve onun x-ışını kristal yapısı belirlenmesi üretmek için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır.
Transkripsiyon dimerik transkripsiyon faktörleri NF-κB ailesinin faaliyetlerinin inflamasyon ve bağışıklık yaşam ve ölüm arasında değişen çeşitli hücresel fonksiyonları için gereklidir. Bu etkinlikler hücrelerinde ve otoimmün hastalıklar ve kanser1,2,3dahil olmak üzere çeşitli patolojik koşullar yönetmelik yol açar bir kayıp sıkı kontrol edilir. Bir uyarıcı yokluğunda, NF-κB faaliyetlerinin IκB (inhibitörü – κB olan) proteinler4tarafından Inhibe tutulur. IκB protein üzerinde belirli Ser kalıntılarının fosforilasyon bunları ubiquitination ve sonraki proteasomal bozulma ya da seçici işleme5için işaretler. İki son derece homolog Ser/Thr kinaz, IKK2/β ve IKK1/α, NF-κB aktiviteleri merkezi düzenleyiciler Bu fosforilasyon olaylar6,7taşıyarak hareket.
Bir ligand ve bir reseptör arasındaki etkileşimler arabulucu NF-κB faktörleri harekete geçirmek için önde gelen bir dizi sinyal transduces. NF-κB sinyal verme işlemi genel olarak iki farklı yolları-kurallı ve kanonik olmayan (alternatif)8sınıflandırılabilir. IKK2/β etkinliği öncelikle iltihaplı ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtı9için esastır kurallı yolun NF-κB sinyal düzenlemektedir. IKK2/β10 içinde şimdiye kadar biyokimyasal olarak uncharacterized IKK karmaşık bir hızlı ve kısa ömürlü aktivasyon ayrı özelliğidir bu yolu — IKK1 ve IKK2 yanı sıra düzenleyici bir bileşeni, NEMO (NF-κB temel modülatör oluşan olduğu tahmin )11,12,13. İki katalitik IKK alt birimleri IKK kompleks arasında IKK2 için NF-κB ve aynı zamanda atipik bir IκB protein bağlı öncelikle sorumlu14 için prototip IκBs (α, – β ve – γ) belirli kalıntılarının fosforilasyon olduğunu NF-κB1/olan p105, bir NF-κB p50 alt birim5habercisi. Fosforilasyon ubiquitination indüklenen ve proteasomal bozulma IκB (veya p105 işlenmesi), yayın ve NF-κB dimer15belirli bir kümesi aktivasyonu yol açar. Anormal NF-κB etkinliği IKK2 yanlış düzenlenmiş fonksiyonu nedeniyle birçok kanserleri de olduğu gibi otoimmün hastalıklar2,3,16gözlenmiştir.
IKK2/β aksine, temel geliştirme ve dokunulmazlık için kanonik olmayan yolun NF-κB sinyal IKK1/α etkinlik düzenlemektedir. IKK1 NF-κB2/p100 belirli artıkları, işleme ve p52 nesil yol açar, C-terminal IκBδ kesimindeki phosphorylates. Transcriptionally etkin p52:RelB heterodimerdir oluşumu gelişimsel sinyalleri7,17,18,19,20yavaş ve sürekli yanıt başlatır. İlginçtir, merkezi NF-κB faktör p52 döngüsünün bu nesil eleştirel bir başka faktör, NF-κB Inducing kinaz (NIK)21,22, ama değil IKK2 veya NEMO bağlıdır. Resting hücrelerde, NIK düzeyini nedeniyle onun sürekli proteasome bağlı bozulma23,24,25düşük seviyede kalır. Hücreleri tarafından ‘kanonik olmayan’ ligandlar ve bazı kötü huylu hücrelerin uyarılması, NIK ve IKK1 etkinleştirmek için stabilize olur / α. kinaz faaliyetleri NIK ve IKK1 verimli p100 p527içine işleme için gereklidir. IKK1 ve NIK işleme ve p52 üretimi için önde gelen onun C-terminal IκBδ kesimi üzerindeki üç serines (Ser866, 870 ve 872) NF-κB2/p100 fazdan. Kanonik olmayan aktivasyonu anormal multipl miyelom26,27,28de dahil olmak üzere birçok maligniteler karıştığı olmuştur.
Hiçbiri bu kadar etkili bir ilaç olduğunu kanıtladı, ancak birkaç son derece verimli ve belirli inhibitörleri IKK2/β için bilinir. Buna ek olarak, IKK1/α-özel inhibitörleri seyrek. Bu kısmen yapısal ve biyokimyasal bilgilerini NF-κB IKK1 hücreleri ve akılcı ilaç tasarım tarafından aktivasyonu mekanik temeli anlayışımız sınırlar IKK1/α üzerinde bizim eksikliği kaynaklanıyor. IKK2/β X-ray yapılarının IKK2/β29etkinleştirme mekanizması anlayışlar sağladı; Ancak, bu yapıların ne kadar farklı ters yönde uyaranlara açığa olabilir değil tetiklemek harekete geçirmek IKK1/α veya IKK2/β NF-κB faaliyetleri 30,31farklı kümeleri düzenleyecek. IKK1/α farklı sinyal verme işlevi temel mekanik olarak anlamak ve akılcı ilaç tasarımı için bir platform oluşturmak için IKK1/α yapısını belirleme üzerinde duruldu.
Üretim, kristalizasyon ve yapı çözüm iki ilgili IKK proteinlerin
Biz IKK1/α X-ray kristal yapısı deneyimlerimiz IKK2/β protein üretim, kristalizasyon ve yapı belirlenmesi ile verilen nispeten basit bir egzersiz olacaktır kavramı ile belirlemek için yola çıktı. Ancak, biz bu iki ilgili proteinler kristalizasyon kolaylığı ile ilgili çok farklı davrandığını çok şaşırdık. Birkaç yüksek profilli laboratuvarları çabalarına rağmen yaklaşık yirmi IKK1 yapı tayini aldı….
The authors have nothing to disclose.
Personel beamlines 19ID, 24ID ve 13ID kaynağında Gelişmiş foton, Lemont, IL, çeşitli kristalleri veri toplama sırasında destek için teşekkür ediyoruz. Düşük çözünürlüklü cryo-EM harita EM harita/bina, ilk IKK1 moleküler yerine arama model oluşturmak için kullanılan modeli erken aşamalarında bize alma için Dmitry Lyumkis, Salk Enstitüsü için minnettarız. Bu sonuçlar için önde gelen araştırma gelen NIH hibe AI064326, CA141722 ve GM071862 GG için fon aldı. SP Şu anda bir hoş geldiniz güven DBT Hindistan ara biri.
Cellfectin/Cellfectin II | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II |
Sf900 III Insect cell medium | Thermo Fisher Scientific | 12658-027 | |
SF9 cells | Thermo Fisher Scientific | 12659017 | |
anti-IKK1 antibody | Novus Biologicals | NB100-56704 | Previously sold by Imgenex |
anti-PentaHis antibody | Qiagen | 34460 | |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Nitrocellulose can also be used |
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
Bradford assay reagent | BioRad | 500001 | |
Superdex 200 column | GE Healthcare | 28989335 | |
Amicon concentrator | Millipore | UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024 | |
Compound A | Bayer | ||
Calbiochem IKK-inhibitor XII | Calbiochem | 401491 | |
Staurosporine | SIGMA | S4400 | |
MLN120B | Millenium | Gift item | |
AMPPNP | SIGMA | A2647 | |
Dextran sulfate | SIGMA | 51227, 42867, 31404, | |
Dextran sulfate | Alfa Aesar | J62101 | |
PEG | SIGMA | 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 | Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #. |
Crystallization Screens | |||
Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) | Hampton Research | HR2-130 | |
Index HT | Hampton Research | HR2-134 | |
PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) | Hampton Research | HR2-139 | |
PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) | Hampton Research | HR2-086 | |
SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) | Hampton Research | HR2-136 | |
Crystal mounts | Hampton Research | HR8-188, 190, 192, 194 | |
Synchrotron | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory | Beamline 19 ID | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines. |