Summary

Härledning av stamcellslinjer från musembryon preimplantatorisk

Published: August 20, 2017
doi:

Summary

I artikeln beskrivs ett protokoll för att effektivt härleda och kultur pluripotenta stamcellslinjer från musembryon på blastocyststadiet.

Abstract

Mus embryonala stamceller (mESC) härledning är den process genom vilken pluripotenta cellinjer är etablerade från preimplantatorisk embryon. Dessa rader kvar möjligheten att antingen själv förnya eller skilja särskilda villkor. Tack vare dessa egenskaper är mESC ett användbart verktyg i regenerativ medicin, sjukdom modellering och vävnad ingenjörsstudier. I artikeln beskrivs ett enkelt protokoll för att få mESC linjer med hög härledning effektivitet (60-80%) av odlingsskålar blastocyster från tillåtande mus stammar på mataren celler i definierade medium kompletteras med leukemi hämmande faktor. Protokollet kan också användas för att effektivt härleda mESC linjer från icke-tillåtande mus stammar, genom enkla tillägg av en cocktail av två småmolekylär hämmare till härledning medium (2i medium). Detaljerade förfaranden för utarbetning och kultur av mataren celler, insamling och musembryon, och härledning kultur och kultur av mESC linjer finns. Detta protokoll kräver inte specialutrustning och kan utföras i ett laboratorium med grundläggande däggdjursceller kultur expertis.

Introduction

Embryonala stamceller (ESC) är pluripotenta celler från preimplantatorisk embryon, som kvar möjligheten att antingen själv förnya eller skilja under särskilda villkor1. Baserat på dessa egenskaper, ESC har blivit ett användbart verktyg för regenerativ medicin, sjukdom modellering och tissue engineering studier2.

ESC härleddes för första gången från preimplantatorisk musembryon, med ursprung mus ESC (mESC) linjer med låg framgång3,4. För år förblev härledning effektivitet låg på grund av svårigheten att upprätthålla pluripotency in vitro. Förutom förekomsten av mataren celler5, som förbättrar härledning effektivitet, främja kolonin fastsättning och förbättra karyotypic stabilitet6, flera ändringar av protokollet bly till en förbättring av pluripotency underhåll. Den viktigaste var tillägget av leukemi hämmande faktor (LIF) till mESC odlingsmedium7,8, användningen av embryon från 129S2 tillåtande bakgrunden9 och kulturen av mESC med medium kompletteras med definierade serum, fria från potentiella differentiering faktorer10. Mer nyligen, övertygande bevis har visat att tillägg av en cocktail av två småmolekylär modulatorer av signalvägar till odlingsmediet mESC (känd som 2i) är bäst att upprätthålla pluripotency. 2i cocktail består av en kombination av den MEK-hämmaren PD0325901, vilket minskar de differentiering signalerna genom att hämma mitogen-aktiverat protein kinase (MAPK) vägen, och den GSK3β-hämmaren CHIR99021, som förbättrar cellöverlevnad vid låg densitet genom att aktivera Wnt väg11.

I denna artikel skall beskriva vi ett enkelt protokoll för att effektivt härleda mESC linjer från mus blastocyster. Vi följer standardprocedurer, odla embryon från tillåtande stammar på mataren celler i härledning medium kompletteras med LIF och ett serum ersätter12. Efter detta protokoll, mESC linjer kan härledas med effektivitetsvinster som är likvärdiga med dem som erhållits i 2i medium. Trots detta kan 2i läggas för att undvika eventuella problem med pluripotency underhåll eller när du arbetar med icke-tillåtande stammar.

Protocol

användning av de djur som beskrivs i avsnitten nedan har godkänts av den etiska kommittén om djurs och människors forskning av den Universitat Autònoma de Barcelona och Departament d ' Agricultura, Ramaderia, Pesca jag Alimentació av Generalitat de Catalunya (protokoll #8741). 1. mataren Cell inaktivering och lagring Obs: mänskliga förhud fibroblaster (HFF-1) var tidigare frysta i 1 mL iskallt lösning bestående av 90% fetalt bovint Serum (FBS) och 10%…

Representative Results

Efter detta protokoll, över 95% av utväxt bildandet bör uppnås efter den första veckan av kultur (figur 1A). Etablering av mESC linjer efter sex passager är variabel bland experimental replikat, med en genomsnittlig framgång på 60-80%. Tillägg av 2i avsevärt förbättras inte resultaten när du arbetar med tillåtande mus stammar, såsom de med en 129S2 bakgrund, men det är nödvändigt när man arbetar med icke-tillåtande stammar. <p class="j…

Discussion

Även om mESC linje härledning är ett välkänt förfarande som rutinmässigt används i många laboratorier, är dess effektivitet inte alltid så höga som förväntat på grund av flera faktorer som kan störa pluripotency underhåll. I denna artikel visar vi, steg för steg, hur du upprättar mESC linjer med hög effektivitet med en enkel och pålitlig-protokollet. Dessa effektivitetsvinster är liknande dem som rapporterats i litteraturen.

För att säkerställa maximal effektivitet, de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Jonatan Lucas för hans tekniskt bistånd med feeder cellkultur, Servei Estabulari de la UAB för djurens vård och Domènec Martín för inspelning av video. Detta arbete har stötts av Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R och Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC är mottagare av en PIF-UAB gemenskap.

Materials

1 mL sryringe BD  309628
2-β-mercaptoethanol Life Technologies 31350-010
4-well plate Thermo Scientific Nunc 176740
Acidic Tyrode's solution  Home-made See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. 
BSA Sigma A3311
Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 Molecular Probes – Invitrogen A-21200 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. 
CHIR990212 Axon Medchem  1386 Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. 
CryoTube Thermo Scientific Nunc 3754518
DMSO Sigma 41640
DMEM BioWest L0107
FBS BioWest S1810 Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC
Flushing needle BD  304000 Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone
Gelatin from porcine skin Fluka 48724 Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 Molecular Probes – Invitrogen A-11037 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. 
HBSS BioWest L0611
Hepes-buffered CZB  Home-made See composition in Chatot et al, 1989
Human chorionic gonadotropin Divasa-Farmavic Veterin-Corion 3000 UI Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. 
Human foreskin fibroblasts ATCC ATCCSCRC-1041 For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.
KnockOut Serum Replacement Life Technologies  10828-028 Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.   
KSOMaag Evolve Zenith Biotech ZEKS-050 Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use.
Leukemia Inhibitory Factor Merk Millipore ESG1106
Mice  Charles River/Harlan It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. 
Mineral oil Sigma M8410 Embryo tested. Photosensitive. 
Mitomycin C Serva 2980501 Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. 
Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) Biolegend MMS-435P 1:500 dilution
Mouse monoclonal anti-αSMA Sigma A5228 1:200 dilution
Mouse monoclonal anti-AFP R&D Systems MAB1368 1:50 dilution
Mouse monoclonal anti Oct3/4  Santa cruz Sc-5279 1:50 dilution
Non-Essential Amino Acids Life Technologies 11140-035
PD0325901 Axon Medchem  1408 Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles.
Petri dish (35mm) Thermo Scientific Nunc 153066
Petri dish (60mm) Thermo Scientific Nunc 150288
Pregnant mare's serum gonadotropin Foligon Foligon-1000 UI Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. 
Rabbit policlonal anti-Sox2 Merck Millipore AB5603 1:200 dilution
T75 falcon Thermo Scientific 130190
Trypsin-EDTA 10x BioWest X0930 Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution

References

  1. Biswas, A., Hutchins, R. Embryonic stem cells. Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).
  2. Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).
  3. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  5. Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).
  6. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).
  7. Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).
  8. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
  9. Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).
  10. Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer. Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).
  11. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  12. Wakayama, S., et al. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies. Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).
  13. Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).
  14. Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. . Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).
  15. Lee, K. H. Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture. Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).
  16. Ma, Y., et al. Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).
  17. Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).
  18. Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells. Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).
  19. Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency. Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).

Play Video

Cite This Article
Vila-Cejudo, M., Ibañez, E., Santalo, J. Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56171, doi:10.3791/56171 (2017).

View Video