Summary
Hier präsentieren wir Ihnen die Echtzeit-Überwachung der Zellwanderung in einem Wundheilung Assay mit TIP60-abgereicherte MCF10A Brust Epithelzellen. Die Umsetzung des live-Zelle bildgebender Verfahren in unserem Protokoll erlaubt uns, Analyse und Visualisierung von einzelligen Bewegung in Echtzeit und über die Zeit.
Abstract
Die Wundheilung Assay ist effizient und eine der günstigsten Möglichkeiten, um Zelle Migration in-vitro-Studie. Konventionell, Bilder sind am Anfang und Ende eines Experiments mit dem Phasenkontrast-Mikroskop genommen, und die Migration-Fähigkeiten der Zellen werden durch die Schließung der Wunden ausgewertet. Jedoch Zellbewegung ist ein dynamisches Phänomen und eine konventionelle Methode lässt sich nicht für die Verfolgung von einzelligen Bewegung. Um aktuelle Wundheilung Assays zu verbessern, verwenden wir Leben-Zelle bildgebende Verfahren Zellwanderung in Echtzeit zu überwachen. Diese Methode ermöglicht es uns, festzustellen, die Zelle Migrationsrate basierend auf eine Zelle, die tracking-System und bietet eine klarere Unterscheidung zwischen Zellwanderung und Zellproliferation. Hier zeigen wir den Einsatz von live Cell Imaging Wundheilung Assays, die unterschiedliche Migration Fähigkeiten der Brust Epithelzellen beeinflusst durch das Vorhandensein von TIP60 zu studieren. Wie Zelle Motilität sehr dynamisch ist, bietet unsere Methode weitere Einblicke in die Prozesse der Wundheilung als eine Momentaufnahme der Wundverschluss mit den traditionellen bildgebenden Verfahren zur Wundheilung Assays aufgenommen.
Introduction
HIV-Tat-interaktive Protein 60 kDa (TIP60) ist eine Lysin-Acetyltransferase, die Histone und nicht-Histonproteine1,2acetylate kann. Seine Funktionen befinden sich in mehrere Signalwege, einschließlich Transkription, DNA-Schäden reparieren und Apoptose1,3,4,5,6, Auswirkungen haben 7 , 8. Darüber hinaus TIP60 ist oft herunterreguliert bei Krebsarten, und die Herunterregulierung ist korreliert mit Krebsmetastasen und schlechten Überlebensraten9,10,11,12, 13,14. Tumor Metastasen ist die Hauptursache von Krebs-Todesfälle. Es ist ein mehrstufiger Prozess, und der erste Schritt der Metastasierung beinhaltet die Migration und Invasion von Tumorzellen in benachbarte Gewebe15,16. Um dies zu tun, Tumorzellen zuerst müssen aus der Masse der Primärtumor, entweder in Form von einem Kollektiv eindringenden Zelle Blatt lösen oder losgelöst als Einzelzellen17. Während dieses Prozesses werden Tumorzellen oft epithelialen, mesenchymale Transition (EMT), was zu Veränderungen in der Morphologie und Zelle Adhäsion Fähigkeit17,18unterzogen.
Ein paar Techniken wurden entwickelt, um die Migration zu studieren und Invasion Fähigkeit von Tumor-Zellen in Vitro. Unter ihnen ist die Wundheilung Assay die effiziente und kostengünstige19. Zunächst beinhaltet diese Methode die Schaffung einer künstlichen Lücke auf eine konfluierende Monolage von Zellen, wodurch die Zellen zu migrieren und die Lücke zu schließen. Zweitens können Bilder der Lücken am Anfang und Ende des Experiments erfasst werden. Schließlich wird ein Vergleich der Lückenschluss zur Bestimmung des Zellmigration. Phasenkontrast-Mikroskop wird in der Regel verwendet, um Bilder für konventionelle Wundheilung Assays zu erfassen. Ein weiterer Vorteil der Wundheilung Test ist, dass es teilweise in Vivo Tumor Zellwanderung ähnelt. Ebenso zeigt Zellwanderung in Wundheilung Assays zur in-Vivo Tumor Metastasen der kollektiven Migration der epithelialen Blätter und die Migration von freistehenden Einzelzellen.
Allerdings Zellwanderung ist bekannt, dass dynamische, und gibt es eine Notwendigkeit, die Bewegung der Zellen in Echtzeit zu dokumentieren. Zum Beispiel erlaubt ein konventionelle Wundheilung Assay kein Forscher, einzelne Zelle Bewegung zu analysieren. Auf der anderen Seite sind Zellen kultiviert für Wundheilung Assays oft Serum-verhungert, Zellproliferation hemmen. Dies soll der Lückenschluss durch Zellproliferation nicht ausschließen. Dennoch, es werden einige Proliferation und Zelltod und Phasenkontrast-Aufnahmen vor und nach das Experiment sind nicht in der Lage zu unterscheiden.
Das Leben-Zelle bildgebende Verfahren befasst sich mit dieser Einschränkung von konventionellen Wundheilung Assays. Mit einem live-Imaging Mikroskop kombiniert mit einer CO2 Inkubator und entsprechende Temperierung, können Forscher messen die Lückengröße und Steuersatzes Schließung im Laufe der Zeit während der Verfolgung der Bewegung aktiv Migration Zellen befindet sich an den Spitzen der invasive vorne. Daher die Umsetzung von live-Cell imaging zur Überwachung der Zellwanderung bieten nicht nur bessere Visualisierung der Zellwanderung, sondern ermöglicht es auch die Möglichkeit zur Unterscheidung Zellwanderung und Zellproliferation, wodurch eine mehr zuverlässige Analyse der Zellmigration.
In dieser Studie wurden MCF10A Brust Epithelzellen zur Kombination der Wundheilung Assay und live-Cell imaging zur Untersuchung der Rolle von TIP60 in Zelle Migration zu demonstrieren. Die Erschöpfung der TIP60 führt zu zunehmenden Migration Fähigkeiten in den MCF10A Zellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vorbereitung
- MCF10A Kulturmedium vorbereiten: Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) / F12 (1:1) mit 5 % Pferd Serum, 20 ng/mL epithelialen Wachstumsfaktor, 0,5 mg/mL Hydrocortison, 100 ng/mL Cholera Toxin und 10 µg/mL Insulin.
- Bereiten Sie serumfreien Medium: DMEM/F12 (1:1) mit 20 ng/mL epithelialen Wachstumsfaktor, 0,5 mg/mL Hydrocortison 100 ng/mL Cholera Toxin und 10 µg/mL Insulin.
- Verwenden Sie die folgende SiRNA-Sequenz:
SiControl:
Vorwärts: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3 "
Revers: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3 "
siTIP60:
Vorwärts: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3 "
Revers: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3 " - Verwenden Sie 10 cm Zelle Kultur Gerichte und 24-Well Platten.
(2) vorübergehende Erschöpfung der TIP60 mittels siRNA
- Am 1. Tag aliquoten 15 µL Transfection Reagens (z. B. Lipofectamine RNAiMAX) und 2 mL Serum Medium (z. B. Opti-MEM) reduziert und mischen sie mit 10 µL jeder SiRNA (10 µM bestand), beziehungsweise.
- Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 20 min.
- Samen Sie 1 x 106 MCF10A Zellen zusammen mit 3 mL Kulturmedium in einer 10 cm Petrischale. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
- Die 10 cm Teller die SiRNA Mischung tropfenweise hinzufügen.
- Schütteln Sie das Gericht um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind, bevor man sie in den Inkubator 37 ° C.
- Ersetzen Sie nach 6 h Inkubation die SiRNA-haltigen Medium mit 8 mL frisches Kulturmedium.
- Am 2. Tag bereiten Sie eine weitere Gruppe von SiRNA-Mischungen und inkubieren sie bei Raumtemperatur für 20 min.
- Aspirieren Sie, 8 mL Kulturmedium hinzugefügt am Tag 1 und ersetzen Sie es mit 3 mL frisches Nährmedium.
- Die zweite Gruppe von SiRNA-Mischung zu den Speisen tropfenweise hinzufügen. Schütteln Sie die Gerichte um sicherzustellen, dass die Reagenzien vollständig gemischt werden, bevor man sie in den Brutkasten.
- Ersetzen Sie nach 6 h die SiRNA-haltigen Medium mit 8 mL frisches Kulturmedium.
(3) Samenzellen für die Wundheilung Assay
- Am 3. Tag entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit 2 mL des Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Puffer zu. Entsorgen Sie die PBS-Puffer.
- Trypsinize SiControl und siTIP60-behandelten Zellen durch Zugabe von 1 mL 1 x Trypsin-EDTA Puffer auf den Teller. Steckte es wieder in den Inkubator für 20 Minuten.
- Jede Platte 4 mL komplette Kulturmedium hinzu, Aufschwemmen der Zellen durch pipettieren, und übertragen Sie sie auf eine 15-mL-Tube.
- 200 g für 5 min Zentrifugieren und den Überstand zu entfernen.
- Wieder auszusetzen Sie, die Zellen mit 5 mL serumfreien Medium und zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
- Bereiten Sie eine Zellsuspension von 6 x 105 Zellen/mL für die SiControl und siTIP60; Stellen Sie sicher, dass die Zellen gut gemischt sind. Geben Sie 500 µL Zellsuspension in einer 24-Well-Platte zu 100 % Konfluenz zu gewährleisten. Samen Sie 5 bis 6 Brunnen für SiControl und siTIP60.
- Schütteln Sie die Platte hin und her und dann nebeneinander auf gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Vermeiden Sie eine Kreisbewegung. Lassen Sie die Platte in den Inkubator für 24 h.
- Ernten Sie die verbleibenden Zellen um die Knockdown Effizienz der TIP60 überprüfen. Dies zu tun, die restlichen Zellsuspension bei 200 g für 5 min Zentrifugieren den Überstand zu entfernen.
- Isolieren Sie RNA mit einer kommerziellen Reagenz nach Protokoll des Herstellers, zu und fahren Sie mit Real-time quantitative PCR, Knockdown Effizienz zu bewerten.
4. Legen Sie die Wunde
- Überprüfen Sie unter dem Phase-Kontrast-Mikroskop um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig befestigt sind. Die Zellen unter dem Mikroskop zu beobachten (4 X, 10 X und 20 X Vergrößerung), um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig befestigt sind, dass eine konfluierende Monolage von Zellen gebildet hat.
Hinweis: SiControl Zellen legen in der Regel besser als siTIP60 Zellen. Dies wird erwartet, da die Erschöpfung der TIP60 den Zellen mehr mesenchymalen-wie20macht. Hier wird eine normale Benchtop Weißlicht-Phase Kontrast Mikroskop verwendet. - Um die Wunde zu generieren, sanft Kratzen einer geraden Linie quer durch die Mitte des Brunnens mit einer Pipettenspitze 200 µL; die Länge der Wunde erzeugt ist identisch mit dem Durchmesser des Brunnens. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle übrigen Brunnen. Verwenden Sie eine neue Pipettenspitze für jedes gut.
- Vorsichtig waschen, jeweils gut 5 Mal mit serumfreien Medium um freistehenden Zellen zu entfernen.
- Fügen Sie 1 mL serumfreien Medium in jede Vertiefung und fahren Sie mit live Cell Imaging.
5. Setup Live Cell Imaging
- Schalten Sie das Mikroskop und die Kontrolle der Temperatur mindestens 1 h vor dem Einrichten von live Cell imaging um sicherzustellen, dass die Temperatur in der Kammer 37 ° c erreicht
- Schalten Sie die Gaszufuhr Kohlendioxid (CO2) vor Beginn der live-Cell-Imaging. Einstellen der CO2 -Konzentration auf 5 %.
- Platzieren Sie die 24-Well-Platte auf der Bühne des Mikroskops und wählen Sie das Objektiv mit 10 X Vergrößerung für die Bildgebung. Direkt das emittierte Licht auf die Okulare anstelle der Kamera und stellen Sie den Fokus auf die Wunde und die umgebenden Zellen zu finden.
Hinweis: In diesem Fall wurde weißes Licht mit Phasenkontrast verwendet. - Verwenden Sie ein live-Cell Observer System, markieren Sie die Position der Wunde in jede Vertiefung.
Hinweis: Der automatisierte Teil der live-Cell-imaging-System ermöglicht für die Bildaufnahme an mehreren Positionen. Bilder werden auf jeder markierten Position einmal jedes Intervall aufgenommen. - Richten Sie den Zustand der Zeit: 1 h-Intervall und 72 h Dauer; gemäß dieser Einstellung wird das System an jede markierte Position jede Stunde für 72 h richten Sie jede gewünschte Zeitintervall und Zeitraum für die Überwachung fotografieren.
Hinweis: Hier ist eine Dauer von 72 h am besten weil diese Zellen sterben nach 72 h in serumfreien Medium zu starten.
6. Verfolgung einzellige Bewegung
- Exportieren Sie die Daten nach 72 h. exportieren Sie die Daten als Bilder im JPEG-Format sowie Videos im AVI-Format.
Hinweis: Dies ist wichtig, weil ImageJ Software nur Videos im AVI-Format erkennen kann. Die andere Zelle Migration Geschwindigkeiten zwischen siTIP60 und SiControl Zellen können deutlich im Video zu sehen. - Öffnen Sie die AVI-Video in der ImageJ-Software.
- Öffnen Sie das MTrackJ-Plugin (das Plugin heruntergeladen und installiert werden muss separat): Plugins > MtrackJ.
- Fügen Sie eine Spur für einzelne Zellen ausgewählt aus dem Video durch Klicken auf die Registerkarte "Hinzufügen" in der MtrackJ-Symbolleiste hinzu. Wählen Sie eine Zelle an der Spitze der invasiven Front und eine Zelle, die auf eigene migriert werden kann (einzellige Migration). Folgen der Bewegung der ausgewählten Zellen auf das Video und sie verfolgen mit MtrackJ.
- Messen Sie den Abstand der Bewegung, indem Sie auf die Registerkarte "Maßnahme" auf der Symbolleiste.
Hinweis: Hier zog fast keine Zellen in der SiControl als Einzelzellen, macht es schwierig, einzellige Bewegung zu messen, während viele der siTIP60 Zellen als Einzelzellen verschoben. Jedoch kann die Bewegung der Zellen invasive vorne noch verfolgt und in SiControl und siTIP60 Zellen berechnet werden. - Speichern Sie das Video mit den Tracks im AVI-Format.
(7) Quantifizierung der Zelle Migration Fähigkeit
- Wählen Sie für die Quantifizierung um 0 Uhr und Bilder mit "n" h, wo "n" die Timepoint bezieht, wenn entweder die siTIP60 oder SiControl Zellen die Wunde vollständig geschlossen haben.
Hinweis: Hier wurde 48 h gewählt, da die Wunden in siTIP60 Zellen fast vollständig geschlossen waren. - Quantifizieren die prozentuale Migration mit ImageJ mithilfe der folgenden Formel: (Bereich der Wunde um 0 Uhr - Wunde "n" h) / Wunde bei 0 h x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Allgemeines Schema Live Cell Imaging-basierte Cell Migration Assay
Abbildung 1A ist ein Schema dieses Protokolls. MCF10A Zellen transfiziert mit SiControl zeigte typische epithelialen Morphologie. Nach der Erschöpfung der TIP60 waren MCF10A Zellen mehr mesenchymalen im Vergleich zu Kontrollzellen (Abbildung 1 b).
Prüfung der TIP60 Knockdown Effizienz
Abbildung 2 zeigt die TIP60 Knockdown Effizienz. Die Expression des TIP60 verringerte sich deutlich nach der siTIP60 Behandlung. Neben TIP60 waren die Ausdrücke von mehreren Zellproteinen migrationsbezogene auch untersuchten20. Z. B. der Ausdruck von epithelialen Adhäsionsmolekül (EpCAM), die eine epitheliale Marker ist, wurde verringert, während die Ausdrücke der Fibronektin (FN1) und SNAIL2 (SNAI2), welche beide EMT-Fahrer sind bei stiegen Erschöpfung der TIP60. Diese Daten deuten darauf hin, dass die TIP60 in den MCF10A Zellen verwendet für das live Cell Imaging ausreichend gesenkt wurden.
Erschöpfung der TIP60 ändert sich die Dynamik der Zellmigration
Abbildung 3 zeigt die Videos für SiControl und siTIP60 Zellen genommen. Die Videos zeigen deutlich eine schnellere Zellwanderung des siTIP60 im Vergleich zu SiControl. Darüber hinaus wurde ein Unterschied in der Dynamik der Zellwanderung zwischen SiControl und siTIP60 Zellen auch beobachtet (d.h., SiControl Zellen als ein Blatt verschoben, während mehr einzellige Bewegung in siTIP60 Zellen beobachtet wurde).
Zunahme der Zellwanderung nach TIP60 Zuschlag
Abbildung 4 zeigt die Quantifizierung der Zellwanderung für SiControl und siTIP60 Zellen. Der Anteil der migrierten Zellen deutlich erhöht, nach der Erschöpfung der TIP60.
TIP60 Erschöpfung ändert sich das Muster der Zellmigration
Abbildung 5 zeigt Videos Tracking einzellige Bewegung. Die meisten SiControl Zellen migriert gemeinsam als Teil der Zelle Blätter und nur zwei Zellen zeigten einzelne Zelle Migration, während die meisten siTIP60 Zellen einzellige Migration zeigte. Die Veränderungen im Muster der Zellwanderung zeigen, dass Zellen mit abgereichertem TIP60 mehr mesenchymalen Phänotyp.
Abbildung 1: experimentelle Übersicht und repräsentative Bilder. (A) Schema des Protokolls. (B) repräsentative Bilder von MCF10A Zellen transfiziert mit SiControl oder siTIP60. MCF10A Zellen zeigen eine mehr mesenchymale Morphologie nach Erschöpfung der TIP60. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: TIP60 wurde nach siTIP60 Transfektion effizient erschöpft. Real-time quantitative PCR wurde verwendet, um die Expression von TIP60, EpCAM, FN1und SNAI2zu überprüfen. Die gesamte-RNS war mit Trizol Reagenz nach der Herstellung Protokoll isoliert. 2 µg Gesamt-RNS jeder Probe wurde zur cDNA zu machen. Die Ergebnisse werden als die Falte-Änderung dargestellt. Aktin diente als interne Kontrolle. Fehlerbalken zeigt die Standardabweichung von mindestens 3 unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Live Cell imaging Videos von SiControl und siTIP60 Zellen zeigen unterschiedliche Muster der Zellbewegung. Der zeitliche Abstand wurde bis 1 Uhr und dauerte bis 72 h. Das Video wurde mit ein Zeiss Leben-Zelle Beobachter entnommen. Bitte klicken Sie hier, um diese Videos herunterladen.
Abbildung 4: Quantifizierung des Prozentsatzes der Zellwanderung. (A) repräsentative Bilder wurden live Cell imaging Videos entnommen. Bilder von 0 h und 48 h dienten. (B) Quantifizierung des Prozentsatzes der Zellwanderung innerhalb von 48 h erfolgte mit ImageJ-Software mithilfe der folgenden Formel: (Bereich der Wunde um 0 Uhr - Wunde "n" h) / Wunde bei 0 h x 100. Der Fehlerbalken zeigt die Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Live Cell imaging Videos zeigen die Verfolgung von einzelligen Bewegung. Die farbigen Linien zeigen die wandernden Spur des jeweils ausgewählten isolierten Einzelzelle. Bitte klicken Sie hier, um diese Videos herunterladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Es ist bekannt, dass in den Prozess der Zellwanderung, Zellen entweder Bewegung in Form von anhaftenden Blättern können; losen Cluster; oder einzelnen, isolierten Zellen. Den Modus und die Dynamik der Zellinvasion variieren von einem Zustand zum anderen, und der Phänotyp kann innerhalb von Stunden ändern. Die traditionelle Wundheilung Assay basiert auf Snapshot Bilder aus dem Mikroskop mit einer lange Zeit-Intervall, z. B. 12 oder 24 Stunden. Dies erschwert es, die Dynamik der Wundverschluss und das Muster der Zelle Bewegungen zu erfassen.
Auf der anderen Seite überwachen Leben-Zelle bildgebende Systeme Zellwanderung über einen viel kürzeren Zeitraum (30 min oder 1 h) und an der exakt gleichen Position, die nicht für Aufnahmen manuell machbar ist. Das System ist automatisiert und Forscher müssen nur die Daten am Ende der Experimente zu exportieren. Dies macht es möglich, das Muster der Zellbewegung und den Prozess der Wundverschluss in Echtzeit zu überwachen. In dieser Studie ermöglicht der Einbau eines quantitative live Cell imaging Systems in Wundheilung Assays für die Erfassung von dynamischen Zellbewegung sowie den Prozess der Wundverschluss in Kontrolle oder TIP60 erschöpft Zellen. Aus dem Video mit einem live-Cell-imaging-System aufgenommen zogen die meisten SiControl Zellen als ein Anhänger Blatt während TIP60 erschöpft Zellen als isolierte Einzelzellen (Abbildung 3 und Abbildung 5) verschoben.
Zellproliferation und Zelltod könnte das Studium der Zellwanderung in einem Wundheilung Assay erschweren. Daher erfolgt die Wundheilung Assay in serumfreien Medium zur Minimierung der Auswirkungen der Zellproliferation. Außerdem war der Knockdown von TIP60 optimiert, Reduzierung ihrer Auswirkungen auf das Überleben der Zelle. Jedoch ist es unmöglich, die Einflüsse der Zellproliferation und Zelltod in der Wundheilung Assays zu eliminieren. Die Snapshots können nur Capture Wunde Schließung zu einem bestimmten Zeitpunkt, macht es unmöglich zu unterscheiden, ob der Wundverschluss durch Zellwanderung oder Zellproliferation wurde. Live Cell Imaging die Dynamik der Zellwanderung überwacht und verfolgt individuelle Zelle Bewegung, macht es möglich, dass Forscher Zellproliferation und Zelltod Zellwanderung unterscheiden. In dieser Studie offenbart einzellige Tracking der Migrationspfad der isolierte Einzelzellen in siTIP60 Zustand, während SiControl Zellen meist in Form von Blättern verschoben. Die live-Cell-imaging-System erfasst auch eine Zunahme der kollektive Zellmigration (d. h. die Zellen als eine zusammenhängende Gruppe migriert) in siTIP60 Zellen im Vergleich zu SiControl Zellen. Aus den Videos zeigte MCF10A siTIP60 mehr einzellige Bewegungen und schneller Migration der Epithelzelle Blätter im Vergleich zu SiControl (Abbildung 5).
Verschiedene Parameter, die in diesem Protokoll verwendeten müssen optimiert werden, um experimentelle Fehler zu vermeiden. Erstens sollte die Zahl der Zelle Todesfälle nach transiente Transfektion weniger als 10 %, die Auswirkungen auf die Zellwanderung zu minimieren. In diesem Fall kann die Erschöpfung der TIP60 Zelle überleben reduzieren; Daher sollten Forscher diesen potenziellen Phänotyp bewusst sein, wie es Zellwanderung erschweren kann. Um dieses Problem zu vermeiden, sollten Forscher die Zellzahl und die Höhe der SiRNA verwendet, um ihre jeweilige Zielgen zum Abbau optimieren. Für MCF10A 1 x 106 Zellen mit 20 nM siTIP60 war der optimierten Zustand in dieser Studie. Zweitens sind MCF10A Zellen oft geclustert und schwierig zu zählen. Fehler in Zellzahlen können führen zu ein signifikanter Unterschied im ersten Zellzahlen in ganz unterschiedlichen Bedingungen könnte, und dies eine verwirrende Variable in Wundheilung Assays. Um dieses Problem zu vermeiden, trypsinize MCF10A Zellen für mindestens 20 min. Add komplette Wachstumsmedium zu stoppen die Trypsinization und mischen, indem Sie nach oben und unten 20 Mal die Klumpen zu zerstreuen und zu vereinfachen, zählen pipettieren. Drittens sind Zellen in der Regel in der Mitte des Brunnens nach ausgesät, die 24-Well-Platte. Wieder aussetzen Sie, die Zellen nach der Aussaat um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Schütteln Sie die Platte hin und her und hin und her bevor man sie in den Brutkasten. Viertens: die Erschöpfung der TIP60 macht die Zelle mehr mesenchymale und damit schwerer zu befestigen. In diesem Fall lassen Sie die Platte im Inkubator für einen längeren Zeitraum hinweg. Nach 24 Stunden sind die Zellen in der Regel angebracht. Wenn die Zellen immer noch nicht richtig befestigt sind, konnten Forscher komplette Wachstumsmedium für Zelle Aussaat verwenden und mit serumfreien Medium zu ersetzen, wenn die Zellen vollständig angeschlossen sind. Diese Zellen sind in der Regel nach 12 h im kompletten Medium angebracht. Fünftens kann der Rand der Wunde nicht glatt sein. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit von Kratzern um glatte Kanten zu erstellen. Sechstens: möglicherweise die Wunde zu groß, um durch die Kamera des Mikroskops zu visualisieren. Verwenden Sie 200 µL Pipettenspitzen mit weniger Kraft, um die Wunde zu generieren. Alternativ kann eine Nadel verwendet werden, um eine kleinere Lücke zu generieren. Siebtens: einige Zellen, die beim Kratzen getrennt sind können die Wunde aufgrund unzureichender Waschungen neu beifügen. Waschen Sie die Brunnen mit serumfreien Medium anstelle von PBS mindestens 5 Mal. Achter, können Zellen beginnen, von der Platte zu lösen, nachdem ein paar wäscht. Jedoch nicht die Anzahl der Wäschen kompromittierbar, um sicherzustellen, dass freistehende Zellen nicht an der Wunde wieder befestigen. In diesem Fall können Forscher die Zellen sanft 3 Mal waschen und lassen Sie die Platte in die Brutmaschine für eine maximale Zeit von 1 h, die Zellen, bevor Sie fortfahren mit dem Rest der Waschungen beruhigen zu lassen. Neunte, das Mikroskop kann Fokus verlieren, und die Bilder werden unscharf auf halbem Wege durch das Experiment. Eine Änderung der Temperatur um das Mikroskop kann der Grund sein, da Temperatur geringe Auswirkungen auf die eingestellte Stufe Entfernung hat. Forscher sollten das Mikroskop einschalten und Temperatur steuern mindestens 1 h vor Beginn des Experiments um sicherzustellen, dass der Inkubator aufgewärmt ist, vor der Einstellung des Fokus auf Zellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken die Mitgliedern des Ji-Labors für ihre hilfreiche Diskussion und Kommentare. S.J wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Research Foundation Singapur und das Singapur Bildungsministerium unter seine Forschungszentren der Exzellenzinitiative zu dem Krebs Science Institute of Singapore (R-713-006-014-271), der nationalen medizinischen Forschungsrat (CBRG-NIG; BNIG11nov001 und CS-IRG; R-713-000-162-511), akademische Forschungsfonds Bildungsministerium (MOE AcRF Stufe 1 T1-2012 Okt-04). Y.Z, G.S.C. und C.Y.T. wurden durch ein Post-graduate Fellowship von Krebs Science Institute of Singapore, National University of Singapore ausgezeichnet unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53. J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).
- Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).
- Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. Cellular functions of TIP60. Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).
- Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT. Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).
- Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity. Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).
- Sykes, S. M., et al. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction. Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).
- Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis. Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).
- Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival. J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).
- Gorrini, C., et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response. Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).
- Jha, S., et al. Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway. Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).
- Kim, J. H., et al. Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes. Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).
- Sakuraba, K., et al. Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer. Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).
- Subbaiah, V. K., et al. E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60. Oncogene. , (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Zhang, Y., et al. TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program. J Mol Cell Biol. , (2016).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
