Härledning av stamcellslinjer från musembryon preimplantatorisk

Summary

I artikeln beskrivs ett protokoll för att effektivt härleda och kultur pluripotenta stamcellslinjer från musembryon på blastocyststadiet.

Abstract

Mus embryonala stamceller (mESC) härledning är den process genom vilken pluripotenta cellinjer är etablerade från preimplantatorisk embryon. Dessa rader kvar möjligheten att antingen själv förnya eller skilja särskilda villkor. Tack vare dessa egenskaper är mESC ett användbart verktyg i regenerativ medicin, sjukdom modellering och vävnad ingenjörsstudier. I artikeln beskrivs ett enkelt protokoll för att få mESC linjer med hög härledning effektivitet (60-80%) av odlingsskålar blastocyster från tillåtande mus stammar på mataren celler i definierade medium kompletteras med leukemi hämmande faktor. Protokollet kan också användas för att effektivt härleda mESC linjer från icke-tillåtande mus stammar, genom enkla tillägg av en cocktail av två småmolekylär hämmare till härledning medium (2i medium). Detaljerade förfaranden för utarbetning och kultur av mataren celler, insamling och musembryon, och härledning kultur och kultur av mESC linjer finns. Detta protokoll kräver inte specialutrustning och kan utföras i ett laboratorium med grundläggande däggdjursceller kultur expertis.

Introduction

Embryonala stamceller (ESC) är pluripotenta celler från preimplantatorisk embryon, som kvar möjligheten att antingen själv förnya eller skilja under särskilda villkor¹. Baserat på dessa egenskaper, ESC har blivit ett användbart verktyg för regenerativ medicin, sjukdom modellering och tissue engineering studier².

ESC härleddes för första gången från preimplantatorisk musembryon, med ursprung mus ESC (mESC) linjer med låg framgång^3,4. För år förblev härledning effektivitet låg på grund av svårigheten att upprätthålla pluripotency in vitro. Förutom förekomsten av mataren celler⁵, som förbättrar härledning effektivitet, främja kolonin fastsättning och förbättra karyotypic stabilitet⁶, flera ändringar av protokollet bly till en förbättring av pluripotency underhåll. Den viktigaste var tillägget av leukemi hämmande faktor (LIF) till mESC odlingsmedium^7,8, användningen av embryon från 129S2 tillåtande bakgrunden⁹ och kulturen av mESC med medium kompletteras med definierade serum, fria från potentiella differentiering faktorer¹⁰. Mer nyligen, övertygande bevis har visat att tillägg av en cocktail av två småmolekylär modulatorer av signalvägar till odlingsmediet mESC (känd som 2i) är bäst att upprätthålla pluripotency. 2i cocktail består av en kombination av den MEK-hämmaren PD0325901, vilket minskar de differentiering signalerna genom att hämma mitogen-aktiverat protein kinase (MAPK) vägen, och den GSK3β-hämmaren CHIR99021, som förbättrar cellöverlevnad vid låg densitet genom att aktivera Wnt väg¹¹.

I denna artikel skall beskriva vi ett enkelt protokoll för att effektivt härleda mESC linjer från mus blastocyster. Vi följer standardprocedurer, odla embryon från tillåtande stammar på mataren celler i härledning medium kompletteras med LIF och ett serum ersätter¹². Efter detta protokoll, mESC linjer kan härledas med effektivitetsvinster som är likvärdiga med dem som erhållits i 2i medium. Trots detta kan 2i läggas för att undvika eventuella problem med pluripotency underhåll eller när du arbetar med icke-tillåtande stammar.

Protocol

användning av de djur som beskrivs i avsnitten nedan har godkänts av den etiska kommittén om djurs och människors forskning av den Universitat Autònoma de Barcelona och Departament d ' Agricultura, Ramaderia, Pesca jag Alimentació av Generalitat de Catalunya (protokoll #8741). 1. mataren Cell inaktivering och lagring Obs: mänskliga förhud fibroblaster (HFF-1) var tidigare frysta i 1 mL iskallt lösning bestående av 90% fetalt bovint Serum (FBS) och 10%…

Representative Results

Efter detta protokoll, över 95% av utväxt bildandet bör uppnås efter den första veckan av kultur (figur 1A). Etablering av mESC linjer efter sex passager är variabel bland experimental replikat, med en genomsnittlig framgång på 60-80%. Tillägg av 2i avsevärt förbättras inte resultaten när du arbetar med tillåtande mus stammar, såsom de med en 129S2 bakgrund, men det är nödvändigt när man arbetar med icke-tillåtande stammar. <p class="j…

Discussion

Även om mESC linje härledning är ett välkänt förfarande som rutinmässigt används i många laboratorier, är dess effektivitet inte alltid så höga som förväntat på grund av flera faktorer som kan störa pluripotency underhåll. I denna artikel visar vi, steg för steg, hur du upprättar mESC linjer med hög effektivitet med en enkel och pålitlig-protokollet. Dessa effektivitetsvinster är liknande dem som rapporterats i litteraturen.

För att säkerställa maximal effektivitet, de…

Materials

1 mL sryringe	BD	309628
2-β-mercaptoethanol	Life Technologies	31350-010
4-well plate	Thermo Scientific Nunc	176740
Acidic Tyrode's solution	Home-made		See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M.
BSA	Sigma	A3311
Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488	Molecular Probes – Invitrogen	A-21200	1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies.
CHIR990212	Axon Medchem	1386	Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles.
CryoTube	Thermo Scientific Nunc	3754518
DMSO	Sigma	41640
DMEM	BioWest	L0107
FBS	BioWest	S1810	Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC
Flushing needle	BD	304000	Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone
Gelatin from porcine skin	Fluka	48724	Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594	Molecular Probes – Invitrogen	A-11037	1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody.
HBSS	BioWest	L0611
Hepes-buffered CZB	Home-made		See composition in Chatot et al, 1989
Human chorionic gonadotropin	Divasa-Farmavic	Veterin-Corion 3000 UI	Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again.
Human foreskin fibroblasts	ATCC	ATCCSCRC-1041	For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.
KSOMaag Evolve	Zenith Biotech	ZEKS-050	Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use.
Leukemia Inhibitory Factor	Merk Millipore	ESG1106
Mice	Charles River/Harlan		It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor.
Mineral oil	Sigma	M8410	Embryo tested. Photosensitive.
Mitomycin C	Serva	2980501	Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer.
Mouse anti-tubulin β III (Tuj1)	Biolegend	MMS-435P	1:500 dilution
Mouse monoclonal anti-αSMA	Sigma	A5228	1:200 dilution
Mouse monoclonal anti-AFP	R&D Systems	MAB1368	1:50 dilution
Mouse monoclonal anti Oct3/4	Santa cruz	Sc-5279	1:50 dilution
Non-Essential Amino Acids	Life Technologies	11140-035
PD0325901	Axon Medchem	1408	Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles.
Petri dish (35mm)	Thermo Scientific Nunc	153066
Petri dish (60mm)	Thermo Scientific Nunc	150288
Pregnant mare's serum gonadotropin	Foligon	Foligon-1000 UI	Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again.
Rabbit policlonal anti-Sox2	Merck Millipore	AB5603	1:200 dilution
T75 falcon	Thermo Scientific	130190
Trypsin-EDTA 10x	BioWest	X0930	Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution