Summary
Her presenterer vi sanntids overvåking av celle migrasjon i en sårhelende analysen ved hjelp av TIP60-utarmet MCF10A bryst epitelceller. Implementeringen av live-celle Bildeteknikker i våre protokollen tillater oss å analysere og visualisere encellede bevegelse i sanntid og over tid.
Abstract
Sårhelende analysen er effektiv og en av de rimeligste måtene å studere celle migrasjon i vitro. Konvensjonelt, bilder er tatt på begynnelsen og slutten av et eksperiment med en kontrast mikroskopet og migrasjon evnene til celler evalueres etter nedleggelsen av sår. Men cellen bevegelsen er et dynamisk fenomen, og en tradisjonell metoden tillater ikke spore encellede bevegelse. For å forbedre gjeldende sårhelende analyser, bruker vi live-celle Bildeteknikker overvåke celle migrasjon i sanntid. Denne metoden tillater oss å bestemme celle migrasjon prisen basert på en celle sporingssystem og gir et klarere skille mellom celle migrasjon og celle spredning. Her viser vi bruk av live-celle imaging i sårhelende analyser å studere ulike migrasjon evnene til brystet epitelceller påvirket av tilstedeværelsen av TIP60. Cellen motilitet er svært dynamisk, gir vår metode mer innsikt i prosessene av sårheling enn et statisk utvalg av såret nedleggelse tatt med samme tradisjonelle imaging teknikker for sårhelende analyser.
Introduction
HIV-Tat-interaktiv protein 60 kDa (TIP60) er en lysine acetyltransferase som kan acetylate både histone og ikke-histone proteiner1,2. Funksjonene er funnet for å ha konsekvenser i flere signalveier, inkludert transkripsjon, DNA-skade reparasjon og apoptose1,3,4,5,6, 7 , 8. videre TIP60 er ofte downregulated i kreft, og dens downregulation er korrelert med kreft metastasering og dårlig overlevelse priser9,10,11,12, 13,14. Svulst metastasering er den viktigste årsaken til kreft-relaterte dødsfall. Det er en prosess med flere trinn, og det første trinnet av metastasering innebærer overføring og invasjonen av tumorceller i tilstøtende vev15,16. For å gjøre dette, kreftceller først må koble fra primære svulst massen, enten i form av et kollektivt invaderende celle ark eller som frittstående enkeltceller17. Under denne prosessen gjennomgår kreftceller ofte epithelial mesenchymal overgang (EMT), som resulterer i endringer i morfologi og celle vedheft evne17,18.
Noen teknikker er utviklet for å studere overføringen og invasjonen evne til tumor celler i vitro. Blant dem er sår-tilheling analysen mest effektiv og økonomisk19. Først innebærer denne metoden etableringen av en kunstig gapet på en confluent monolayer av celler, slik at cellene å migrere og lukke gapet. Andre kan bilder av hullene hentes på begynnelsen og slutten av eksperimentet. Til slutt brukes en sammenligning av gapet nedleggelse til å bestemme frekvensen av celle migrasjon. Kontrast mikroskop brukes vanligvis til å ta bilder for konvensjonelle sårhelende analyser. En annen fordel med sårhelende analysen er at det delvis ligner i vivo svulst celle migrasjon. Tilsvarende viser i vivo svulst metastasering, celle migrasjon i sårhelende analyser både kollektiv migrasjon epithelial ark og migrering av frittstående enkeltceller.
Imidlertid celle migrasjon er kjent for å være dynamisk, og det er behov for å dokumentere bevegelsen av celler i sanntid. Eksempelvis tillater ikke en konvensjonell sårhelende analysen forsker analysere encellede bevegelse. På den annen side, er celler kultivert for sårhelende analyser ofte serum-sultet å hemme celle spredning. Dette gjøres for å utelukke av gapet nedleggelse på grunn av celle spredning. Likevel vil det fortsatt være noen spredning og celledød, og fase kontrast bilder tatt før og etter eksperimentet ikke klarer å skille mellom dem.
Live-celle tenkelig teknikken løser denne begrensningen av konvensjonelle sårhelende analyser. Bruke live-imaging mikroskop kombinert med CO2 inkubator og riktig temperaturkontroll, forskere kan måle gapet størrelsen og dens rate av nedleggelse over tid mens sporing bevegelsen aktivt overføre celler ligger på tips av den invasiv foran. Derfor implementeringen av live-celle for å overvåke celle migrasjon vil ikke bare gi bedre visualisering av celle migrasjon, men vil også ha muligheten til å skille mellom celle migrasjon og celle spredning, noe som gir en mer pålitelig analyse av celle migrasjon.
I denne studien ble MCF10A bryst epitelceller brukt til å vise en kombinasjon av sårhelende analysen og live-celle for å studere rollen til TIP60 i celle migrasjon. Uttømming av TIP60 resulterer i økt migrasjon evner i MCF10A celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse
- Forberede MCF10A kultur medium: Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) / F12 (1:1) med 5% horse serum, 20 ng/mL epithelial vekstfaktor, 0,5 mg/mL hydrocortisone, 100 ng/mL kolera gift og 10 µg/mL insulin.
- Forberede serum-free medium: DMEM/F12 (1:1) med 20 ng/mL epithelial vekstfaktor, 0,5 mg/mL hydrocortisone, 100 ng/mL kolera gift og 10 µg/mL insulin.
- Bruk følgende siRNA rekkefølge:
siControl:
Frem: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3 "
Omvendt: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3 "
siTIP60:
Frem: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3 "
Omvendt: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3 " - Bruk 10 cm celle kultur retter og 24-og plater.
2. forbigående uttømming av TIP60 bruker siRNA
- På dag 1, aliquot 15 µL av transfection reagensen (f.eks Lipofectamine RNAiMAX) og 2 mL redusert serum medium (f.eks Opti-MEM) og bland dem med 10 µL av hver siRNA (10 µM lager), henholdsvis.
- Inkuber blandingen ved romtemperatur for 20 min.
- Frø 1 x 106 MCF10A celler med 3 mL kultur medium i 10 cm parabol. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Legg siRNA blandingen dråpe for dråpe på 10 cm maten.
- Riste parabolen slik at cellene distribueres like før du setter det i 37 ° C inkubator.
- Etter 6 h med inkubering og erstatte siRNA som inneholder mediet med 8 mL frisk kultur medium.
- På dag 2, forbereder en annen gruppe av siRNA blandinger og ruge dem ved romtemperatur for 20 min.
- Sug opp ut 8 mL kultur medium lagt på dag 1 og erstatte den med 3 mL frisk kultur medium.
- Legge til den andre gruppen av siRNA blanding rettene dråpe for dråpe. Riste den retter for å sikre at reagensene er fullstendig blandet før du setter dem i inkubator.
- Etter 6 h og erstatte siRNA som inneholder mediet med 8 mL frisk kultur medium.
3. frø celler for sårhelende analysen
- Dag 3, forkaste mediet og vask cellene gang med 2 mL fosfat-bufret saltvann (PBS) buffer. Kast PBS bufferen.
- Trypsinize siControl og siTIP60-behandlet celler ved å legge til 1 mL 1 x trypsin-EDTA buffer til platen. Sette den tilbake i inkubator for 20 min.
- Legge til 4 mL fullstendig kultur medium hver plate resuspend cellene av pipettering og overføre dem til en 15-mL tube.
- Sentrifuge 200 g i 5 min og fjerne nedbryting.
- Nytt suspendere cellene med 5 mL av serum-free medium og telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Forberede en celle suspensjon av 6 x 105 celler/mL for både siControl og siTIP60; Kontroller at cellene er godt blandet. Legg til 500 µL av cellen suspensjon i en brønn av en 24-vel-plate for å sikre 100% confluency. Frø 5 til 6 brønner hver for siControl og siTIP60.
- Forsiktig risting plate og tilbake og deretter til siden å sikre jevn fordeling. Unngå en sirkelbevegelse. La platen i inkubator for 24 timer.
- Høste de gjenværende cellene for å kontrollere knockdown effektiviteten av TIP60. Gjør sentrifuge gjenværende celle suspensjon 200 g i 5 min og fjerne nedbryting.
- Isolere RNA bruker en kommersiell reagens, etter produsentens protokoll, og Fortsett til sanntid kvantitative PCR evaluere knockdown effektiviteten.
4. Opprett såret
- Sjekk under fase kontrast mikroskop slik at cellene er fullt vedlagt. Observere cellene under mikroskopet (4 X 10 X og 20 X forstørrelse) slik at cellene er fullt vedlagt som en confluent monolayer av celler har dannet.
Merk: siControl celler vanligvis legge bedre enn siTIP60 celler. Dette forventes fordi uttømming av TIP60 gjør cellene mer mesenchymal som20. Her brukes normalt Borstemmaskin hvitt lys fase kontrast mikroskop. - Vil generere såret, mildt avlyse en rett linje i midten av brønnen med 200 µL pipette tips; lengden på såret generert er den samme som diameter av brønnen. Gjenta dette trinnet for alle gjenværende brønner. Bruk nye pipette tips for hver brønn.
- Vask forsiktig hver vel 5 timene benytter serum-free medium for å fjerne de frittstående cellene.
- Tilsett 1 mL av serum-free medium hver brønn og videre til live-celle bildebehandling.
5. oppsett av Live-celle Imaging
- Slå på mikroskopet og temperaturen kontrollere minst 1 time før live-celle imaging for å sikre at temperaturen i kammeret når 37 ° C.
- Aktivere gassforsyning karbondioksid (CO2) før du starter live-celle avbilding. Angi CO2 konsentrasjonen 5%.
- Plasser 24-vel platen på scenen av mikroskopet og velg linsen med 10 X forstørrelse for bildebehandling. Direkte slippes ut lyset okularene i stedet for kameraet, og justerer fokus for å finne såret og cellene rundt.
Merk: I dette tilfellet, hvitt lys med kontrast ble brukt. - Bruk en live-celle observatør system for å merke plasseringen av såret i hver brønn.
Merk: Automatisert scenen av live-celle tenkelig system tillater bildeopptak på flere posisjoner. Bildene er tatt på hver fair holdning en gang hvert intervall. - Definere betingelsen tid: 1t intervall og 72 h varighet; Ifølge denne innstillingen, vil systemet ta bilder for hver fair holdning hver time i 72 h. satt opp alle ønskede tidsintervallet og periode for overvåking.
Merk: Her en varighet på 72 h er best fordi disse cellene starte dør etter 72 h i serum-free medium.
6. oppfølging encellede bevegelse
- Eksport dataene etter 72 h. eksportere dataene både som bilder i JPEG-format og videoer i AVI format.
Merk: Dette er viktig fordi ImageJ programvare kan bare gjenkjenne videoer i AVI format. De ulike celle migrasjon hastighetene mellom siTIP60 og siControl celler kan observeres tydelig i videoen. - Åpne AVI video i ImageJ programvaren.
- Åpne MTrackJ plugin (plugin må lastes ned og installeres separat): Plugins > MtrackJ.
- Legge til et spor for enkeltceller valgt video ved å klikke kategorien "Legg til" i MtrackJ verktøylinjen. Velg en celle på spissen av invasiv foran og en celle som kan overføre på egen hånd (én celle migrasjon). Følge bevegelsene til de valgte cellene på video og spore dem ved hjelp av MtrackJ.
- Mål avstanden bevegelse ved å klikke kategorien "tiltak" på verktøylinjen.
Merk: Her, nesten ingen celler i siControl flyttet som enkeltceller, gjør det vanskelig å måle encellede bevegelse, mens mange av de siTIP60 cellene flyttet som enkeltceller. Imidlertid kan bevegelsen av celler lokalisert invasiv foran fortsatt spores og beregnet i både siControl og siTIP60 celler. - Lagre videoen med sporene i AVI-format.
7. kvantifisering av celle migrasjon
- For kvantifisering, velger du bilder på 0t og bilder på "n" h, hvor "n" refererer til timepoint når enten siTIP60 eller siControl celler har helt lukket såret.
Merk: Her, 48t ble valgt, som sår i siTIP60 celler var nesten helt lukket. - Kvantifisere prosent overføringen bruker ImageJ bruker følgende formel: (område på såret på 0 h - området sår på "n" h) / område av såret på 0 h x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generelt skjema Live-celle Imaging-baserte celle migrasjon analysen
Figur 1A er et skjema av denne protokollen. MCF10A celler transfekterte med siControl viste typisk epithelial morfologi. Etter uttømming av TIP60 var MCF10A celler mer mesenchymal sammenlignet kontroll celler (figur 1B).
Undersøkelse av TIP60 Knockdown effektivitet
Figur 2 viser TIP60 knockdown effektiviteten. TIP60 uttrykk nivået sunket betraktelig etter siTIP60 behandling. I tillegg til TIP60 var av flere celle overføringsrelaterte proteiner også undersøkt20. For eksempel uttrykket av epitelial vedheft molekyl (EpCAM), som er en epithelial, ble redusert, mens av Fibronectin (FN1) og SNAIL2 (SNAI2), som er både EMT drivere, økte på nedbryting av TIP60. Disse data tyder på at de TIP60 nivåene i MCF10A celler brukes for live-celle imaging var tilstrekkelig redusert.
Nedbryting av TIP60 endres dynamisk av celle migrasjon
Figur 3 viser videoer tatt for siControl og siTIP60 celler. Videoene viser tydelig en raskere celle migrasjon av siTIP60 sammenlignet med siControl. Annet enn denne, ble en forskjell i dynamiske av celle migrasjon mellom siControl og siTIP60 celler også observert (dvs. siControl celler flyttet som et ark, mens mer encellede bevegelse ble observert i siTIP60 celler).
Økning i celle migrasjon etter TIP60 Knockdown
Figur 4 viser kvantifisering av celle migrasjon for siControl og siTIP60 celler. Prosentandelen av overførte cellene betraktelig etter uttømming av TIP60.
TIP60 Uttømming endrer mønsteret av celle migrasjon
Figur 5 viser videoer sporing encellede bevegelse. De fleste av de siControl cellene overført kollektivt som en del av cellen ark, og bare to celler viste én celle migrasjon, mens de fleste siTIP60 celler viste én celle migrasjon. Endringer i mønsteret av celle migrasjon angi at celler med utarmet TIP60 ha en mer mesenchymal fenotypen.
Figur 1: eksperimentell oversikt og representant bilder. (A) skjema av protokollen. (B) representant bilder av MCF10A celler transfekterte med siControl eller siTIP60. MCF10A celler viser en mer mesenchymal morfologi etter uttømming av TIP60. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: TIP60 var effektivt utarmet etter siTIP60 transfection. Sanntid kvantitative PCR ble brukt til å kontrollere uttrykket nivået av TIP60, EpCAM, FN1og SNAI2. Den totale RNA ble isolert bruker Trizol reagens etter produsentens protokoll. 2 µg av den totale av hvert utvalg ble brukt til å lage cDNA. Resultatene er representert som fold-endring. Utgangen ble brukt som en intern kontroll. Feilfelt viser standardavviket fra minst 3 uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Live-celle imaging videoer av siControl og siTIP60 celler Vis forskjellige bevegelsesmønstre for cellen. Tidsintervallet er satt til 1 h varigheten var til 72 timer. Videoen ble tatt med en Zeiss live-celle observatør. Klikk her for å laste ned disse videoene.
Figur 4: kvantifisering av prosentandelen av celle migrasjon. (A) representant bilder Hentet fra live-celle imaging videoer. Bilder tatt på 0t og 48t ble brukt. (B) kvantifisering av prosentandelen av celle migrasjon innen 48 timer ble gjort ved hjelp av ImageJ programvare ved hjelp av følgende formel: (område på såret på 0 h - området sår på "n" h) / område av såret på 0 h x 100. Feilen baren viser standardavviket fra minst tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Live-celle imaging videoer Vis sporing av encellede bevegelse. De fargede linjene viser vandrende sporet av hver valgte isolert celle. Klikk her for å laste ned disse videoene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er kjent at under celle migrasjon, celler kan enten flytte i form av tilhenger arkene. løs klynger; eller enkelt, isolerte celler. Modus og dynamisk celle invasjon kan variere fra én tilstand til en annen, og fenotypen kan endre innen timer. Tradisjonelle sårhelende analysen er basert på øyeblikksbilde bilder fra et mikroskop med en lang tidsintervall, for eksempel 12 eller 24 timer. Dette gjør det vanskelig å fange dynamiske sår nedleggelsen og mønster av cellen bevegelser.
På den annen side, overvåker live-celle tenkelig systemer celle migrasjon over en mye kortere intervall (30 min eller 1 time) og i nøyaktig samme posisjon, som ikke er mulig for bilder tatt manuelt. Systemet er automatisert, og forskere trenger bare å eksportere dataene på slutten av eksperimenter. Dette gjør det mulig å overvåke mønster av cellen bevegelse og prosessen med såret nedleggelse i sanntid. I denne studien gir inkorporering av en kvantitativ live-celle imaging system i sårhelende analyser erobringen av dynamisk celle bevegelse, samt prosessen med såret nedleggelse kontroll eller TIP60-utarmet celler. Av video tatt med en live-celle tenkelig system, de fleste av de siControl cellene flyttet som en tilhenger ark, mens TIP60-utarmet celler flyttet som isolert enkeltceller (Figur 3 og figur 5).
Celle spredning og celledød kan komplisere studiet av celle migrasjon i en sårhelende analysen. Derfor utføres sårhelende analysen i serum-free medium for å minimere virkningen av celle spredning. Også var knockdown av TIP60 optimalisert for å redusere sin innvirkning på celle overlevelse. Men er det umulig å fjerne påvirkninger av celle spredning og celledød i sårhelende analyser. Øyeblikksbilder kan bare fange sår nedleggelse på et bestemt tidspunkt, noe som gjør det umulig å skille om såret nedleggelsen var på grunn av celle migrasjon eller celle spredning. Live-celle bildebehandling overvåker dynamikken i celle migrasjon og sporer enkeltcelle bevegelse, gjør det mulig for forskere å skille celle migrasjon fra celle spredning og celledød. I denne studien viste encellede sporing overføringsbane isolert enkelt cellene i den siTIP60 tilstanden, mens siControl celler flyttet det meste i form av ark. Live-celle tenkelig systemet også fanget en økning i kollektive celle migrasjon (dvs. cellene overført som en sammenhengende gruppe) i siTIP60 celler i forhold til siControl celler. Fra videoer viste MCF10A siTIP60 mer encellede bevegelser og raskere migrering av tarmepitelet ark i forhold til siControl (figur 5).
Ulike parametere brukes i denne protokollen må være optimalisert for å unngå eksperimentelle feil. Først bør antall celle dødsfall etter forbigående transfection være mindre enn 10% å minimere effekten på celle migrasjon. I dette tilfellet kan uttømming av TIP60 redusere celle overlevelse; Derfor bør forskere være klar over denne potensielle fenotype, som det kan komplisere celle migrasjon. For å unngå dette problemet, bør forskere optimalisere celle nummer og mengden siRNA brukes til å tømme sine mål genet. MCF10A, 1 x 106 celler med 20 nM siTIP60 var optimalisert tilstanden i denne studien. Andre er MCF10A celler ofte gruppert og vanskelig å telle. Feil i celletall kan føre til en betydelig forskjell i første celle tall over ulike forhold, og dette kan være en forvirrende variabel i sårhelende analyser. For å unngå dette problemet, trypsinize MCF10A celler i minst 20 min. Legg komplett oppblomstringen medium å stoppe trypsinization og blande av pipettering opp og ned 20 ganger å spre klumper og å gjøre det enklere å telle. Tredje er cellene vanligvis i midten av brønnen etter tilværelse frø til 24-vel plate. Nytt suspendere cellene etter frø for å sikre en jevn distribusjon. Riste platen og tilbake og siden før du setter det i inkubator. Fjerde, uttømming av TIP60 gjør cellen mer mesenchymal og dermed vanskeligere å feste. Hvis dette skjer, kan du la platen i inkubator for en lengre periode. Etter 24 h knyttes vanligvis cellene. Hvis cellene er fortsatt ikke riktig tilkoblet, kan forskere bruke fullstendig oppblomstringen medium for cellen såing og erstatte den med serum-free medium når cellene er fullt. Disse cellene er vanligvis knyttet etter 12 h i fullstendig medium. Femte kanskje kanten av såret ikke være glatte. Øke hastigheten på avlysning for å lage jevne kanter. Sjette kan såret være for stor til å visualisere gjennom kameraet til mikroskopet. Bruk 200 µL pipette-spisser med mindre styrke for å generere såret. Alternativt kan en nål brukes til å generere en mindre gap. Syvende, noen celler som er løsrevet under skrape re fester seg til såret på grunn av utilstrekkelig vasker. Vask brønnene med serum-free medium i stedet for PBS minst 5 ganger. Åttende, cellene kan begynne å koble fra platen etter noen gangers vask. Imidlertid kan ikke antall vasker bli svekket slik at frittliggende celler ikke å legge til såret. I dette tilfellet kan forskere vaske cellene forsiktig 3 ganger og la platen i inkubator for en maksimal tid med 1t la cellene slå seg ned før du fortsetter med resten av vasker. Niende mikroskopet kan miste fokus, og bilder kan bli uklare halvveis gjennom eksperimentet. En endring i temperaturen rundt mikroskopet kan være grunnen, som temperatur har mindre effekt på justert scenen avstand. Forskere bør slå på mikroskopet og temperatur kontroll minst 1 time før du starter eksperimentet slik at inkubatoren er varmet opp før du justerer fokus på celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker medlemmene av Jha laboratorium for sine nyttig diskusjon og kommentarer. S.J. ble støttet av tilskudd fra National Research Foundation Singapore og Singapore utdanningsdepartementet under sin forskning sentre for fremragende initiativ til den kreft Science Institute i Singapore (R-713-006-014-271), den nasjonale medisinsk Research Council (CBRG-NIG; BNIG11nov001 og CS-IRG; R-713-000-162-511), utdannings akademisk forskning fondet (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 oktober-04). Y.Z., G.S.C. og C.Y.T. ble støttet av en post graduate fellowship tildelt av kreft Science Institute i Singapore, til National University of Singapore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53. J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).
- Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).
- Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. Cellular functions of TIP60. Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).
- Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT. Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).
- Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity. Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).
- Sykes, S. M., et al. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction. Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).
- Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis. Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).
- Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival. J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).
- Gorrini, C., et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response. Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).
- Jha, S., et al. Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway. Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).
- Kim, J. H., et al. Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes. Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).
- Sakuraba, K., et al. Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer. Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).
- Subbaiah, V. K., et al. E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60. Oncogene. , (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Zhang, Y., et al. TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program. J Mol Cell Biol. , (2016).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
