Summary
ここでは、TIP60 枯渇 MCF10A 乳房の上皮細胞を用いた創傷治癒のアッセイで細胞遊走のリアルタイム モニタ リングを提案します。生細胞イメージング プロトコルの実装を分析し、リアルタイムの時間の単一細胞運動を可視化することができます。
Abstract
創傷治癒の試金は効率的な細胞移行の培養を研究する最も経済的な方法の一つ。従来、画像は位相差顕微鏡を用いた実験の前後に撮影が、傷の閉鎖によって細胞の移行の能力が評価されます。ただし、細胞運動は動的な現象を単一セルの動きを追跡するため、従来の方法を指定することはできません。現在の創傷治癒のアッセイを向上させるため、生細胞イメージング技術を使用して、リアルタイムで細胞の移動を監視します。このメソッドは、追跡システムのセルに基づいてセル移行レートを決定することができます、細胞遊走と細胞増殖との間の明確な区別を提供します。ここでは、我々 は TIP60 の存在によって影響を受ける乳房の上皮細胞のさまざまな移行能力を研究するためのアッセイの創傷治癒の生きているセルイメージ投射の使用を示します。細胞の運動性は非常にダイナミックな私たちのメソッドは創傷創傷閉鎖創傷治癒の試金のためのイメージングの伝統の技術で撮影したスナップショットよりも治癒のプロセスに洞察力を提供します。
Introduction
HIV Tat インタラクティブ蛋白質 60 kDa (TIP60) はヒストンと非ヒストン蛋白質1,2の両方ことができる従ってリジン アセチルトランスフェラーゼです。その機能は転写、DNA 損傷修復、およびアポトーシス1,3,4,5,6,を含む複数のシグナル伝達経路に影響があることが判明します。7,8しますさらに、TIP60 はしばしば癌のダウンレギュ レートのダウンレギュレーションがん転移と相関していると貧しい人々 の生存率は9、10、11,12、。 13,14。腫瘍の転移は癌関連死の主要な原因です。それはマルチ ステップ プロセスと移行と隣接する組織15,16に腫瘍細胞の浸潤、転移の最初のステップが含まれます。そのためには、腫瘍細胞はまず原発腫瘍固まり、総称して侵入した細胞シートの形式のいずれかからデタッチする必要があります。 またはとして単一セル17戸します。このプロセス中に腫瘍細胞はしばしば上皮間葉転換 (EMT) 形態と細胞接着機能17,18変更を伴うに受けること。
移行を検討するいくつかの手法が開発されて、培養細胞の浸潤性腫瘍。その中で、創傷治癒の試金は最も効率的で経済的な19です。まず、この方法は、細胞、細胞に移行し、ギャップを埋めるようにコンフルエント単層の人工ギャップの作成を含みます。第二に、実験の前後でのギャップの画像をキャプチャできます。最後に、ギャップ閉鎖の比較を使用して、細胞の移動の速度を決定します。位相差顕微鏡は通常従来の創傷治癒の試金のための画像をキャプチャする使用されます。創傷治癒の試金のもう一つの利点は、生体内で腫瘍細胞の遊走が一部似ているです。同様に腫瘍転移生体内でアッセイの創傷治癒過程で細胞の移動は上皮シートの集団の移動と独立した単一細胞の移動を示します。
細胞遊走は動的である知られているし、リアルタイムで細胞の動きを文書化する必要があります。例えば、従来の創傷治癒の測定は単一セルの動きを分析する研究者を許可しません。一方、創傷治癒アッセイ用細胞は、しばしば、血清飢餓細胞増殖を抑制します。これは細胞増殖のためギャップ閉鎖の可能性を排除するためです。それにもかかわらず、されますが、いくつかの増殖と細胞死、位相差像の実験はそれらを区別することができる前に撮影します。
生細胞イメージング技術従来の創傷治癒の試金のこの制限に対処します。ライブ イメージング顕微鏡を用いた CO2インキュベーターと適切な温度制御と組み合わせることで、研究者はギャップの大きさを測定できるし、の先端に位置する細胞積極的に移行の動きをトレースしながら時間をかけて閉鎖率、侵襲的なフロント。つまり、住セルイメージ投射細胞の移動を監視するための実装セル移行のより良い視覚化を提供しませんが、また、細胞遊走と細胞増殖より提供を区別する可能性のよう細胞遊走の信頼性の高い解析。
本研究では MCF10A 乳腺上皮細胞は創傷治癒の試金と住セルイメージ投射細胞遊走の TIP60 の役割を研究するの組み合わせを示すため使用されました。MCF10A 細胞内移行能力 TIP60 の枯渇の結果します。
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Protocol
1. 準備
- MCF10A 培養液の準備: ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) F12 (1:1) 5% 馬の血清、20 ng/mL 上皮成長因子、0.5 mg/mL ヒドロコルチゾン、100 ng/mL コレラ毒素、10 μ g/mL インスリン/。
- 無血清培地の準備: 20 ng/mL 上皮成長因子、0.5 mg/mL ヒドロコルチゾン、100 ng/mL コレラ毒素と 10 μ g/ml インスリン DMEM/f12 キー (1:1)。
- 次の siRNA シーケンスを使用します。
siControl:
フォワード: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
逆: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
siTIP60:
フォワード: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
逆: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3' - 10 cm の細胞培養皿および 24 ウェルのプレートを使用します。
2. 一時的な枯渇 TIP60 による siRNA の
- 1 日目、トランスフェクション試薬 (例えば、 Lipofectamine RNAiMAX) の 15 μ L 分注、2 mL の血清媒体 (例えば、オプティ MEM) を削減し、それぞれ各の siRNA (10 μ M 株式) の 10 μ L でそれらをミックスします。
- 20 分間室温で混合物を孵化させなさい。
- 10 cm 皿で培養液 3 mL と 1 x 106 MCF10A 細胞を播きます。診断を使用してセルをカウントします。
- 10 cm 皿に siRNA の混合物によって滴を追加します。
- セルは、37 ° C の定温器に入れる前に均等に分散して確保するため料理を振る。
- インキュベーションの 6 h は後に、、新鮮な培養液 8 ml siRNA 含有培地を交換します。
- 2 日目、siRNA 混合の別のバッチを準備し、20 分間室温でインキュベートします。
- 追加 1 日目に培養液 8 mL を吸引し、新鮮な培養液 3 mL で置き換えます。
- 一滴ずつ料理に siRNA の混合物の 2 番目のバッチを追加します。試薬がインキュベーターに入れる前に混合される完全にできるように料理を振る。
- 6 時間後、siRNA を含む媒体を新鮮な培養液 8 mL に置き換えます。
3 創傷治癒の試金のため種の細胞
- 3 日目、培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) バッファーの 2 mL で一度セルを洗浄します。PBS バッファーを破棄します。
- SiControl と siTIP60 処理細胞をプレートに 1 mL のトリプシン-EDTA バッファー x 1 を追加することによって trypsinize します。20 分のためのインキュベーターに戻ってそれを置きます。
- 各プレートに完全な培養液 4 mL を追加、ピペッティングにより細胞を再懸濁します、15 mL チューブに転送します。
- 5 分の 200 g で遠心し、上清を除去します。
- 再細胞の無血清培地 5 ml を中断し、診断を使用してセルをカウントします。
- SiControl と siTIP60; 6 × 105セル/mL の細胞懸濁液を準備します。細胞が十分に混合されたことを確認します。100% の confluency ように 24 ウェル プレートのウェル 1 個に細胞懸濁液 500 μ L を追加します。SiControl と siTIP60 の各 5 に 6 井戸をシードします。
- プレートに前後し、均一な配分を確保するため左右に軽く振る。円形の動きは避けてください。24 h のためのインキュベーターでプレートを残してください。
- TIP60 のノックダウン効率を確認する残りのセルを収穫します。5 分間 200 g で残りの細胞懸濁液を遠心分離し、上澄みを除去します。
- 次の製造元のプロトコル、市販試薬を用いた RNA を隔離し、ノックダウン効率を評価するリアルタイムの量的な PCR に進みます。
4. 傷を作成します。
- 細胞が完全に接続されていることを確認する位相差顕微鏡下で確認してください。顕微鏡下で細胞を観察 (4 X、10 X、および 20 倍) 細胞のコンフルエント単層を形成している細胞が完全に接続されていることを確認します。
注: siControl 細胞は通常添付 siTIP60 細胞より。TIP60 の枯渇、細胞が間葉系のような20になりますがされます。ここでは、通常の卓上型白色光の位相差顕微鏡が使用されます。 - 傷を生成するため軽く 200 μ L ピペット チップ; と井戸の中央を横切る直線をスクラッチします。生成された傷の長さは、井戸の直径と同じです。残りのすべての井戸のためには、この手順を繰り返します。各ウェルに新しいピペット チップを使用します。
- 水洗いしても各 5 回を用いた無血清培地戸建のセルを削除します。
- 各ウェルに無血清培地 1 mL を追加し、住セルイメージ投射に進みます。
5. 住セルイメージ投射のセットアップ
- 顕微鏡をオンにし、温度が住セルイメージ投射チャンバー内温度が 37 ° C に届くように設定する前に少なくとも 1 時間を制御
- 二酸化炭素 (CO2) ガス供給住セルイメージ投射を開始する前にオンにします。CO2濃度を 5% に設定します。
- 顕微鏡のステージ上 24 ウェル プレートを置き、イメージングのための 10 倍の倍率の対物レンズを選択します。カメラではなく接眼レンズに放射光を直接、傷とその周囲のセルにフォーカスを調整します。
注: この例では、位相コントラストと白い光が使用されました。 - 生細胞観察システムを使用して、各ウェルの傷の位置をマークします。
メモ: 生細胞イメージング システムの自動化された段階の複数の位置からの画像取り込みできます。画像、すべてのマークされた位置の間隔取られます。 - 時間条件を設定: 1 h 間隔と 72 時間の持続期間;この設定に従ってシステムは、1 時間ごと 72 h、適切な時間間隔を設定しモニタリング周期各マークの位置で写真を撮るでしょう。
注: ここでは、72 時間の期間ために勧めこれらの細胞は無血清培地で 72 時間後死ぬを開始します。
6. 単一細胞運動の追跡
- 72 h は、JPEG 形式で画像および AVI 形式の動画としてデータをエクスポートした後は、データをエクスポートします。
注: これは ImageJ ソフトウェアのみ AVI 形式で動画を認識できますので重要です。SiTIP60 と siControl のセルの異なるセル移行速度は、ビデオで明らかに観察できます。 - ImageJ ソフトウェアで AVI ビデオを開きます。
- MTrackJ プラグイン (プラグインをダウンロードし、は別にインストールする必要があります) を開く: プラグイン > MtrackJ。
- MtrackJ ツールバーで「追加」タブをクリックしてしてビデオから選択した単一セルためトラックを追加します。侵襲的なフロントの先端に、独自に移行することができますセルの選択 (単一セルの移行)。ビデオを選択したセルの動きに従うし、それらをトレース MtrackJ を使用しています。
- ツールバーの「測定」タブをクリックしての移動距離を測定します。
注: ここでは、単一セルの動きを測定することは困難になって siTIP60 細胞の多くが単一のセルとして移動に対し、単一のセルとして、siControl ほとんどない細胞移動。ただし、侵襲の前面にある細胞の運動することができますまだトレースして、siControl と siTIP60 の両方のセルで計算。 - AVI 形式でトラックとビデオを保存します。
7 セル移動能力の定量化
- 定量化, 0 h 画像と画像"n"h で、siTIP60 または siControl のいずれかのセルが完全に傷口を閉じ、"n"は、timepoint を参照する場所を選択します。
注: ここでは、48 h として選ばれた、siTIP60 細胞の傷はほぼ完全に閉鎖されました。 - ImageJ は、次の数式を使用してを使用してパーセント移行を定量化: (0 h -"n"h で傷の領域で傷の領域)/0 h × 100 で傷の領域。
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Representative Results
生細胞イメージングに基づく細胞移行試験の一般的なスキーマ
図 1 aは、このプロトコルのスキーマです。典型的な上皮形態を示した siControl MCF10A セルをトランスフェクトしました。TIP60 の枯渇後、MCF10A 細胞いたより間葉系細胞 (図 1 b) と比較しています。
TIP60 ノックダウン効率の検討
TIP60 ノックダウン効率を図 2に示します。TIP60 発現レベルは siTIP60 治療後大幅に減少しました。TIP60、ほかのいくつかの細胞の移行関連タンパク質の式でしたも検査された20。たとえば、上皮性マーカーである上皮接着分子 (EpCAM) の発現も低下フィブロネクチン (FN1) と SNAIL2 式 (SNAI2) に増加した両方の EMT のドライバーであります。TIP60 の枯渇。これらのデータは、住セルイメージ投射用 MCF10A 細胞における TIP60 レベルが十分に減少したをお勧めします。
TIP60 の枯渇が細胞遊走の動的に変更します。
図 3は、siControl と siTIP60 のセルの撮影したビデオを示しています。ビデオは、siTIP60 siControl と比較しての高速細胞遊走を明確に示します。これ以外、siControl と siTIP60 の細胞間の細胞移動の動的差も (すなわちより多くの単一セル動きが siTIP60 細胞で観察されたに対し、シートとして移動 siControl 細胞) が認められました。
TIP60 ノックダウンの後細胞遊走を増加します。
図 4は、siControl および siTIP60 細胞の細胞移動の定量化を示しています。TIP60 の枯渇後、移行した細胞の割合が大幅に増加。
TIP60 枯渇細胞遊走のパターンを変化します。
ビデオ追跡単一細胞運動を図 5に示します。ほとんどの siTIP60 細胞は単一細胞の移動を示したに対し、siControl 細胞のほとんどは総称して細胞シートと 2 つだけセルを示した単一セル移行の一環として移行されます。細胞移動のパターンの変化を示す細胞枯渇した TIP60 より葉の表現型があります。
図 1: 実験概要および代表的なイメージです。(A) プロトコルのスキーマです。SiControl または siTIP60 (B) MCF10A 細胞の代表的なイメージをトランスフェクトしました。MCF10A 細胞は TIP60 の枯渇後より葉の形態を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: TIP60 は効率的に siTIP60 トランスフェクション後枯渇します。リアルタイムの量的な PCR はTIP60、EpCAM、FN1、およびSNAI2の発現レベルをチェックしていました。総 RNA は Trizol 試薬製造の手順を以下を使用して分離されました。各サンプルの総 RNA の 2 μ g は、cDNA を作るに使用されました。結果は、フォールドの変更として表されます。アクチンは、内部統制として使用されました。誤差範囲は、少なくとも 3 の独立した実験から標準偏差を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: siControl および siTIP60 細胞の生細胞イメージング動画細胞運動のさまざまなパターンを表示します。時間間隔は 1 h に設定され、期間は 72 時間であった。ビデオは、ツァイスの生細胞観察を使用して撮影されました。これらのビデオをダウンロードするここをクリックしてください。
図 4: 細胞移行率の定量化します。生細胞イメージング動画から (A) 代表的な画像を得た。0 h と 48 時間で撮影された写真が使用されました。48 時間以内の細胞移動の割合 (B) 定量化が行われた ImageJ ソフトウェア次の数式を使用してを使用して: (0 h -"n"h で傷の領域で傷の領域)/0 h × 100 で傷の領域。誤差範囲は、少なくとも 3 つの独立した実験から標準偏差を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 生細胞イメージング動画表示単一細胞運動追跡します。色付きの線は、選択した各隔離された単一セルの渡り鳥のトラックを表示します。これらのビデオをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
細胞移動の過程で細胞は付着性シートの形でどちらかの移動ことができます知られています。ゆるい房;または、隔離された単一のセルです。モードと細胞浸潤の動的することができます 1 つの条件ごとに異なると表現型が時間内で変更できます。伝統的な創傷治癒のアッセイは、12 または 24 h など、長い時間間隔と顕微鏡から撮影したスナップショット画像に基づいています。傷の閉鎖のダイナミックと細胞運動のパターンをキャプチャするは困難します。
その一方で、生細胞イメージング システムは細胞遊走はるかに短い間隔 (30 分または 1 時間) と手動で撮影した画像の実現されていない、正確に同じ位置を監視します。システムは自動化されており、研究者が実験の終わりにデータをエクスポートするだけ必要があります。これは細胞運動のパターンとリアルタイムでの創傷閉鎖のプロセスを監視することが可能になります。本研究では定量的アッセイの創傷治癒の生細胞イメージング システムの組み込むことでコントロールまたは TIP60 枯渇細胞の創傷閉鎖のプロセスと同様に、動的な細胞運動のキャプチャで。生細胞イメージング システムを使用して撮影したビデオから siControl 細胞のほとんどは TIP60 枯渇セルを隔離された単一セル (図 3および図 5) として移動に対し付着性シートとして移転
細胞増殖と細胞死は、創傷治癒のアッセイでの細胞移動の研究を複雑にします。したがって、創傷治癒のアッセイは、細胞増殖の影響を最小限に抑えるための無血清培地で実行されます。また、TIP60 のノックダウンされた細胞の生存への影響を減らすために最適化されています。しかし、細胞の増殖、創傷治癒のアッセイにおける細胞死の影響を排除するために不可能です。スナップショットは、創傷閉鎖細胞の移動や細胞増殖のためだったかどうかを区別することは不可能、特定の時間ポイントでのみキャプチャ創傷閉鎖をすることができます。住セルイメージ投射細胞移動の原動力を監視し、細胞増殖および細胞死と細胞移動を区別する研究者も可能となって、個々 のセルの動きを追跡します。本研究では単一細胞追跡では、siControl 細胞のシート状でほとんど移動中において siTIP60 状態で隔離された単一セルの移動経路を明らかにしました。生細胞イメージング システムは siTIP60 細胞 siControl 細胞と比較しても集団細胞遊走 (すなわち、まとまりのあるグループとして移行細胞) の増加をキャプチャしました。ビデオから MCF10A siTIP60 は、単一セルの動きますます上皮細胞シート siControl (図 5) と比較しての高速移動を示した。
このプロトコルで使用されるさまざまなパラメーターは、実験の失敗を避けるために最適化する必要があります。まず、トランスフェクション後の細胞死の数は 10% 以上の細胞移動への影響を最小限に抑えることをする必要があります。この場合、TIP60 の枯渇も減少する細胞の生存;したがって、研究者と、細胞の移動を複雑にするかもしれないする必要がありますのこの潜在的な表現に注意してくださかった。この問題を避けるためには、研究者は細胞数と siRNA のターゲット遺伝子を破壊するために使用量を最適化する必要があります。MCF10A、20 nM siTIP60 と 1 x 10 の6セルは本研究では最適な条件です。第二に、MCF10A セル、クラスター化インデックスおよびカウントすることは困難です。細胞数のエラーが、異なる条件の間で初期細胞数の有意な差につながる可能性があり、創傷治癒の試金の交絡変数可能性があります。この問題を避けるためには、少なくとも 20 分、trypsinization を停止し、上下に 20 回塊を分散させるために数を数えやすいように、ピペッティングで混ぜる追加完全な成長媒体のための MCF10A 細胞を trypsinize します。第三に、細胞が通常で、井戸の中心 24 ウェル プレートにシードされている後です。再度均一な配分を確保するため, 播種後セルを中断します。インキュベーターに入れる前にプレートを前後と左右に振る。第四に、TIP60 の枯渇を行いセルより葉を付ける従って困難。このような場合、時間の長い期間のためのインキュベーター内プレートを残してください。24 h 後のセルは通常、アタッチします。セルがまだ正しく添付されている研究者は細胞の完全な成長媒体を使用でき、セルが完全に接続されているとき、無血清培地を交換します。これらの細胞は通常完全培地で 12 時間後、アタッチします。第五に、傷のエッジはスムーズではないかもしれません。滑らかなエッジを作成する傷の速度を上げます。第六に、傷は顕微鏡のカメラを通して視覚化するのには大きすぎる可能性があります。以下の強度で 200 μ L ピペット チップを使用して、傷を生成します。また、針は小さいギャップを生成する使用できます。第七に、スクラッチ中にデタッチは、いくつかの細胞が不十分な洗浄により、創部に接続し直します。少なくとも 5 回 PBS の代わりに無血清培地に井戸を洗ってください。8、セルがいくつか洗浄後にプレートからデタッチし始めます。ただし、洗浄の数は剥離細胞が傷口に再アタッチしません。 ことを確保するために危険にさらされることはできません。この場合、研究者は優しく 3 回セルを洗浄できセル洗浄の残りの部分に進む前に落ち着くように 1 時間の最大時間のインキュベーター内のプレートを残します。9、顕微鏡はフォーカスを失う可能性がありますおよびイメージは、実験を通して途中で不鮮明になります。顕微鏡周辺温度の変化は、温度調整の段階の距離に多少の影響があり、理由にあります。研究者が顕微鏡をし温度はインキュベーターはセルにフォーカスを調整する前にウォーム アップすることを確認するための実験を開始する前に少なくとも 1 時間を制御します。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
私たちは彼らの役に立つ議論とコメントの Jha 研究室のメンバーに感謝します。スバールバルヤンマイエン島がん科学研究所シンガポール (R-713-006-014-271)、国立医学国立研究財団にシンガポール、シンガポールの教育省卓越性イニシアチブの各研究センターの下からの補助金に支えられ研究協議会 (CBRG 遺伝研;BNIG11nov001 と CS-IRG;R-713-000-162-511)、文部省学術研究基金 (萌え AcRF 層 1 T1 2012 10 月 -04)。Y.Z.、G.S.C.、および C.Y.T. は、がん科学研究所のシンガポール、シンガポールの国立大学によって授与卒業後奨学金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
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