Summary
Qui, presentiamo il monitoraggio in tempo reale della migrazione cellulare in un'analisi di guarigione usando cellule epiteliali MCF10A TIP60-vuotati del seno. L'implementazione di tecniche di imaging di cellule vive nel nostro protocollo permette di analizzare e visualizzare la cella singola movimento in tempo reale e attraverso il tempo.
Abstract
Il dosaggio di cicatrizzazione è efficiente e uno dei modi più economici per lo studio di migrazione delle cellule in vitro. Convenzionalmente, immagini sono prese all'inizio e alla fine di un esperimento usando un microscopio a contrasto di fase, e le capacità di migrazione delle cellule vengono valutate tramite la chiusura delle ferite. Tuttavia, il movimento cellulare è un fenomeno dinamico, e un metodo convenzionale non consente per il tracciamento del movimento di cella singola. Per migliorare l'attuale saggi di guarigione delle ferite, utilizziamo tecniche di imaging di cellule vive per monitorare la migrazione cellulare in tempo reale. Questo metodo permette di determinare il tasso di migrazione delle cellule basato su una sistema di tracciamento di cella e fornisce una più chiara distinzione tra migrazione cellulare e la proliferazione delle cellule. Qui, noi dimostrare l'uso di formazione immagine di cellule vive in saggi di guarigione per studiare le abilità differenti migrazione delle cellule epiteliali della mammella, influenzate dalla presenza di TIP60. Motilità cellulare è altamente dinamica, il nostro metodo fornisce ulteriori approfondimenti i processi di guarigione rispetto ad un'istantanea della chiusura della ferita scattata con le tecniche di imaging tradizionale utilizzate per le analisi di cicatrizzazione della ferita.
Introduction
Proteina HIV-Tat-interattiva 60 kDa (TIP60) è un acetiltransferasi di lisina che possono acetilano sia degli istoni e proteine non istoniche1,2. Le sue funzioni si trovano ad per avere implicazioni in molteplici vie di segnalazione, compreso trascrizione, riparazione di danni al DNA e apoptosi1,3,4,5,6, 7 , 8. Inoltre, TIP60 è spesso downregulated nei cancri e suo downregulation è correlata con la metastasi del cancro e scarsa sopravvivenza prezzo9,10,11,12, 13,14. Metastasi del tumore è la causa principale della morte cancro-relativa. È un processo multi-step, e il passo iniziale della metastasi coinvolge la migrazione e l'invasione delle cellule del tumore nei tessuti adiacenti15,16. Al fine di farlo, le cellule del tumore in primo luogo necessario disconnettere dalla massa del tumore primario, sia nella forma di un foglio di cella collettivamente invasori o come staccato celluli17. Durante questo processo, le cellule tumorali subiscono spesso epiteliale di transizione mesenchimale (EMT), con conseguente cambiamenti nella morfologia e cellula adesione capacità17,18.
Alcune tecniche sono state sviluppate per studiare la migrazione e la capacità di invasione del tumore le cellule in vitro. Tra di loro, il dosaggio di cicatrizzazione è più efficiente ed economico19. In primo luogo, questo metodo prevede la creazione di uno spazio artificiale su un monostrato confluente di cellule, così permettendo che le cellule di migrare e colmare il divario. In secondo luogo, le immagini delle lacune possono essere catturati all'inizio e alla fine dell'esperimento. Infine, un confronto di chiusura gap viene utilizzato per determinare il tasso di migrazione cellulare. Un microscopio a contrasto di fase è solitamente usato per catturare immagini per saggi convenzionali di cicatrizzazione. Un altro vantaggio del dosaggio cicatrizzazione è che assomiglia in parte in vivo migrazione delle cellule tumorali. Allo stesso modo in vivo metastasi tumorali, migrazione cellulare in saggi di guarigione viene illustrato sia la migrazione collettiva di fogli epiteliale e la migrazione di singole cellule indipendente.
Tuttavia, migrazione delle cellule è conosciuta per essere dinamico e c'è un bisogno di documentare il movimento delle cellule in tempo reale. Per esempio, un test convenzionali di guarigione non consente un ricercatore analizzare il movimento di cella singola. D'altra parte, cellule coltivate per i test di guarigione sono spesso siero-affamate di inibire la proliferazione delle cellule. Questo viene fatto per escludere la possibilità di chiusura gap a causa di proliferazione delle cellule. Comunque, ci sarà ancora qualche proliferazione e morte cellulare e contrasto di fase immagini scattate prima e dopo l'esperimento sono in grado di distinguere tra di loro.
La tecnica di imaging di vivere-cella risolve questa limitazione di saggi convenzionali di guarigione. Utilizzando un microscopio di vivere-imaging combinato con un incubatore a CO2 e controllo di temperatura adeguata, i ricercatori possono misurare le dimensioni di gap e il tasso di chiusura nel tempo mentre traccia il movimento di migrazione attivamente cellule situato alle punte della invasivo anteriore. Quindi, l'implementazione di imaging per monitorare la migrazione delle cellule cellule vive non solo fornirà la migliore visualizzazione della migrazione cellulare, ma permetterà anche la possibilità di distinguere tra migrazione cellulare e la proliferazione delle cellule, fornendo così una più analisi affidabile della migrazione cellulare.
In questo studio, le cellule epiteliali del seno di MCF10A sono state utilizzate per dimostrare la combinazione del dosaggio di guarigione e di imaging per studiare il ruolo di TIP60 nella migrazione cellulare cellule vive. Lo svuotamento di TIP60 si traduce in capacità di aumento della migrazione in cellule di MCF10A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparazione
- Preparare il terreno di coltura di MCF10A: per volta Eagle Medium (DMEM di Dulbecco) / F12 (1:1) con 5% cavallo del siero, 20 ng/mL di fattore di crescita epiteliale, idrocortisone 0,5 mg/mL, tossina del colera 100 ng/mL e di 10 µ g/mL insulina.
- Preparare il medium senza siero: DMEM/F12 (1:1) con 20 ng/mL di fattore di crescita epiteliale, idrocortisone 0,5 mg/mL, la tossina del colera 100 ng/mL e di 10 µ g/mL insulina.
- Utilizzare la seguente sequenza di siRNA:
siControl:
Avanti: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
Rovescio: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
siTIP60:
Avanti: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
Rovescio: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3' - Utilizzare piastre di coltura delle cellule di 10 cm e piastre da 24 pozzetti.
2. temporaneo esaurimento delle TIP60 utilizzando siRNA
- Il giorno 1, aliquota 15 µ l di reagente di transfezione (ad es., Lipofectamine RNAiMAX) e 2 mL di ridotto medio del siero (ad es., Opti-MEM) e mescolarle con 10 µ l di ogni siRNA (10 stock µM), rispettivamente.
- Incubare la miscela a temperatura ambiente per 20 min.
- Semi di 1 x 106 MCF10A cellule insieme con 3 mL di terreno di coltura in un piatto di 10 cm. Contare le celle utilizzando un emocitometro.
- Aggiungere la miscela di siRNA goccia a goccia per il piatto di 10 cm.
- Agitare il piatto per garantire che le cellule sono equamente distribuite prima di mettere in incubatore 37 ° C.
- Dopo 6 h di incubazione, è necessario sostituire il mezzo di siRNA-contenenti con 8 mL di terreno di coltura fresco.
- Il giorno 2, preparare un altro lotto di miscele di siRNA e li Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
- Aspirare fuori 8 mL di terreno di coltura aggiunto il giorno 1 e sostituirlo con 3 mL di terreno di coltura fresco.
- Aggiungere il secondo lotto di siRNA miscela ai piatti goccia a goccia. Agitare i piatti per assicurarsi che i reagenti siano completamente mescolati prima di metterle in incubatrice.
- Dopo 6 h, sostituire il mezzo di siRNA-contenenti con 8 mL di terreno di coltura fresco.
3. le sementi celle per il dosaggio di guarigione
- Il giorno 3, eliminare il terreno e lavare le cellule una volta con 2 mL di tampone fosfato salino (PBS) tampone. Gettare il tampone PBS.
- Tripsinizzano la siControl e le cellule trattate con siTIP60 aggiungendo 1 mL di tampone di tripsina EDTA 1x alla piastra. Rimetterlo in incubatrice per 20 min.
- Aggiungere 4 mL di terreno di coltura completa per ogni piatto, risospendere le cellule pipettando e trasferirli in una provetta da 15 mL.
- Centrifugare a 200 g per 5 min e rimuovere il surnatante.
- Risospendere le cellule con 5 mL di medium senza siero e contare le celle utilizzando un emocitometro.
- Preparare una sospensione di cellule di 6 x 105 cellule/mL per il siControl e il siTIP60; Assicurarsi che le celle siano ben miscelate. Aggiungere 500 µ l di sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti per garantire confluency di 100%. 5 a 6 pozzetti ciascuna per siControl e siTIP60 del seme.
- Agitare delicatamente la piastra avanti e indietro e poi lato a lato per garantire la distribuzione uniforme. Evitare un movimento circolare. Lasciare la piastra nell'incubatore per 24 h.
- Raccogliere le cellule rimanenti per verificare l'efficienza atterramento di TIP60. A tale scopo, centrifugare la sospensione delle cellule rimanenti a 200 g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
- Isolare il RNA usando un reagente commerciale, seguendo il protocollo del produttore e procedere alla PCR quantitativa in tempo reale per valutare l'efficienza di atterramento.
4. creare la ferita
- Controllare sotto un microscopio di contrasto di fase per garantire che le celle sono completamente collegate. Osservare le cellule sotto il microscopio (4x, 10x e 20 ingrandimenti) per garantire che le celle sono completamente collegate che ha formato un monostrato confluente di cellule.
Nota: siControl cellule solitamente allegare meglio di cellule siTIP60. Questo è previsto perché lo svuotamento di TIP60 rende le cellule più mesenchymal-come20. Qui, viene utilizzato un microscopio di contrasto di fase luce bianca normale benchtop. - Per generare la ferita, graffiare delicatamente una linea retta attraverso il centro del pozzo con una punta di pipetta 200 µ l; la lunghezza della ferita generata è lo stessa come il diametro del pozzo. Ripetere questo passaggio per tutti i restanti pozzetti. Usare un nuovo puntale per ciascun pozzetto.
- Lavare delicatamente ciascun pozzetto 5 volte utilizzando privo di siero medio per rimuovere le cellule indipendente.
- Aggiungere 1 mL di medium senza siero in ciascun pozzetto e procedere all'imaging di cellule vive.
5. installazione di Live cell Imaging
- Accendere il microscopio e la temperatura di controllo almeno 1 h prima dell'impostazione live cell imaging per assicurare che la temperatura nella camera di raggiunge i 37 ° C.
- Accendere l'alimentazione del gas di anidride carbonica (CO2) prima di iniziare l'imaging di cellule vive. Impostare la CO2 concentrazione al 5%.
- Posizionare la piastra a 24 pozzetti sul palco del microscopio e selezionare la lente dell'obiettivo con ingrandimento 10x per l'imaging. Dirigere la luce emessa per gli oculari invece la fotocamera e regolare la messa a fuoco per individuare la ferita e le cellule intorno ad esso.
Nota: In questo caso, è stata utilizzata luce bianca con contrasto di fase. - Utilizzare un sistema di cellule vive osservatore per segnare la posizione della ferita in ciascun pozzetto.
Nota: La fase automatizzata del sistema di imaging cellule vive consente per l'acquisizione immagini a più posizioni. Immagini sono prese su ogni posizione segnata una volta ogni intervallo. - Impostare la condizione di tempo: 1 h intervallo e la durata di 72 ore; secondo questa impostazione, il sistema avrà immagini ogni posizione contrassegnata ogni ora per 72 h. impostare qualsiasi intervallo di tempo desiderato e il periodo per il monitoraggio.
Nota: Qui, una durata di 72 ore è migliore perché queste cellule cominciano a morire dopo 72 h in medium senza siero.
6. monitoraggio dei movimenti cella singola
- Esportare i dati dopo 72 h. esportare i dati come immagini in formato JPEG e come video in formato AVI.
Nota: Questo è importante perché software ImageJ può riconoscere solo video in formato AVI. La velocità di migrazione differenti delle cellule fra le cellule di siTIP60 e siControl può essere osservato chiaramente nel video. - Aprire il video AVI nel software ImageJ.
- Aprire il plugin MTrackJ (il plugin deve essere scaricato ed installato separatamente): Plugins > MtrackJ.
- Aggiungere una traccia per singole celle scelte dal video cliccando sulla scheda "Aggiungi" nella barra degli strumenti MtrackJ. Scegliere una cella all'estremità della parte anteriore dilagante e una cella che possa migrare in proprio (cella singola migrazione). Seguire il movimento delle cellule selezionate sul video e li traccia utilizzando MtrackJ.
- Misurare la distanza del movimento facendo clic sulla scheda "misura" della barra degli strumenti.
Nota: Qui, quasi nessuna cellula nella siControl spostato come celluli, rendendo difficile misurare il movimento di singole cellule, considerando che molte delle cellule siTIP60 spostato come singole cellule. Tuttavia, il movimento delle cellule situate nella parte anteriore invasiva ancora possibile rintracciato e calcolato in cellule sia siControl e siTIP60. - Salvare il video con le tracce in formato AVI.
7. quantificazione della capacità di migrazione delle cellule
- Per la quantificazione, selezionare immagini a 0 h e immagini a h "n", dove "n" si riferisce al timepoint cellule siTIP60 o siControl sono completamente chiuso la ferita.
Nota: Qui, 48 h è stato scelto, come le ferite in siTIP60 cellule erano quasi completamente chiuso. - Quantificare la percentuale migrazione usando ImageJ utilizzando la seguente formula: (area della ferita a 0 h - zona di ferita a "n" h) / area della ferita a 0 h x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schema generale del saggio di migrazione di cellule vive basati su Imaging cellulare
Figura 1A è uno schema di questo protocollo. Cellule di MCF10A transfected con siControl ha mostrato la morfologia tipica epiteliale. Dopo l'esaurimento delle TIP60, cellule di MCF10A erano più mesenchymal rispetto alle cellule di controllo (Figura 1B).
Esame dell'efficienza atterramento TIP60
La figura 2 Mostra l'efficienza di atterramento TIP60. Il livello di espressione di TIP60 è diminuito significativamente dopo il trattamento siTIP60. Oltre a TIP60, le espressioni di diverse proteine di relativi alla migrazione delle cellule sono stati anche esaminati20. Ad esempio, l'espressione della molecola di adesione epiteliali (EpCAM), che è un indicatore epiteliale, è stata diminuita, mentre le espressioni di fibronectina (FN1) e SNAIL2 (SNAI2), che sono entrambi i piloti EMT, sono stati aumentati al momento svuotamento di TIP60. Questi dati suggeriscono che i livelli di TIP60 nelle cellule MCF10A utilizzate per l'imaging di cellule vive sono stati sufficientemente ridotti.
Lo svuotamento di TIP60 cambia la dinamica della migrazione cellulare
La figura 3 Mostra il video presi per le cellule siControl e siTIP60. I video mostrano chiaramente una più veloce migrazione delle cellule di siTIP60 rispetto a siControl. Oltre a questo, una differenza nella dinamica della migrazione cellulare fra le cellule di siControl e siTIP60 inoltre è stata osservata (cioè, cellule di siControl spostate come un foglio, mentre più movimento di cella singola è stato osservato in cellule di siTIP60).
Aumento della migrazione cellulare dopo TIP60 Knockdown
La figura 4 Mostra la quantificazione della migrazione cellulare per le cellule siControl e siTIP60. La percentuale di cellule migrate è aumentato significativamente dopo l'esaurimento delle TIP60.
Tip60 Svuotamento cambia il modello di migrazione cellulare
La figura 5 Mostra video rilevamento movimento di cella singola. La maggior parte delle cellule siControl collettivamente migrata come parte di strati delle cellule e solo due cellule hanno mostrato unicellulare migrazione, mentre la maggior parte delle cellule di siTIP60 ha mostrato migrazione di singole cellule. I cambiamenti nel modello di migrazione cellulare indicano che le cellule con TIP60 impoverito hanno un fenotipo più mesenchymal.
Figura 1: Panoramica sperimentale e immagini rappresentative. (A) Schema del protocollo. (B) immagini rappresentative delle cellule di MCF10A transfected con siControl o siTIP60. Cellule di MCF10A mostrano una morfologia più mesenchymal dopo l'esaurimento delle TIP60. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: TIP60 è stato vuotato in modo efficiente dopo trasfezione siTIP60. PCR quantitativa in tempo reale è stato utilizzato per controllare il livello di espressione di TIP60, EpCAM, FN1e SNAI2. il RNA totale è stato isolato utilizzando il reagente Trizol seguendo il protocollo della manifattura. 2 µ g di RNA totale di ogni campione è stato usato per fare del cDNA. I risultati vengono rappresentati come la piega-modifica. L'actina è stato utilizzato come controllo interno. Barra di errore indica la deviazione standard da almeno 3 esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: cellule vive video imaging delle cellule siControl e siTIP60 mostrano diversi modelli di movimento cellulare. L'intervallo di tempo è stato impostato a 1 h e la durata era di 72 h. Il video è stato eseguito utilizzando un osservatore di cellule vive di Zeiss. Per favore clicca qui per scaricare questi video.
Figura 4: quantificazione della percentuale di migrazione cellulare. Immagini rappresentative (A) sono stati ottenuti da cellule vive imaging video. Foto scattate a 0 h e 48 ore sono state utilizzate. (B) quantificazione della percentuale di migrazione delle cellule all'interno di 48 h è stato fatto utilizzando il software ImageJ utilizzando la seguente formula: (area della ferita a 0 h - zona di ferita a "n" h) / area della ferita a 0 h x 100. La barra di errore indica la deviazione standard da almeno tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: imaging video Live-cella Visualizza il tracciamento del movimento unicellulare. Le linee colorate mostrano la traccia migratoria di ogni cella selezionata di singolo isolato. Per favore clicca qui per scaricare questi video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
È noto che nel processo di migrazione delle cellule, le cellule possono spostare sotto forma di fogli aderenti; cluster sciolti; o singole, isolate cellule. La modalità e la dinamica di invasione delle cellule può variare da uno stato a altro, e il fenotipo può cambiare nel giro di ore. Il tradizionale saggio di guarigione è basato su snapshot foto scattate da un microscopio con un intervallo di tempo, ad esempio 12 o 24 ore. Questo rende difficile catturare la dinamica della chiusura della ferita e il modello di movimenti delle cellule.
D'altra parte, sistemi di imaging di cellule vive monitorare la migrazione cellulare nel corso di un intervallo molto più breve (30 min o 1 h) e presso la stessa posizione, che non è fattibile per immagini scattate manualmente. Il sistema è automatizzato, e i ricercatori hanno solo bisogno di esportare i dati alla fine degli esperimenti. Questo rende possibile monitorare il pattern di movimento delle cellule e il processo di chiusura della ferita in tempo reale. In questo studio, l'incorporazione di un sistema di imaging quantitativo cellule vive nelle analisi di cicatrizzazione consente la cattura di movimento dinamico delle cellule, come pure il processo di chiusura della ferita nel controllo o cellule TIP60-vuotati. Dal video scattata utilizzando un sistema di imaging di cellule vive, la maggior parte delle cellule siControl spostato come un foglio aderente, mentre TIP60-vuotati celle spostate come celluli isolati (Figura 3 e Figura 5).
Proliferazione e morte cellulare può complicare lo studio della migrazione cellulare in un'analisi di guarigione della ferita. Di conseguenza, il test di guarigione viene fatto in medium senza siero per ridurre al minimo l'effetto di proliferazione delle cellule. Inoltre, l'atterramento di TIP60 è stato ottimizzato per ridurre il suo impatto sulla sopravvivenza delle cellule. Tuttavia, è Impossibile eliminare le influenze della proliferazione e morte cellulare nelle analisi di guarigione della ferita. Le istantanee possono solo cattura ferita chiusura ad un certo punto di tempo, rendendo impossibile distinguere se la chiusura della ferita è stata a causa di migrazione delle cellule o la proliferazione delle cellule. Cellule vive imaging consente di monitorare le dinamiche della migrazione cellulare e tiene traccia di movimento delle singole celle, rendendo possibile per i ricercatori distinguere la migrazione delle cellule da proliferazione e morte cellulare. In questo studio, rilevamento delle singole cellule ha rivelato il percorso di migrazione delle cellule singole isolate in condizione di siTIP60, mentre siControl celle spostate per lo più sotto forma di fogli. Il sistema di imaging di cellule vive catturato anche un aumento della migrazione cellulare collettiva (cioè, le cellule migrate come un gruppo coeso) in cellule di siTIP60 rispetto a cellule siControl. Dai video, MCF10A siTIP60 ha mostrato più movimenti cella singola e più veloce migrazione di cellule epiteliali fogli rispetto al siControl (Figura 5).
Vari parametri utilizzati in questo protocollo devono essere ottimizzate per evitare l'errore sperimentale. In primo luogo, il numero di morti di cella dopo trasfezione transiente dovrebbe essere inferiore al 10% per ridurre al minimo l'effetto sulla migrazione cellulare. In questo caso, l'esaurimento delle TIP60 può compromettere la sopravvivenza delle cellule; quindi, i ricercatori dovrebbero essere informati di questo fenotipo potenziale, come può complicare migrazione cellulare. Per evitare questo problema, i ricercatori dovrebbero ottimizzare il numero di cell e la quantità di siRNA utilizzato per vuotare il loro gene bersaglio. Per MCF10A, 1 x 106 cellule con 20 nM siTIP60 era la condizione ottimizzata in questo studio. In secondo luogo, cellule di MCF10A sono spesso difficili da contare e non cluster. Errori nei conteggi delle cellule possono portare a una differenza significativa nei numeri delle cellule iniziali in condizioni diverse, e questo potrebbe essere una variabile di confusione nelle analisi di guarigione della ferita. Per evitare questo problema, tripsinizzano cellule di MCF10A per almeno 20 min Aggiungi completa crescita medio per fermare il trypsinization e Miscelare pipettando su e giù per 20 volte per disperdere i grumi e per renderlo più facile contare. In terzo luogo, le cellule sono di solito al centro del pozzo dopo essere seminato per la piastra a 24 pozzetti. Risospendere le cellule dopo la semina per garantire una distribuzione uniforme. Agitare la piastra in avanti e indietro e di lato prima di mettere in incubatrice. In quarto luogo, lo svuotamento di TIP60 rende la cella più mesenchymal e quindi più difficile da collegare. Se questo accade, è possibile lasciare la piastra nell'incubatore per un periodo di tempo più lungo. Dopo 24 h, le cellule sono collegate di solito. Se le cellule sono ancora non correttamente collegate, i ricercatori potrebbero utilizzare mezzo di sviluppo completo per la semina delle cellule e sostituirlo con medium senza siero quando le cellule sono completamente collegate. Queste cellule sono collegate di solito dopo 12 h in terreno completo. In quinto luogo, il bordo della ferita potrebbe non essere uniforme. Aumentare la velocità di graffiare per creare bordi lisci. In sesto luogo, la ferita può essere troppo grande per visualizzare attraverso la macchina fotografica del microscopio. Utilizzare punte di pipetta 200 µ l con meno forza per generare la ferita. In alternativa, un ago può essere utilizzato per generare un minore divario. In settimo luogo, alcune cellule che si staccano durante graffiare possono ricollegare alla ferita a causa di lavaggi insufficienti. Lavare i pozzetti con medium senza siero invece di PBS, almeno 5 volte. Ottavo, le cellule possono iniziare a staccare dalla piastra dopo alcuni lavaggi. Tuttavia, il numero di lavaggi non può essere compromessi al fine di garantire che cellule indipendente non ricollegare alla ferita. In questo caso, i ricercatori possono lavare le cellule delicatamente 3 volte e lasciare la piastra all'interno dell'incubatrice per un tempo massimo di 1h a lasciare che le celle di stabilirsi prima di procedere con il resto dei lavaggi. Nono, il microscopio può perdere la concentrazione, e le immagini possono diventare sfocate a metà strada attraverso l'esperimento. Un cambiamento di temperatura intorno al microscopio può essere la ragione, come la temperatura ha un effetto minore sulla distanza di fase regolata. I ricercatori dovrebbero accendere il microscopio e temperatura controllo almeno 1 h prima di iniziare l'esperimento per garantire che l'incubatrice è riscaldato prima di regolare la messa a fuoco sulle cellule.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri del laboratorio GAI per loro utili discussioni e commenti. S.J. è stato sostenuto da sovvenzioni da il Singapore National Research Foundation e il Ministero dell'istruzione di Singapore sotto i suoi centri di ricerca dell'iniziativa di eccellenza per il cancro Science Institute di Singapore (R-713-006-014-271), la National Medical Consiglio di ricerca (CBRG-NIG; BNIG11nov001 e CS-IRG; R-713-000-162-511), il fondo di ricerca accademica del Ministero della pubblica istruzione (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 ott -04). Y.Z., G.S.C e C.Y.T. sono stati sostenuti da una borsa di studio post-laurea assegnato dal cancro Science Institute di Singapore, National University of Singapore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53. J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).
- Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).
- Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N.
- Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT. Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).
- Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity. Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).
- Sykes, S. M., et al. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction. Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).
- Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis. Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).
- Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival. J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).
- Gorrini, C., et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response. Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).
- Jha, S., et al. Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway. Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).
- Kim, J. H., et al. Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes. Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).
- Sakuraba, K., et al. Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer. Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).
- Subbaiah, V. K., et al. E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60. Oncogene. , (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R.
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Zhang, Y., et al. TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program. J Mol Cell Biol. , (2016).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
