Summary
Vi præsenterer her, real-time overvågning af celle migration i en sårheling analyse ved hjælp af TIP60-forarmet MCF10A bryst epitelceller. Gennemførelsen af live-celle Billeddannende teknikker i vores protokollen tillader os at analysere og visualisere encellede bevægelse i realtid og på tværs af tid.
Abstract
Sårheling analysen er effektiv og en af de mest økonomiske måder at studere celle migration in vitro. Konventionelt, billeder er taget i begyndelsen og slutningen af et eksperiment ved hjælp af et fasekontrast mikroskop, og migration evner af celler er evalueret af lukningen af sår. Men celle bevægelse er en dynamisk fænomen, og en konventionel metode giver ikke mulighed for sporing én celle bevægelse. For at forbedre nuværende sårheling assays, bruger vi live-celle Billeddannende teknikker til at overvåge celle migration i realtid. Denne metode gør det muligt at bestemme den celle migration sats baseret på en celle, tracking system og giver en klarere sondring mellem celle migration og cell spredning. Her, demonstrere vi brugen af live-celle imaging i sårheling assays til at studere de forskellige migration evner af bryst epitelceller påvirket af tilstedeværelsen af TIP60. Som celle motilitet er meget dynamisk, giver vores metode mere indsigt i processer af sårheling end et øjebliksbillede af sår lukning taget med de traditionelle Billeddannende teknikker anvendes for sårheling assays.
Introduction
HIV-Tat-interaktiv protein 60 kDa (TIP60) er en lysin acetyltransferase, der kan acetylate både Histon og ikke-Histon proteiner1,2. Dens funktioner er fundet for at have konsekvenser i flere signaling veje, herunder transskription, DNA-skade reparation og apoptose1,3,4,5,6, 7 , 8. Derudover TIP60 er ofte downregulated i kræft, og dens downregulation er korreleret med kræft metastaser og dårlig overlevelse satser9,10,11,12, 13,14. Tumor metastaser er den største årsag til cancer-relaterede dødsfald. Det er en multi-trins proces, og det første trin af metastaser indebærer migration og invasion af tumorceller i tilstødende væv15,16. For at gøre det, tumorceller først skal løsne sig fra den primære tumor masse, enten i form af et kollektivt invaderende celle ark eller som løsrevet enkelt celler17. Under denne proces undergår tumorceller ofte epitelial mesenchymale overgangen (EMT), hvilket resulterer i ændringer i morfologi og celle vedhæftning kapacitet17,18.
Et par teknikker er blevet udviklet for at studere migrationen og invasion evne til tumor celler i vitro. Blandt dem er sårheling analysen den mest effektive og økonomisk19. Første, denne metode indebærer skabelse af en kunstig hul på en sammenflydende éncellelag af celler, således at celler til at migrere og lukke hullet. Andet, billeder af hullerne kan blive fanget i begyndelsen og slutningen af forsøget. Endelig, en sammenligning af kløften lukning bruges til at bestemme antallet af celle migration. Et fasekontrast mikroskop er normalt bruges til at fange billeder for konventionelle sårheling assays. En anden fordel for sårheling analysen er, at den dels ligner i vivo tumor celle migration. Ligeledes til i vivo tumor metastaser viser celle migration i sårheling assays både den kollektive migration af epitel ark og migration af fritliggende enkelt celler.
Dog celle migration er kendt for at være dynamisk, og der er behov for at dokumentere bevægelsen af celler i realtid. For eksempel, tillader en konventionel sårheling analysen ikke en forsker til at analysere encellede bevægelse. På den anden side er celler kulturperler for sårheling assays ofte serum-hungrende at hæmme celledelingen. Dette er gjort for at udelukke muligheden for gap lukning på grund af celledelingen. Ikke desto mindre, der vil stadig være nogle spredning og celledød og fase-kontrast billeder taget før og efter forsøget er ude af stand til at skelne mellem dem.
Live-celle imaging teknik løser denne begrænsning af konventionelle sårheling assays. Ved hjælp af en live-imaging mikroskop kombineret med en CO2 inkubator og passende temperaturkontrol, forskere kan måle hul størrelse og dens sats af lukning over tid mens sporing bevægelse af aktivt overfører celler beliggende på spidsen af den invasive front. Dermed gennemførelsen af live-celle imaging for at overvåge celle migration vil ikke kun give bedre visualisering af celle migration, men vil også give mulighed at differentiere mellem celle migration og cell spredning, hvilket giver en mere pålidelig analyse af celle migration.
I denne undersøgelse, blev MCF10A bryst epitelceller brugt til at påvise kombination af sårheling assay og live-celle imaging for at studere TIP60 rolle i celle migration. Nedbrydningen af TIP60 resulterer i øget migration evner i MCF10A celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse
- Forberede MCF10A næringssubstratet: Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) / F12 (1:1) med 5% horse serum, 20 ng/mL epitelial vækstfaktor, 0,5 mg/mL hydrocortison, 100 ng/mL kolera toksin og 10 µg/mL insulin.
- Forberede serumfrit medium: DMEM/F12 (1:1) med 20 ng/mL epitelial vækstfaktor, 0,5 mg/mL hydrocortison, 100 ng/mL kolera toksin og 10 µg/mL insulin.
- Brug følgende siRNA sekvens:
siControl:
Videresend: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
Omvendt: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
siTIP60:
Videresend: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
Omvendt: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3' - Brug 10 cm celle kultur retter og 24-godt plader.
2. forbigående udtømning af TIP60 ved hjælp af siRNA
- På dag 1, alikvot 15 µL Transfektion reagens (f.eks. Lipofectamine RNAiMAX) og 2 mL af nedsat serum medium (f.eks Opti-MEM) og bland dem med 10 µL af hver siRNA (10 µM lager), henholdsvis.
- Inkuber blanding ved stuetemperatur i 20 min.
- Frø 1 x 106 MCF10A celler sammen med 3 mL af næringssubstratet i en 10 cm parabol. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer.
- Tilføje siRNA blanding dråbevis til 10 cm parabol.
- Ryst fadet for at sikre at cellerne er jævnt fordelt før ibrugtagning 37 ° C inkubator.
- Efter 6 h inkubation, erstatte den siRNA-holdige medium med 8 mL frisk næringssubstratet.
- På dag 2, forberede et andet parti af siRNA blandinger og inkuberes dem ved stuetemperatur i 20 min.
- Opsug ud 8 mL af næringssubstratet tilføjet på dag 1 og erstatte det med 3 mL frisk næringssubstratet.
- Tilføje den anden batch af siRNA blanding til retter dråbevis. Ryst retter for at sikre, at reagenserne fuldt blandet før du sætter dem i rugemaskinen.
- Efter 6 h, erstatte den siRNA-holdige medium med 8 mL frisk næringssubstratet.
3. frø celler for sårheling analysen
- På dag 3, kassere medium og vaske cellerne en gang med 2 mL af phosphat bufferet saltvand (PBS) buffer. Kassér PBS buffer.
- Trypsinize siControl og siTIP60-behandlede celler ved tilsætning af 1 mL af 1 x trypsin-EDTA buffer til pladen. Lægge den tilbage i inkubatoren i 20 min.
- Tilsættes 4 mL komplet næringssubstrat til hver plade, resuspend cellerne af pipettering og overføre dem til en 15 mL tube.
- Der centrifugeres ved 200 g i 5 min og Fjern supernatanten.
- Genopslæmmes celler med 5 mL af serumfrit medium og tælle de celler ved hjælp af en hemocytometer.
- Forberede en cellesuspension af 6 x 105 celler/mL for både siControl og siTIP60; sikre, at cellerne er godt blandet. Tilsæt 500 µL af cellesuspension til én brønd af en 24-godt plade til at sikre 100% confluency. Seed 5 til 6 wells hver for siControl og siTIP60.
- Ryst forsigtigt plade frem og tilbage og derefter side til side for at sikre ligelig fordeling. Undgå en cirkulær bevægelse. Forlade pladen i inkubator i 24 timer.
- Høste de resterende celler for at kontrollere knockdown effektiviteten af TIP60. At gøre det, centrifugeres den resterende cellesuspension ved 200 g i 5 min og Fjern supernatanten.
- Isolere RNA ved hjælp af en kommerciel reagens, efter producentens protokol, og Fortsæt til real-time kvantitativ PCR til at evaluere den knockdown effektivitet.
4. Opret såret
- Check under en fase kontrast mikroskop til at sikre, at cellerne er helt knyttet. Se celler under mikroskop (4 X, 10 X og 20 X forstørrelse) for at sikre at cellerne fuldt er knyttet, en sammenflydende éncellelag af celler er dannet.
Bemærk: siControl celler normalt vedhæfte bedre end siTIP60 celler. Dette er forventet, fordi nedbrydningen af TIP60 gør cellerne mere mesenchymale-lignende20. Her, bruges en normal benchtop hvid-lys fase kontrast mikroskop. - For at generere såret, forsigtigt skrabe en lige linje tværs over midten af godt med en 200 µL pipette spids; længden af såret genereret er den samme som diameteren af brønden. Gentag dette trin for alle resterende brønde. Bruge en ny pipette tip til hver brønd.
- Forsigtigt vaske hver godt 5 gange ved hjælp af serumfrit medium til at fjerne de fritliggende celler.
- Tilsæt 1 mL i serumfrit medium til hver brønd og gå videre til live-celle billeddannelse.
5. opsætning af Live-celle Imaging
- Tænde mikroskopet og temperatur kontrol mindst 1 time før opsætning af live-celle imaging for at sikre, at temperaturen i salen når 37 ° C.
- Drej på kuldioxid (CO2) gas levering inden start live-celle billeddannelse. Indstil CO2 koncentration til 5%.
- 24-godt pladen anbringes på scenen i mikroskop og vælg mål linse med 10 X forstørrelse til billedbehandling. Direkte udsendes lyset til okularerne i stedet for kameraet og justere fokus for at finde såret og celler omkring den.
Bemærk: I dette tilfælde, hvidt lys med fasekontrast blev brugt. - Bruge en live-celle observatør system til at markere placeringen af såret i hver brønd.
Bemærk: Den automatiserede fase af live-celle imaging system giver mulighed for image erhvervelse på flere positioner. Billeder er taget på hver markant position en gang hvert interval. - Konfigurer den tid: 1 time interval og 72 h varighed; Ifølge denne indstilling, vil systemet tage billeder på hver markant position hver time for 72 h. sæt op nogen ønskede tidsinterval og perioden for overvågning.
Bemærk: Her, en varighed af 72 h er bedst fordi disse celler begynder at dø efter 72 h i serumfrit medium.
6. sporing én celle bevægelse
- Eksportere data efter 72 h. eksportere data både som billeder i JPEG-format og videoer i AVI-format.
Bemærk: Dette er vigtigt fordi ImageJ software kan kun genkende videoer i AVI-format. Den anden celle migration hastigheder mellem siTIP60 og siControl celler kan ses tydeligt i videoen. - Åbn AVI videoen i ImageJ software.
- Åbne MTrackJ plugin (plugin skal være downloadet og installeret separat): Plugins > MtrackJ.
- Tilføje et spor for enkelte celler valgt fra videoen ved at klikke på 'Tilføj' fanen i værktøjslinjen MtrackJ. Vælg en celle på spidsen af den invasive front og en celle, der kan overføre på egen hånd (enkelt celle migration). Følg flytning af de valgte celler på video og spore dem ved hjælp af MtrackJ.
- Måle afstanden bevægelighed ved at klikke på fanen "foranstaltning" på værktøjslinjen.
Bemærk: Her, næsten ingen af cellerne i siControl flyttede som enkelt celler, hvilket gør det vanskeligt at måle én celle bevægelse, der henviser til, at mange af siTIP60 cellerne flyttede som enkelt celler. Men bevægelsen af celler beliggende på invasive forsiden kan stadig spores og beregnet i både siControl og siTIP60 celler. - Gemme video med spor i AVI-format.
7. kvantificering af celle Migration evne
- For kvantificeringen, skal du vælge billeder på 0 h og billeder på "n" h, hvor "n" henviser til tidspunkt når enten siTIP60 eller siControl celler har helt lukket såret.
Bemærk: Her, 48 h var valgt, da sår i siTIP60 celler var næsten helt lukket. - Kvantificere den procent migration ved hjælp af ImageJ ved hjælp af følgende formel: (område af sår på 0 h - området af sår på "n" h) / område af sår på 0 h x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
General skema af Live-celle Imaging-baserede celle Migration Assay
Figur 1A er en skema i denne protokol. MCF10A celler transfekteret med siControl viste typisk epitelial morfologi. Efter udtømningen af TIP60 var MCF10A celler mere mesenchymale sammenlignet med kontrol celler (figur 1B).
Undersøgelse af TIP60 Knockdown effektivitet
Figur 2 viser TIP60 knockdown effektivitet. TIP60 udtryk niveau faldt betydeligt efter siTIP60 behandling. Ud over TIP60 var udtryk for flere celle migration-relaterede proteiner også undersøgt20. For eksempel udtryk for epitelial vedhæftning molekyle (EpCAM), som er en epitelial markør, faldt, mens udtryk af fibronektin (FN1) og SNAIL2 (SNAI2), som er både EMT chauffører, blev forhøjet ved udtynding af TIP60. Disse data tyder på at TIP60 niveauer i de MCF10A celler til live-celle imaging tilstrækkeligt blev reduceret.
Udtømning af TIP60 ændrer dynamikken i celle Migration
Figur 3 viser de videoer taget til siControl og siTIP60 celler. Videoerne viser klart en hurtigere celle migration af siTIP60 i forhold til siControl. Andet end dette, blev en forskel i dynamikken i celle migration mellem siControl og siTIP60 celler også observeret (dvs. siControl celler flyttede som et ark, der henviser til, at flere enkelt-celle bevægelse blev observeret i siTIP60 celler).
Stigning i celle Migration efter TIP60 Knockdown
Figur 4 viser kvantificering af celle migration for siControl og siTIP60 celler. Procentdelen af overflyttede celler steg betydeligt efter nedbrydningen af TIP60.
TIP60 Udtynding ændrer mønster af celle Migration
Figur 5 viser videoer tracking encellede bevægelse. De fleste af siControl cellerne migrerede kollektivt som en del af celle ark, og kun to celler viste enkelt celle migration, mens de fleste siTIP60 celler viste enkelt celle migration. Ændringer i mønstret i celle migration indikerer, at celler med forarmet TIP60 har en mere mesenchymale fænotype.
Figur 1: eksperimenterende overblik og repræsentative billeder. (A) skema i protokollen. (B) repræsentative billeder af MCF10A celler transfekteret med siControl eller siTIP60. MCF10A celler viser en mere mesenchymale morfologi efter nedbrydningen af TIP60. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: TIP60 var effektivt forarmet efter siTIP60 Transfektion. Real-time kvantitativ PCR blev brugt til at kontrollere udtrykket niveauet af TIP60, EpCAM, FN1og SNAI2. Den samlede RNA blev isoleret ved hjælp af Trizol reagens efter producentens protokol. 2 µg af den samlede RNA af hver prøve blev brugt til at gøre cDNA. Resultaterne er repræsenteret som fold-ændringen. Aktin blev brugt som en intern kontrol. Fejllinje angiver standardafvigelsen fra mindst 3 uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Live-celle imaging videoer af siControl og siTIP60 celler viser forskellige bevægelsesmønstre celle. Tidsintervallet blev sat til 1 h og varighed var til 72 h. Videoen blev taget ved hjælp af en Zeiss live-celle observatør. Venligst klik her for at hente disse videoer.
Figur 4: kvantificering af procentdelen af celle migration. (A) repræsentative billeder stammer fra live-celle imaging videoer. Billeder taget på 0 h og 48 h blev brugt. (B) kvantificering af procentdelen af celle migration inden for 48 h blev gjort ved hjælp af ImageJ software ved hjælp af følgende formel: (område af sår på 0 h - området af sår på "n" h) / område af sår på 0 h x 100. Fejllinje angiver standardafvigelsen fra mindst tre uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Live-celle imaging videoer Vis sporing af encellede bevægelse. De farvede linjer viser den vandrende spor af hver valgte isolerede enkelt celle. Venligst klik her for at hente disse videoer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er kendt, at celler i celle migration, kan enten flytte i formen vedhængende arkgruppe; løs klynger; eller single, isolerede celler. Mode og dynamikken i celle invasion kan variere fra én tilstand til en anden, og fænotype kan ændre inden for timer. Traditionelle sårheling analysen er baseret på snapshot billeder taget fra et mikroskop med en lang tidsinterval, 12 eller 24 timer. Dette gør det vanskeligt at fange dynamikken i såret lukning og mønster af celle bevægelser.
På den anden side overvåge live-celle imaging systems celle migration over en meget kortere interval (30 min eller 1 time) og på nøjagtig samme position, som ikke er muligt for billeder taget manuelt. Systemet er automatiseret, og forskere skal kun eksportere data i slutningen af forsøgene. Dette gør det muligt at overvåge mønster af celle bevægelse og processen med sår lukning i realtid. I denne undersøgelse, inkorporering af en kvantitativ live-celle billedbehandlingssystem i sårheling assays giver mulighed for opsamling af dynamiske celle bevægelse, samt processen med sår lukning i kontrol eller TIP60-forarmet celler. Fra video taget ved hjælp af en live-celle billedbehandlingssystem, flyttede de fleste af siControl cellerne som en klæbende ark, der henviser til, at TIP60-forarmet celler flyttede som isolerede enkelte celler (figur 3 og figur 5).
Celleproliferation og celledød kan komplicere studiet af celle migration i en sårheling assay. Derfor, sårheling analysen er udført i serumfrit medium at minimere effekten af celledelingen. Også, knockdown af TIP60 var optimeret til at reducere dens indvirkning på celle overlevelse. Det er imidlertid umuligt at eliminere påvirkningerne af celleproliferation og celledød i sårheling assays. Snapshots kan kun fange sår lukning på et bestemt tidspunkt, gør det umuligt at skelne mellem hvorvidt såret lukning skyldtes celle migration eller celledelingen. Live-celle imaging overvåger dynamikken i celle migration og spor enkelt celle bevægelse, gør det muligt for forskere at skelne celle migration fra celleproliferation og celledød. I denne undersøgelse afsløret encellede tracking overflytningssti isolerede enkelt celler i siTIP60 tilstand, mens siControl celler flyttede det meste i form af plader. Live-celle billedbehandlingssystem fangede også en stigning i kollektive celle migration (dvs. cellerne migrerede som en sammenhængende gruppe) i siTIP60 celler i forhold til siControl celler. Fra videoerne, MCF10A siTIP60 viste mere enkelt celle bevægelser og hurtigere migration epitelcelle ark i forhold til siControl (figur 5).
Forskellige parametre, der anvendes i denne protokol skal optimeres for at undgå eksperimentelle fiasko. Først, antallet af celle dødsfald efter forbigående Transfektion bør være mindre end 10% for at minimere virkningen på celle migration. I dette tilfælde kan nedbrydningen af TIP60 reducere celle overlevelse; Derfor, forskere bør være klar over denne potentielle fænotype, som det kan komplicere celle migration. For at undgå dette problem, skal forskerne optimere celle antallet og størrelsen af siRNA bruges til nedbryder deres mål gen. For MCF10A, 1 x 106 celler med 20 nM siTIP60 var den optimerede betingelse i denne undersøgelse. Andet, MCF10A celler er ofte grupperet og vanskeligt at regne. Fejl i celle tæller kan føre til en betydelig forskel i oprindelige celle numre på tværs af forskellige betingelser, og dette kunne være en forstyrrende variabel i sårheling assays. For at undgå dette problem skal trypsinize MCF10A celler i mindst 20 min. Tilføj komplet vækstmedium til at stoppe trypsinization og mix af pipettering op og ned ad 20 gange til at sprede klumper og at gøre det lettere at tælle. For det tredje er celler normalt i midten af brønden efter at blive seedet til 24-godt pladen. Cellerne genopslæmmes efter såning for at sikre en jævn fordeling. Ryste pladen frem og tilbage og side til side før du sætter det i rugemaskinen. Fjerde gør nedbrydelsen af TIP60 cellen mere mesenchymale og dermed sværere at vedhæfte. Hvis dette sker, forlade pladen i rugemaskinen i en længere periode. Efter 24 h, er cellerne normalt knyttet. Hvis celler er stadig ikke ordentligt fastgjort, kunne forskere bruger komplet vækstmedium for celle såning og erstatte det med serumfrit medium, når cellerne er fuldt monteret. Disse celler er normalt knyttet efter 12 h i komplet medium. Femte, kanten af såret kan ikke være jævn. Øge hastigheden af skrabe for at oprette glatte kanter. For det sjette kan såret være for stor til at visualisere gennem kameraet i mikroskopet. Bruge 200 µL pipette tips med mindre styrke til at generere såret. Alternativt kan en nål bruges til at generere et mindre hul. Syvende, nogle celler, der er frakoblet under skrabe kan re-vedhæfte på såret på grund af utilstrækkelig vasker. Brøndene vaskes med serumfrit medium i stedet for PBS mindst 5 gange. Ottende begynder celler at løsne sig fra pladen efter et par vasker. Men antallet af vasker kan ikke bringes i fare for at sikre, at fritliggende celler ikke må igen sættes på såret. I dette tilfælde kan forskere cellerne vaskes forsigtigt 3 gange og forlade plade inde i rugemaskinen for en maksimal tid på 1 timer at lade cellerne bundfælde sig før man går videre til resten af vasker. Niende, mikroskopet kan miste fokus, og billederne kan blive sløret halvvejs gennem forsøget. En ændring i temperatur omkring mikroskopet kan være årsagen, da temperaturen har en mindre effekt på den justerede fase afstand. Forskere skal tænde mikroskopet og temperatur kontrol mindst 1 time før start eksperiment for at sikre, at rugemaskine er varmet op før justere fokus på celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takke medlemmerne af RIA laboratorium for deres nyttige diskussioner og kommentarer. S.J. blev støttet af tilskud fra National Research Foundation Singapore og Singapore Undervisningsministeriet under sin forskning Centers of Excellence initiativ til den kræft Science Institute of Singapore (R-713-006-014-271), den nationale medicinske Research Council (CBRG-NIG; BNIG11nov001 og CS-IRG; R-713-000-162-511), Undervisningsministeriet akademiske forskningsfond (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 OLT -04). Y.Z., G.S.C. og C.Y.T. blev støttet af en ph.d. stipendium uddelt af kræft Science Institute of Singapore, National University of Singapore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53. J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).
- Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).
- Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N.
- Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT. Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).
- Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity. Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).
- Sykes, S. M., et al. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction. Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).
- Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis. Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).
- Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival. J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).
- Gorrini, C., et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response. Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).
- Jha, S., et al. Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway. Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).
- Kim, J. H., et al. Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes. Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).
- Sakuraba, K., et al. Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer. Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).
- Subbaiah, V. K., et al. E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60. Oncogene. , (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R.
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Zhang, Y., et al. TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program. J Mol Cell Biol. , (2016).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
