TIP60 के क्षणिक कमी के बाद स्तन उपकला कोशिका प्रवास के लाइव इमेजिंग
Summary
यहां, हम TIP60-घट MCF10A स्तन उपकला कोशिकाओं का उपयोग कर एक घाव भरने परख में सेल प्रवास के वास्तविक समय निगरानी प्रस्तुत करते हैं । हमारे प्रोटोकॉल में रहते सेल इमेजिंग तकनीक के कार्यांवयन हमें विश्लेषण और वास्तविक समय में और समय के पार एकल सेल आंदोलन कल्पना करने के लिए अनुमति देता है ।
Abstract
घाव-हीलिंग परख कुशल और सबसे किफायती तरीके से इन विट्रो मेंसेल प्रवास के अध्ययन में से एक है । पारंपरिक रूप से, छवियां शुरुआत और एक चरण के विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक प्रयोग के अंत में ले रहे हैं, और कोशिकाओं के प्रवास क्षमताओं घावों के बंद द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं । हालांकि, सेल आंदोलन एक गतिशील घटना है, और एक पारंपरिक विधि एकल सेल आंदोलन पर नज़र रखने के लिए अनुमति नहीं है । वर्तमान घाव-हीलिंग परख में सुधार करने के लिए, हम लाइव सेल इमेजिंग तकनीक का उपयोग करने के लिए वास्तविक समय में सेल प्रवास की निगरानी । इस विधि हमें सेल माइग्रेशन दर एक सेल ट्रैकिंग प्रणाली के आधार पर निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है और सेल प्रवास और सेल प्रसार के बीच एक स्पष्ट अंतर प्रदान करता है । यहां, हम TIP60 की उपस्थिति से प्रभावित स्तन उपकला कोशिकाओं के विभिन्न प्रवास क्षमताओं का अध्ययन करने के लिए घाव-चिकित्सा परख में रहते सेल इमेजिंग के उपयोग का प्रदर्शन. के रूप में सेल गतिशीलता अत्यधिक गतिशील है, हमारी विधि घाव भरने की प्रक्रिया में और अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है घायल उपचार पारंपरिक इमेजिंग घाव चिकित्सा परख के लिए इस्तेमाल तकनीक के साथ लिया बंद का एक स्नैपशॉट से ।
Introduction
एचआईवी-जैसे-इंटरैक्टिव प्रोटीन ६० केडीए (TIP60) एक lysine acetyltransferase है जो citrullinated और नॉन-citrullinated प्रोटीन्स1,2को acetylate कर सकता है । अपने कार्यों के लिए प्रतिलेखन, डीएनए क्षति की मरंमत सहित कई संकेत मार्ग, में निहितार्थ है पाया, और apoptosis1,3,4,5,6, 7 , 8. इसके अलावा, TIP60 अक्सर कैंसर में downregulated है, और इसके downregulation के साथ संबंधित है cancer मेटास्टेसिस और गरीब जीवित रहने की दर9,10,11,12, 13,14. ट्यूमर मेटास्टेसिस कैंसर से संबंधित मौत का प्रमुख कारण है । यह एक बहु कदम प्रक्रिया है, और मेटास्टेसिस के प्रारंभिक चरण में आसन्न ऊतकों में ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवास और आक्रमण शामिल है15,16. आदेश में ऐसा करने के लिए, ट्यूमर कोशिकाओं को पहले प्राथमिक ट्यूमर द्रव्यमान से अलग करना चाहिए, या तो सामूहिक रूप से एक सेल शीट के रूप में या अलग एकल कोशिकाओं के रूप में17। इस प्रक्रिया के दौरान, ट्यूमर कोशिकाओं को अक्सर उपकला mesenchymal संक्रमण (EMT), आकृति विज्ञान और सेल आसंजन क्षमता17,18में परिवर्तन में जिसके परिणामस्वरूप से गुजरना ।
कुछ तकनीकों के लिए प्रवास और इन विट्रो मेंट्यूमर कोशिकाओं के आक्रमण की क्षमता का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है । उनमें से, घाव हीलिंग परख सबसे कुशल और किफायती19है । सबसे पहले, इस विधि कोशिकाओं की एक धाराप्रवाह monolayer पर एक कृत्रिम अंतराल के निर्माण, इस प्रकार कोशिकाओं को स्थानांतरित करने और अंतर को बंद करने की अनुमति शामिल है । दूसरा, अंतराल की छवियाँ शुरुआत और प्रयोग के अंत में कब्जा कर लिया जा सकता है. अंत में, अंतर बंद करने की तुलना सेल माइग्रेशन की दर निर्धारित करने के लिए किया जाता है । एक चरण के विपरीत माइक्रोस्कोप आमतौर पर पारंपरिक घाव उपचार परख के लिए छवियों पर कब्जा करने के लिए प्रयोग किया जाता है । घाव भरने की परख का एक और लाभ यह है कि यह आंशिक रूप से vivo ट्यूमर सेल प्रवास में जैसा दिखता है । इसी तरह vivo में ट्यूमर मेटास्टेसिस, सेल माइग्रेशन घाव-हीलिंग परख में उपकला चादरें और अलग एकल कोशिकाओं के प्रवास के दोनों सामूहिक प्रवास से पता चलता है.
हालांकि, सेल माइग्रेशन गतिशील होने के लिए जाना जाता है, और वास्तविक समय में कोशिकाओं के आंदोलन दस्तावेज़ के लिए एक की जरूरत है । उदाहरण के लिए, एक पारंपरिक घाव-चिकित्सा परख एक शोधकर्ता को एकल सेल आंदोलन का विश्लेषण करने की अनुमति नहीं है । दूसरी ओर, घाव चिकित्सा परख के लिए प्रसंस्कृत कोशिकाओं अक्सर सीरम-कोशिका प्रसार को बाधित भूखे हैं । इस सेल प्रसार के कारण अंतर बंद करने की संभावना को शासन करने के लिए किया जाता है । बहरहाल, वहां अभी भी कुछ प्रसार और कोशिका मृत्यु हो, और चरण इसके विपरीत पहले और प्रयोग के बाद छवियों के लिए उन दोनों के बीच अंतर करने में असमर्थ रहे है हो जाएगा ।
लाइव सेल इमेजिंग तकनीक पारंपरिक घाव उपचार परख की इस सीमा के पते । एक सह2 मशीन और उचित तापमान नियंत्रण के साथ संयुक्त एक जीवित इमेजिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, शोधकर्ताओं के सुझावों पर स्थित सक्रिय रूप से पलायन कोशिकाओं की आवाजाही को अनुरेखण करते हुए अंतराल आकार और समय के साथ बंद होने की अपनी दर को मापने कर सकते हैं आक्रामक सामने । इसलिए, सेल प्रवास की निगरानी करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग के कार्यांवयन केवल सेल प्रवास के बेहतर दृश्य प्रदान नहीं करेगा, लेकिन यह भी संभावना सेल प्रवास और सेल प्रसार के बीच अंतर करने के लिए अनुमति देगा, इस प्रकार एक और अधिक प्रदान सेल माइग्रेशन का विश्वसनीय विश्लेषण ।
इस अध्ययन में, MCF10A स्तन उपकला कोशिकाओं घाव चिकित्सा परख और लाइव सेल इमेजिंग के संयोजन के लिए सेल माइग्रेशन में TIP60 की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया । MCF10A कोशिकाओं में वृद्धि हुई माइग्रेशन क्षमताओं में TIP60 परिणाम की कमी.
Protocol
Representative Results
Discussion
यह ज्ञात है कि कक्ष माइग्रेशन की प्रक्रिया में, कक्ष या तो अनुयाई पत्रकों के रूप में ले जा सकते हैं; ढीले समूहों; या एकल, पृथक कक्ष । मोड और सेल आक्रमण के गतिशील एक शर्त से दूसरे में भिंन हो सकते हैं, और phenotype ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनके सहायक चर्चा और टिप्पणियों के लिए झा प्रयोगशाला के सदस्यों को धंयवाद । sj राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन सिंगापुर से अनुदान द्वारा समर्थित और सिंगापुर के कैंसर विज्ञान संस्थान (आर-713-006-014-271) को उत्कृष्टता पहल के अपने अनुसंधान केन्द्रों के तहत शिक्षा मंत्रालय, राष्ट्रीय चिकित्सा अनुसंधान परिषद् (CBRG-काटकर; BNIG11nov001 और सीएस-IRG; आर-713-000-162-511), शिक्षा मंत्रालय के अकादमिक अनुसंधान कोष (मो AcRF टीयर 1 T1-2012 Oct-04) । Y.Z., G.S.C., और C.Y.T. एक के बाद स्नातक सिंगापुर के कैंसर विज्ञान संस्थान, राष्ट्रीय सिंगापुर विश्वविद्यालय द्वारा संमानित फैलोशिप द्वारा समर्थित थे ।
Materials
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
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