Summary
Hier presenteren we de real-time bewaking van de cel migratie in een wondgenezing assay met behulp van TIP60-verarmd MCF10A borst epitheliale cellen. De uitvoering van live-cel beeldvormingstechnieken in ons protocol kan we analyseren en visualiseren van eencellige verkeer in real time en in de tijd.
Abstract
De wondgenezing bepaling is efficiënt en één van de voordeligste manieren om de cel migratie in vitrostudie. Conventioneel, images zijn geschoten aan het begin en einde van een experiment met behulp van een Microscoop fase contrast, en de capaciteiten van de migratie van de cellen worden geëvalueerd door de sluiting van wonden. Cel verkeer is een dynamisch verschijnsel echter, en een conventionele methode voor het bijhouden van eencellige verkeer niet mogelijk. We gebruik om te verbeteren huidige wondgenezing testen, live-cel beeldvormingstechnieken cel migratie in real-time volgen. Deze methode laat ons toe om het bepalen van de cel migratie percentage op basis van een cel tracking systeem en biedt een duidelijker onderscheid tussen cel migratie en celproliferatie. Wij tonen hier, het gebruik van live-cel beeldvorming in de wond-genezing testen te bestuderen van de capaciteiten van de verschillende migratie van borst epitheliale cellen beïnvloed door de aanwezigheid van TIP60. Als cel beweeglijkheid zeer dynamisch is, biedt onze methode meer inzicht in de processen van wond genezing dan een momentopname van de wond sluiting genomen met de traditionele beeldvormingstechnieken gebruikt voor wondgenezing testen.
Introduction
HIV-Tat-interactieve eiwit 60 kDa (TIP60) is een lysine-acetyltransferase die zowel histone en niet-Histon eiwitten1,2 acetylate kan. De functies worden gevonden gevolgen kunnen hebben in meerdere signaalroutes, met inbegrip van transcriptie, DNA-schade reparatie en apoptosis1,3,4,5,6, 7 , 8. Bovendien TIP60 is vaak werden in kanker, en haar Downregulatie is gecorreleerd met kanker uitzaaiingen en arme survival tarieven9,10,11,12, 13,14. Uitzaaiing van de tumor is de belangrijkste oorzaak van sterfgevallen ten gevolge van kanker. Het is een proces van meerdere stappen, en de eerste stap van metastase impliceert de migratie en invasie van tumorcellen in aangrenzende weefsels15,16. Om dit te doen, tumorcellen eerst moeten loskoppelen van de primaire tumor massa, hetzij in de vorm van een collectief binnenvallende cellaag of vrijstaand als afzonderlijke cellen17. Tijdens dit proces ondergaan vaak tumorcellen epitheliale mesenchymale overgang (EMT), wat resulteert in veranderingen in de morfologie en cel adhesie vermogen17,18.
Een paar technieken zijn ontwikkeld om te bestuderen van de migratie en invasie vermogen van tumor cellen in vitro. Onder hen is de wondgenezing bepaling de meest efficiënte en voordelige19. Deze methode houdt ten eerste de oprichting van een kunstmatige kloof op een confluente enkelgelaagde van cellen, waardoor de cellen om te migreren en de kloof dichten. Ten tweede, kunnen beelden van de lacunes worden vastgelegd aan het begin en einde van het experiment. Tot slot wordt een vergelijking van kloof sluiting gebruikt voor het bepalen van de omvang van de migratie van de cel. Een fase contrast Microscoop wordt meestal gebruikt om beelden voor conventionele wondgenezing testen te vangen. Een ander voordeel van de wondgenezing bepaling is dat deels in vivo tumor cel migratie lijkt. Ook toont in vivo de uitzaaiing van de tumor, cel migratie in de wond-genezing assays zowel de collectieve migratie van epitheliale bladen en de migratie van vrijstaande afzonderlijke cellen.
Echter cel migratie is bekend om zijn dynamische, en er is een noodzaak voor het documenteren van het verkeer van cellen in real-time. Een conventionele wondgenezing assay staat bijvoorbeeld geen een onderzoeker voor het analyseren van eencellige beweging. Aan de andere kant, zijn cellen gekweekt voor wondgenezing testen vaak serum-uitgehongerd voor de remming van celproliferatie. Dit wordt gedaan om het uitsluiten van de mogelijkheid van kloof sluiting als gevolg van celproliferatie. Toch zullen er nog sommige proliferatie en celdood, en fase-contrast beelden genomen vóór en na het experiment niet in staat om onderscheid tussen hen te zijn.
De live-cel beeldvormende techniek richt deze beperking van conventionele wondgenezing tests. Met behulp van een Microscoop wonen-imaging in combinatie met een CO2 incubator en passende temperatuurregeling, onderzoekers de kloof grootte kunnen meten en het percentage van de sluiting na verloop van tijd terwijl tracering van het verkeer van actief migreren cellen gelegen op de toppen van de invasieve voorkant. Vandaar, de uitvoering van live-cel imaging als u wilt controleren cel migratie zal niet alleen het leveren van betere visualisatie van cel migratie, maar zal ook voorzien in de mogelijkheid om te differentiëren tussen cel migratie en celproliferatie, waardoor een meer betrouwbare analyse van cel migratie.
In deze studie werden MCF10A borst epitheliale cellen gebruikt om aan te tonen van de combinatie van de wond-genezing assay en live-cel imaging om te bestuderen van de rol van TIP60 in cel migratie. De uitputting van de TIP60 resulteert in verhoogde migratie capaciteiten in MCF10A cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding
- MCF10A-kweekmedium bereiden: Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) / F12 (1:1) met 5% paard serum, 20 ng/mL epitheliale groeifactor 0,5 mg/mL hydrocortison, 100 ng/mL cholera-toxine en 10 µg Fe/mL insuline.
- Bereiden serumvrij medium: DMEM/F12 (1:1) met 20 ng/mL epitheliale groeifactor, 0,5 mg/mL hydrocortison 100 ng/mL cholera-toxine en 10 µg Fe/mL insuline.
- Gebruik de volgende siRNA-reeks:
siControl:
Forward: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
Omgekeerde: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
siTIP60:
Forward: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
Omgekeerde: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3' - Gebruik 10-cm cel cultuur gerechten en 24-Wells-platen.
2. Pre-steady uitputting van TIP60 met behulp van siRNA
- Op dag 1, aliquoot 15 µL van transfectiereagens (bv Lipofectamine RNAiMAX) en 2 mL serum medium (bijvoorbeeld Opti-MEM) verminderd en meng ze met 10 µL van elke siRNA (10 µM stock), respectievelijk.
- Laat het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten inwerken.
- Beënt, 1 x 106 MCF10A cellen samen met 3 mL gestolde voedingsbodem in een 10 cm schotel. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen.
- Het mengsel van siRNA druppelsgewijs toevoegen aan de 10 cm schotel.
- Schud de schotel om ervoor te zorgen dat de cellen gelijk verdeeld alvorens het in de 37 ° C incubator.
- Na 6 uur incubatie wordt het medium siRNA-bevattende vervangen door 8 mL verse kweekmedium.
- Op dag 2, een andere partij van siRNA mengsels voor te bereiden en hen uit te broeden bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
- Gecombineerd uit 8 mL gestolde voedingsbodem toegevoegd op dag 1 en 3 mL verse voedingsbodem te vervangen.
- De tweede partij van siRNA mengsel toevoegen aan de gerechten door druppelsgewijs. Schud de gerechten om ervoor te zorgen dat de reagentia volledig worden gemengd alvorens ze in de incubator.
- Na 6 uur, door het medium van siRNA-bevattende te vervangen door 8 mL verse kweekmedium.
3. zaad cellen voor de wondgenezing Assay
- Op dag 3, negeren van het medium en wassen van de cellen een keer met 2 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) buffer. Gooi de PBS-buffer.
- Trypsinize de siControl en de siTIP60-behandelde cellen door 1 mL 1 x trypsine-EDTA-buffer toe te voegen aan de plaat. Zet het terug in de incubator voor 20 min.
- 4 mL volledige kweekmedium toevoegen aan elke plaat, resuspendeer de cellen door pipetteren en hen overbrengen in een tube van 15 mL.
- Centrifugeer bij 200 g gedurende 5 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie.
- Resuspendeer de cellen met 5 mL van serumvrij medium en met behulp van een hemocytometer cellen tellen.
- Bereid een celsuspensie van 6 x 105 cellen/mL voor zowel de siControl als de siTIP60; Controleer of de cellen goed gemengd. Voeg 500 µL van de celsuspensie aan één putje van de plaat van een 24-well om ervoor te zorgen 100% confluentie. Zaad van 5 tot en met 6 putten, elk voor siControl en siTIP60.
- Zachtjes schud de plaat heen en weer en dan links-naar-rechts om een gelijkmatige verdeling. Vermijd een cirkelbeweging. Laat de plaat in de incubator gedurende 24 uur.
- De resterende cellen om te controleren de vechtpartij efficiëntie van TIP60 te oogsten. Om dit te doen, centrifugeren van de resterende celsuspensie bij 200 g gedurende 5 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie.
- Isoleren van RNA met behulp van een commerciële reagens, volgens protocol van de fabrikant, en overgaan tot kwantitatieve PCR in real time om de vechtpartij doeltreffendheid te beoordelen.
4. Maak de wond
- Kijk onder een fasecontrastmicroscoop om ervoor te zorgen dat de cellen volledig zijn gekoppeld. Observeren van de cellen onder de Microscoop (4 X, 10 X en 20 X vergroting) om ervoor te zorgen dat de cellen volledig zijn gekoppeld dat een confluente enkelgelaagde van cellen heeft gevormd.
Opmerking: siControl cellen meestal hechten beter dan siTIP60 cellen. Dit is omdat de uitputting van de TIP60 de cellen meer mesenchymale-achtige20 maaktverwacht. Hier, wordt een normale benchtop wit-licht fasecontrastmicroscoop gebruikt. - Voor het genereren van de wond, zachtjes kras een rechte lijn in het midden van de put met een 200 µL Pipetteer tip; de lengte van de wond gegenereerd is gelijk aan de diameter van de put. Herhaal deze stap voor alle resterende putjes. Gebruik een nieuwe Pipet tip voor elk putje.
- Voorzichtig wassen elk goed 5 keer met serumvrij middellange tot de vrijstaande cellen verwijderen.
- 1 mL van serumvrij medium toevoegen aan elk putje en overgaan tot live-cel imaging.
5. setup voor Live-cel Imaging
- Inschakelen van de Microscoop en de temperatuurregeling ten minste 1 uur vóór de oprichting van live-cel imaging om ervoor te zorgen dat de temperatuur in de kamer 37 ° C. bereikt
- De levering van het gas kooldioxide (CO2) voordat de beeldvorming van de live-cel inschakelen. Stel de CO2 -concentratie op 5%.
- Plaats de plaat 24-well in het werkgebied van de Microscoop en selecteer het objectief met 10 X vergroting voor imaging. Direct van het uitgestraalde licht aan de oculairs in plaats van de camera en pas de focus om de wond en de cellen eromheen te vinden.
Opmerking: In dit geval, wit licht met fase contrast werd gebruikt. - Gebruik een live-cel waarnemer systeem ter gelegenheid van de positie van de wond in elk putje.
Opmerking: De geautomatiseerde fase van het leven-cel imaging systeem voorziet Beeldacquisitie op meerdere posities. Images zijn geschoten op elke gemarkeerde positie eens elk interval. - Instellen van de tijd voorwaarde: 1 h-interval en 72 h duur; Volgens deze instelling, zal het systeem foto's nemen op elke gemarkeerde positie, elk uur voor 72 h. elke gewenste tijdsinterval instellen en de periode voor monitoring.
Opmerking: Hier, een duur van 72 uur is best omdat deze cellen beginnen sterven na 72 uur in serumvrij medium.
6. het bijhouden van eencellige verkeer
- De gegevens exporteren nadat 72 h. de gegevens exporteren als afbeeldingen in JPEG-indeling en als video's in AVI-formaat.
Opmerking: Dit is belangrijk omdat ImageJ software alleen video's in AVI-formaat herkent. De andere cel migratie snelheden tussen siTIP60 en siControl cellen is duidelijk waarneembaar in de video. - De AVI-video in de ImageJ software openen.
- Open de MTrackJ plugin (de plugin moet worden gedownload en geïnstalleerd afzonderlijk): Plugins > MtrackJ.
- Het toevoegen van een track voor afzonderlijke cellen gekozen uit de video door te klikken op de "Add"-tab in de werkbalk van de MtrackJ. Kies een cel op het puntje van de invasieve voorkant en een cel op eigen migreren kunt (eencellige migratie). Volg de beweging van de gekozen cellen op de video en sporen hen met behulp van MtrackJ.
- Meet de afstand van het verkeer door te klikken op het tabblad "maatregel" op de werkbalk.
Opmerking: Hier bijna geen cellen in het siControl verplaatst als afzonderlijke cellen, waardoor het moeilijk te meten van eencellige beweging, overwegende dat veel van de siTIP60 cellen als afzonderlijke cellen verplaatst. Het verkeer van cellen gelegen invasieve vooraan kan echter nog worden getraceerd en berekend in zowel siControl als siTIP60 cellen. - De video met de tracks in AVI-formaat opslaan.
7. kwantificering van cel migratie vermogen
- Selecteer afbeeldingen bij 0 h en afbeeldingen op h van de "n", waarbij "n" naar het timepoint verwijst wanneer de siTIP60 of de siControl cellen hebben de wond volledig gesloten voor kwantificering.
Opmerking: Hier, 48 h werd gekozen, zoals de wonden in de siTIP60 cellen werden bijna volledig gesloten. - Kwantificeren van de percentage migratie met behulp van ImageJ met de volgende formule: (gebied van wond bij 0 h - gebied van wond op "n" h) / gebied van wond bij 0 h x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Algemene Schema van Live-Imaging gebaseerde cel migratie Assay
Figuur 1A is een schema van dit protocol. MCF10A cellen transfected met siControl toonde typische epitheliale morfologie. Na de uitputting van de TIP60 waren MCF10A cellen meer mesenchymale in vergelijking met cellen (figuur 1B).
Onderzoek van TIP60 vechtpartij efficiëntie
Figuur 2 toont de vechtpartij efficiëntie van TIP60. De TIP60 expressie niveau aanzienlijk afgenomen na de siTIP60 behandeling. Naast de TIP60 werden de uitingen van verschillende cel migratie-gerelateerde eiwitten ook onderzocht20. Bijvoorbeeld, de uitdrukking van epitheliale adhesie molecuul (EpCAM), oftewel een epitheliale marker, werd verlaagd, terwijl de blijken van fibronectine (FN1) en SNAIL2 (SNAI2), die zijn beide coureurs van de EMT, werden verhoogd op uitputting van de TIP60. Deze gegevens duiden erop dat de niveaus van de TIP60 in de MCF10A cellen die worden gebruikt voor live-cel imaging voldoende werden verlaagd.
Uitputting van de TIP60 verandert de dynamiek van de cel migratie
Figuur 3 toont de video's genomen voor siControl en siTIP60 cellen. De video's tonen duidelijk aan een snellere cel migratie van siTIP60 ten opzichte van siControl. Anders dan dit, werd een verschil in de ontwikkelingsdynamiek van cel migratie tussen siControl en siTIP60 cellen ook waargenomen (dat wil zeggen, siControl cellen verplaatst als een blad, overwegende dat meer eencellige beweging werd waargenomen in de siTIP60 cellen).
Stijging van de cel migratie na TIP60 Knockdown
Figuur 4 toont de kwantificering van cel migratie voor siControl en siTIP60 cellen. Het percentage van de gemigreerde cellen aanzienlijk toegenomen na de uitputting van de TIP60.
TIP60 Uitputting verandert het patroon van de cel migratie
Figuur 5 toont video's bijhouden eencellige beweging. Allermeest naar de siControl cellen collectief gemigreerd als onderdeel van de cel bladen, en slechts twee cellen toonde eencellige migratie, overwegende dat de meeste siTIP60 cellen toonde eencellige migratie. De veranderingen in het patroon van de cel migratie geven dat cellen met verarmd TIP60 een meer mesenchymale fenotype hebben.
Figuur 1: Experimental overzicht en representatieve beelden. (A) Schema van het protocol. (B) representatieve beelden van MCF10A cellen transfected met siControl of siTIP60. MCF10A cellen tonen een meer mesenchymale morfologie na de uitputting van de TIP60. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: TIP60 was efficiënt uitgeput na siTIP60 transfectie. Kwantitatieve PCR in real time werd gebruikt om te controleren van het niveau van de expressie van TIP60, EpCAM, FN1en SNAI2. De totale RNA werd geïsoleerd met behulp van Trizol reagens volgens de vervaardiging's protocol. 2 µg totaal RNA van elk monster werd gebruikt voor het maken van cDNA. De resultaten worden weergegeven als de vouw-verandering. Actin werd gebruikt als een interne controle. Foutbalk geeft de standaardafwijking van ten minste 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Live-cel imaging video's van siControl en siTIP60 cellen tonen verschillende patronen van cel verkeer. Het interval is ingesteld op 1 h en de duur was tot 72 h. De video werd genomen met behulp van een Zeiss live-cel waarnemer. Gelieve Klik hier om deze video's downloaden.
Figuur 4: kwantificering van het percentage van de cel migratie. (A) representatieve beelden werden verkregen imaging video van live-cel. Foto's genomen bij 0 uur en 48 uur werden gebruikt. (B) kwantificering van het percentage van de cel migratie binnen 48u werd gedaan met behulp van ImageJ software met behulp van de volgende formule: (gebied van wond bij 0 h - gebied van wond op "n" h) / gebied van wond bij 0 h x 100. De foutbalk geeft de standaardafwijking van ten minste drie onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Live-cel imaging video's laten zien van het volgen van beweging van eencellige. De gekleurde lijnen tonen de trekkende track van elke geselecteerde geïsoleerde eencellige. Gelieve Klik hier om deze video's downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het is bekend dat in het proces van migratie van de cel, cellen ofwel beweging in de vorm van aanhangend vellen kunnen; losse clusters; of enkele, geïsoleerde cellen. De modus en de dynamiek van de invasie van de cel kunnen variëren van één voorwaarde naar de andere en het fenotype binnen uur kunt wijzigen. De traditionele wondgenezing bepaling is gebaseerd op opnames van de momentopname van een microscoop met een lange tijdsinterval, bijvoorbeeld 12 of 24 h. Dit maakt het moeilijk om de dynamiek van de sluiting van de wond en het patroon van de cel bewegingen te vangen.
Aan de andere kant, controleren live-cel beeldvormingssystemen cel migratie over een veel kortere interval (30 minuten of 1 h) en aan de exact dezelfde positie, dat niet haalbaar voor opnamen handmatig is. Het systeem is geautomatiseerd, en onderzoekers hoeft alleen voor het exporteren van de gegevens aan het eind van de experimenten. Dit maakt het mogelijk om het patroon van de cel verkeer en het proces van sluiting van de wond in real time te controleren. In deze studie zorgt de opneming van een kwantitatieve imaging systeem van de live-cel in de wond-genezing testen voor de inname van dynamische cel verkeer, alsmede het proces van sluiting van de wond in control of TIP60-uitgeputte cellen. Uit de video genomen met behulp van een live-cel imaging systeem, allermeest naar de siControl cellen verplaatst als een aanhangend vel, overwegende dat de TIP60 uitgeput cellen verplaatst als geïsoleerde afzonderlijke cellen (Figuur 3 en Figuur 5).
Celproliferatie en celdood kunnen het onderzoek van de cel migratie in een wond-genezing assay bemoeilijken. Daarom wordt de wondgenezing bepaling uitgevoerd in serumvrij medium om te minimaliseren van het effect van celproliferatie. Ook werd het knockdown van TIP60 geoptimaliseerd om het effect ervan op de overleving van de cel. Het is echter onmogelijk om te elimineren van de invloeden van celproliferatie en dood van de cel in de wond-genezing testen. De snapshots kunnen enige opname wond sluiting op een bepaald tijdstip, waardoor het onmogelijk is om te onderscheiden of de sluiting van de wond te wijten aan cel migratie of celproliferatie was. Live-cel beeldvorming controleert de migratiedynamiek cel en individuele cel verkeer, waardoor het mogelijk is voor onderzoekers om te onderscheiden van cel migratie van celproliferatie en celdood wordt bijgehouden. In deze studie bleek eencellige volgen het migratiepad van de geïsoleerde, afzonderlijke cellen in de siTIP60 staat, terwijl siControl cellen meestal in de vorm van vellen verplaatst. De live-cel imaging systeem gevangen ook een toename van de collectieve cel migratie (dat wil zeggen, de cellen gemigreerd als een samenhangende groep) in siTIP60 cellen ten opzichte van siControl cellen. Van de video's, MCF10A siTIP60 toonde eencellige bewegingen steeds sneller migratie van epitheliale cel vellen in vergelijking met siControl (Figuur 5).
Verschillende parameters die worden gebruikt in dit protocol moeten worden geoptimaliseerd om te voorkomen dat experimentele mislukking. Eerste plaats is het aantal doden van de cel na voorbijgaande transfectie moet minder dan 10% tot een minimum beperken van het effect op de cel migratie. In dit geval, kan de uitputting van de TIP60 verminderen de overleving van de cel; Vandaar, onderzoekers moeten zich bewust van dit potentiële fenotype, zijn, zoals het cel migratie kan bemoeilijken. U kunt dit probleem omzeilen, zou moeten onderzoekers optimaliseren de celaantal en het bedrag van siRNA gebruikt om afbrekende hun doel-gen. Voor MCF10A, 1 x 106 cellen met 20 nM siTIP60 was de geoptimaliseerde voorwaarde in deze studie. Ten tweede, MCF10A cellen zijn vaak geclusterd en moeilijk te tellen. Fouten in cellen kunnen leiden tot een significant verschil in de eerste cel nummers over verschillende omstandigheden, en dit zou een storende variabele in de wond-genezing testen. U kunt dit probleem omzeilen, trypsinize MCF10A cellen voor ten minste 20 min. volledige groeimedium toevoegen om te stoppen met het trypsinebehandeling en meng door pipetteren op en neer 20 keer te verspreiden van de bosjes en gemakkelijker te tellen. Ten derde, cellen zijn meestal in het midden van de put na wordt zaadjes aan de plaat 24-well. Resuspendeer de cellen na zaaien om ervoor te zorgen voor een gelijkmatige verdeling. Schud de plaat heen en weer en zijdelings alvorens het in de incubator. Ten vierde, de uitputting van de TIP60 maakt de cel meer mesenchymale en dus moeilijker te hechten. Als dit gebeurt, laat de plaat in de incubator voor een langere periode van tijd. Na 24 h, zijn meestal de cellen gekoppeld. Als de cellen nog steeds niet correct zijn aangesloten, kunnen onderzoekers gebruiken volledige groeimedium voor cel zaaien en het vervangen van serumvrij medium wanneer de cellen volledig zijn aangesloten. Deze cellen zijn meestal gehecht na 12u in volledige medium. Ten vijfde: de rand van de wond mogelijk niet vloeiend. Verhoog de snelheid van het krabben tot schermlettertypen bijwerken. Ten zesde, de wond kan zijn te groot om te visualiseren via de camera van de Microscoop. Gebruik 200 µL Pipetteer tips met minder kracht voor het genereren van de wond. Anderzijds kan een naald worden gebruikt voor het genereren van een kleinere opening. Sommige cellen die losgekoppeld tijdens krabben kunnen zevende, opnieuw aansluit op de wond te wijten aan onvoldoende wast. Was de putjes met serum-gratis medium in plaats van PBS minstens 5 keer. Achtste, cellen kunnen beginnen met het loskoppelen van de plaat, nadat een paar wast. Echter, het aantal wasbeurten niet kan worden aangetast om ervoor te zorgen dat vrijstaande cellen niet opnieuw aan de wond hechten doen. In dit geval kunnen onderzoekers wassen de cellen zachtjes 3 keer en laat de plaat in de incubator voor een maximumduur van 1 uur te laten de cellen settelen voordat u verdergaat naar de rest van de wast. Negende, de microscoop kan verliezen richten, en de beelden kunnen worden wazig halverwege via het experiment. Een verandering in temperatuur rond de microscoop kan worden de reden, als temperatuur een klein effect op de aangepaste fase afstand heeft. Onderzoekers moeten inschakelen van de Microscoop en temperatuurregeling ten minste 1 uur voordat het experiment om ervoor te zorgen dat de incubator is opgewarmd vooraleer u de focus op de cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Wij danken de leden van het JBZ-laboratorium voor hun nuttige discussie en commentaar. S.J. werd gesteund door subsidies van de National Research Foundation Singapore en het Singapore ministerie van onderwijs onder de onderzoekscentra van Excellence initiatief naar de kanker Science Institute van Singapore (R-713-006-014-271), de nationale medische Onderzoeksraad (CBRG-NIG; BNIG11nov001 en CS-IRG; R-713-000-162-511), het ministerie van onderwijs academische onderzoeksfonds (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 okt-04). Y.Z., G.S.C. en C.Y.T. werden ondersteund door een postdoctorale fellowship uitgereikt door de kanker Science Institute van Singapore, National University of Singapore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53. J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).
- Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).
- Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. Cellular functions of TIP60. Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).
- Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT. Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).
- Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity. Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).
- Sykes, S. M., et al. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction. Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).
- Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis. Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).
- Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival. J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).
- Gorrini, C., et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response. Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).
- Jha, S., et al. Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway. Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).
- Kim, J. H., et al. Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes. Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).
- Sakuraba, K., et al. Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer. Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).
- Subbaiah, V. K., et al. E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60. Oncogene. , (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Zhang, Y., et al. TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program. J Mol Cell Biol. , (2016).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
