Burada, hücre göç TIP60 tükenmiş MCF10A meme epitel hücreleri kullanarak bir yara iyileşmesi tahlil gerçek zamanlı izleme mevcut. Canlı hücre görüntüleme teknikleri bizim protokolündeki uygulanması bize analiz ve tek hücreli hareket içinde gerçek zaman ve zaman içinde görmenize olanak sağlar.
Yara iyileşmesi tahlil etkilidir ve bir hücre göç içinde vitroçalışma için en ekonomik yolu. Geleneksel, görüntüleri başlangıç ve faz kontrast mikroskop kullanarak bir deney sonunda alınır ve hücreleri geçiş yeteneklerini yaraların kapatılması tarafından değerlendirilir. Ancak, hücre hareketi dinamik bir olgudur ve geleneksel bir yöntem tek hücreli hareketi izlemek için izin vermez. Geçerli yara iyileşmesi deneyleri artırmak için biz canlı hücre görüntüleme teknikleri hücre göç gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanın. Bu yöntem takip sistemi bir hücreyi temel alarak hücre geçiş hızını belirlemek için bize izin verir ve hücre göç ve Hücre proliferasyonu arasında net bir ayrım sağlar. Burada, yara iyileşmesi deneyleri meme epitel hücreleri TIP60 varlığı ile etkiledi farklı geçiş yeteneklerini çalışmaya görüntülemede canlı hücre kullanımını göstermektedir. Hücre hareketliliği son derece dinamik olduğu için bizim yöntem yara yara kapatma yara iyileşmesi deneyleri için kullanılan geleneksel görüntüleme teknikleri ile çekilen fotoğrafını daha iyileşme süreçleri daha fazla ilgili bilgiler sağlar.
Histon ve sigara Histon proteinleri1,2acetylate bir lisin asetiltransferaz HIV Tat etkileşimli protein 60 kDa (TIP60) olduğunu. Fonksiyonları transkripsiyon, DNA-hasar onarım ve Apoptozis1,3,4,5,6, de dahil olmak üzere birden çok sinyal yollar, uygulamaları bulunmaktadır bulundu 7 , 8. Ayrıca, TIP60 kez downregulated kanserleri ve onun downregülasyon kanser metastaz ile ilişkilidir ve zavallı hayatta kalma oranları9,10,11,12, 13,14. Tümör metastazı kanserle ilgili ölüm başlıca nedenidir. Çok adımlı bir işlemdir ve geçiş ve tümör hücreleri işgali bitişik dokularda15,16içine metastaz ilk adım içerir. Bunu yapmak için tümör hücreleri ilk birincil tümör kitle, ya topluca işgal bir hücre levha şeklinde gelen ayırmanız gerekir veya müstakil olarak tek hücreleri17. Bu işlem sırasında tümör hücreleri kez Mezenkimal geçiş (EMT), morfoloji ve hücre yapışma yeteneği17,18değişimler sonuçta epitel tabi.
Birkaç teknik geçiş eğitim için geliştirilmiştir ve vitroişgali yetenek tümör hücreleri. Bunlar arasında en verimli ve ekonomik19yara iyileşmesi tahlil olduğunu. İlk olarak, bu yöntem Konfluent monolayer hücre, böylece hücrelerin göç ve boşluğu kapatmak izin üzerinde yapay bir boşluğu oluşturulmasını içerir. İkinci olarak, görüntüleri eksikliklerin başlangıç ve deneme sonunda yakalanabilir. Son olarak, bir karşılaştırma boşluğu kapatma hücre geçiş hızını belirlemek için kullanılır. Faz kontrast mikroskop genellikle geleneksel yara iyileşmesi deneyleri için görüntüleri yakalamak için kullanılır. Başka bir yara iyileşmesi tahlil vivo içinde tümör hücre göç kısmen benzer avantajdır. Benzer şekilde vivo içinde tümör metastazı için yara iyileşmesi deneyleri hücre göç epitel sayfaları toplu göç ve müstakil tek hücre geçiş gösterir.
Ancak, hücre göç dinamik olarak bilinir ve hücre gerçek zamanlı olarak hareket belgelemek için bir ihtiyaç vardır. Örneğin, geleneksel bir yara iyileşmesi tahlil tek hücreli hareket analiz etmek bir araştırmacı izin vermez. Öte yandan, yara iyileşmesi deneyleri için kültürlü hücreleri çoğu kez hücre çoğalması etkisizleştirmek için serum aç. Bu boşluğu kapatma nedeniyle hücre çoğalması olasılığını ekarte için yapılır. Yine de, hala olacak bazı yayılması ve hücre ölümü ve faz kontrast görüntüler önce ve deneme sonra ikisi arasında ayrım yapamaz.
Canlı hücre görüntüleme tekniği konvansiyonel yara iyileşmesi deneyleri bu sınırlama giderir. Canlı görüntüleme mikroskop kullanarak bir CO2 kuluçka ve uygun sıcaklık kontrolü ile birlikte, araştırmacılar boşluk boyutu ölçebilirsiniz ve aktif olarak göç hareketi izleme hücreleri iken zamanla kapatılması hızını kendi bulunan uçları invaziv açık. Bu nedenle, canlı hücre hücre geçiş izlemek için Imaging uygulanması yalnızca hücre göç daha iyi görselleştirme vermez ama aynı zamanda hücre göç ve Hücre proliferasyonu, böylece bir daha sağlayan ayırt imkanı sağlayacak hücre göç güvenilir analizi.
Bu çalışmada, MCF10A meme epitel hücreleri yara iyileşmesi tahlil ve canlı hücre hücre göç TIP60 rolü eğitim için Imaging göstermek için kullanılmıştır. MCF10A hücreleri artan göç yeteneklerine TIP60 tükenmesi sonuçlanır.
Bu hücre geçiş sürecinde, her iki hareket yapisan yaprak şeklinde hücreler olabilir bilinmektedir; gevşek kümeleri; ya da tek, izole hücreler. Modu ve hücre işgalinin dinamik bir şartla diğerine değişebilir ve fenotip saat içinde değiştirebilirsiniz. Geleneksel yara iyileşmesi tahlil anlık görüntü resimleri 12 veya 24 s gibi bir uzun zaman aralığı mikroskopla alınan temel alır. Bu yara kapatma dinamik ve hücre hareketlerin desen yakalamak zorlaştırır.
Öte yanda…
The authors have nothing to disclose.
Jha laboratuvar onların yararlı tartışma ve Yorumlar için üyeleri teşekkür ediyoruz. S.J. kanser Bilim Enstitüsü of Singapore (R-713-006-014-271), Ulusal Sağlık Ulusal Araştırma Vakfı Singapur ve Singapur Milli Eğitim Bakanlığı, araştırma merkezleri mükemmellik girişimi’nin altında hibe tarafından desteklenmiştir Araştırma Konseyi (CBRG-Zen; BNIG11nov001 ve CS-IRG; R-713-000-162-511), Milli Eğitim Bakanlığı akademik Araştırma Fonu (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 Ekim -04). Y.Z., G.S.C. ve C.Y.T. kanser Bilim Enstitüsü Singapur tarafından Singapur Ulusal Üniversitesi layık bir yüksek lisans bursu tarafından desteklendi.
MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |