Live-imaging av brystet Epithelial celle migrasjon etter forbigående uttømming av TIP60
Summary
Her presenterer vi sanntids overvåking av celle migrasjon i en sårhelende analysen ved hjelp av TIP60-utarmet MCF10A bryst epitelceller. Implementeringen av live-celle Bildeteknikker i våre protokollen tillater oss å analysere og visualisere encellede bevegelse i sanntid og over tid.
Abstract
Sårhelende analysen er effektiv og en av de rimeligste måtene å studere celle migrasjon i vitro. Konvensjonelt, bilder er tatt på begynnelsen og slutten av et eksperiment med en kontrast mikroskopet og migrasjon evnene til celler evalueres etter nedleggelsen av sår. Men cellen bevegelsen er et dynamisk fenomen, og en tradisjonell metoden tillater ikke spore encellede bevegelse. For å forbedre gjeldende sårhelende analyser, bruker vi live-celle Bildeteknikker overvåke celle migrasjon i sanntid. Denne metoden tillater oss å bestemme celle migrasjon prisen basert på en celle sporingssystem og gir et klarere skille mellom celle migrasjon og celle spredning. Her viser vi bruk av live-celle imaging i sårhelende analyser å studere ulike migrasjon evnene til brystet epitelceller påvirket av tilstedeværelsen av TIP60. Cellen motilitet er svært dynamisk, gir vår metode mer innsikt i prosessene av sårheling enn et statisk utvalg av såret nedleggelse tatt med samme tradisjonelle imaging teknikker for sårhelende analyser.
Introduction
HIV-Tat-interaktiv protein 60 kDa (TIP60) er en lysine acetyltransferase som kan acetylate både histone og ikke-histone proteiner1,2. Funksjonene er funnet for å ha konsekvenser i flere signalveier, inkludert transkripsjon, DNA-skade reparasjon og apoptose1,3,4,5,6, 7 , 8. videre TIP60 er ofte downregulated i kreft, og dens downregulation er korrelert med kreft metastasering og dårlig overlevelse priser9,10,11,12, 13,14. Svulst metastasering er den viktigste årsaken til kreft-relaterte dødsfall. Det er en prosess med flere trinn, og det første trinnet av metastasering innebærer overføring og invasjonen av tumorceller i tilstøtende vev15,16. For å gjøre dette, kreftceller først må koble fra primære svulst massen, enten i form av et kollektivt invaderende celle ark eller som frittstående enkeltceller17. Under denne prosessen gjennomgår kreftceller ofte epithelial mesenchymal overgang (EMT), som resulterer i endringer i morfologi og celle vedheft evne17,18.
Noen teknikker er utviklet for å studere overføringen og invasjonen evne til tumor celler i vitro. Blant dem er sår-tilheling analysen mest effektiv og økonomisk19. Først innebærer denne metoden etableringen av en kunstig gapet på en confluent monolayer av celler, slik at cellene å migrere og lukke gapet. Andre kan bilder av hullene hentes på begynnelsen og slutten av eksperimentet. Til slutt brukes en sammenligning av gapet nedleggelse til å bestemme frekvensen av celle migrasjon. Kontrast mikroskop brukes vanligvis til å ta bilder for konvensjonelle sårhelende analyser. En annen fordel med sårhelende analysen er at det delvis ligner i vivo svulst celle migrasjon. Tilsvarende viser i vivo svulst metastasering, celle migrasjon i sårhelende analyser både kollektiv migrasjon epithelial ark og migrering av frittstående enkeltceller.
Imidlertid celle migrasjon er kjent for å være dynamisk, og det er behov for å dokumentere bevegelsen av celler i sanntid. Eksempelvis tillater ikke en konvensjonell sårhelende analysen forsker analysere encellede bevegelse. På den annen side, er celler kultivert for sårhelende analyser ofte serum-sultet å hemme celle spredning. Dette gjøres for å utelukke av gapet nedleggelse på grunn av celle spredning. Likevel vil det fortsatt være noen spredning og celledød, og fase kontrast bilder tatt før og etter eksperimentet ikke klarer å skille mellom dem.
Live-celle tenkelig teknikken løser denne begrensningen av konvensjonelle sårhelende analyser. Bruke live-imaging mikroskop kombinert med CO2 inkubator og riktig temperaturkontroll, forskere kan måle gapet størrelsen og dens rate av nedleggelse over tid mens sporing bevegelsen aktivt overføre celler ligger på tips av den invasiv foran. Derfor implementeringen av live-celle for å overvåke celle migrasjon vil ikke bare gi bedre visualisering av celle migrasjon, men vil også ha muligheten til å skille mellom celle migrasjon og celle spredning, noe som gir en mer pålitelig analyse av celle migrasjon.
I denne studien ble MCF10A bryst epitelceller brukt til å vise en kombinasjon av sårhelende analysen og live-celle for å studere rollen til TIP60 i celle migrasjon. Uttømming av TIP60 resulterer i økt migrasjon evner i MCF10A celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er kjent at under celle migrasjon, celler kan enten flytte i form av tilhenger arkene. løs klynger; eller enkelt, isolerte celler. Modus og dynamisk celle invasjon kan variere fra én tilstand til en annen, og fenotypen kan endre innen timer. Tradisjonelle sårhelende analysen er basert på øyeblikksbilde bilder fra et mikroskop med en lang tidsintervall, for eksempel 12 eller 24 timer. Dette gjør det vanskelig å fange dynamiske sår nedleggelsen og mønster av cellen bevegelser.
På d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmene av Jha laboratorium for sine nyttig diskusjon og kommentarer. S.J. ble støttet av tilskudd fra National Research Foundation Singapore og Singapore utdanningsdepartementet under sin forskning sentre for fremragende initiativ til den kreft Science Institute i Singapore (R-713-006-014-271), den nasjonale medisinsk Research Council (CBRG-NIG; BNIG11nov001 og CS-IRG; R-713-000-162-511), utdannings akademisk forskning fondet (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 oktober-04). Y.Z., G.S.C. og C.Y.T. ble støttet av en post graduate fellowship tildelt av kreft Science Institute i Singapore, til National University of Singapore.
Materials
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53. J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).
- Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).
- Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. Cellular functions of TIP60. Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).
- Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT. Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).
- Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity. Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).
- Sykes, S. M., et al. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction. Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).
- Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis. Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).
- Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival. J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).
- Gorrini, C., et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response. Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).
- Jha, S., et al. Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway. Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).
- Kim, J. H., et al. Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes. Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).
- Sakuraba, K., et al. Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer. Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).
- Subbaiah, V. K., et al. E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60. Oncogene. , (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Zhang, Y., et al. TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program. J Mol Cell Biol. , (2016).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
