Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

TIP60 के क्षणिक कमी के बाद स्तन उपकला कोशिका प्रवास के लाइव इमेजिंग

Published: December 7, 2017 doi: 10.3791/56248
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Cancer Science Institute of Singapore, National University of Singapore, 2Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

Summary

यहां, हम TIP60-घट MCF10A स्तन उपकला कोशिकाओं का उपयोग कर एक घाव भरने परख में सेल प्रवास के वास्तविक समय निगरानी प्रस्तुत करते हैं । हमारे प्रोटोकॉल में रहते सेल इमेजिंग तकनीक के कार्यांवयन हमें विश्लेषण और वास्तविक समय में और समय के पार एकल सेल आंदोलन कल्पना करने के लिए अनुमति देता है ।

Abstract

घाव-हीलिंग परख कुशल और सबसे किफायती तरीके से इन विट्रो मेंसेल प्रवास के अध्ययन में से एक है । पारंपरिक रूप से, छवियां शुरुआत और एक चरण के विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक प्रयोग के अंत में ले रहे हैं, और कोशिकाओं के प्रवास क्षमताओं घावों के बंद द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं । हालांकि, सेल आंदोलन एक गतिशील घटना है, और एक पारंपरिक विधि एकल सेल आंदोलन पर नज़र रखने के लिए अनुमति नहीं है । वर्तमान घाव-हीलिंग परख में सुधार करने के लिए, हम लाइव सेल इमेजिंग तकनीक का उपयोग करने के लिए वास्तविक समय में सेल प्रवास की निगरानी । इस विधि हमें सेल माइग्रेशन दर एक सेल ट्रैकिंग प्रणाली के आधार पर निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है और सेल प्रवास और सेल प्रसार के बीच एक स्पष्ट अंतर प्रदान करता है । यहां, हम TIP60 की उपस्थिति से प्रभावित स्तन उपकला कोशिकाओं के विभिन्न प्रवास क्षमताओं का अध्ययन करने के लिए घाव-चिकित्सा परख में रहते सेल इमेजिंग के उपयोग का प्रदर्शन. के रूप में सेल गतिशीलता अत्यधिक गतिशील है, हमारी विधि घाव भरने की प्रक्रिया में और अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है घायल उपचार पारंपरिक इमेजिंग घाव चिकित्सा परख के लिए इस्तेमाल तकनीक के साथ लिया बंद का एक स्नैपशॉट से ।

Introduction

एचआईवी-जैसे-इंटरैक्टिव प्रोटीन ६० केडीए (TIP60) एक lysine acetyltransferase है जो citrullinated और नॉन-citrullinated प्रोटीन्स1,2को acetylate कर सकता है । अपने कार्यों के लिए प्रतिलेखन, डीएनए क्षति की मरंमत सहित कई संकेत मार्ग, में निहितार्थ है पाया, और apoptosis1,3,4,5,6, 7 , 8. इसके अलावा, TIP60 अक्सर कैंसर में downregulated है, और इसके downregulation के साथ संबंधित है cancer मेटास्टेसिस और गरीब जीवित रहने की दर9,10,11,12, 13,14. ट्यूमर मेटास्टेसिस कैंसर से संबंधित मौत का प्रमुख कारण है । यह एक बहु कदम प्रक्रिया है, और मेटास्टेसिस के प्रारंभिक चरण में आसन्न ऊतकों में ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवास और आक्रमण शामिल है15,16. आदेश में ऐसा करने के लिए, ट्यूमर कोशिकाओं को पहले प्राथमिक ट्यूमर द्रव्यमान से अलग करना चाहिए, या तो सामूहिक रूप से एक सेल शीट के रूप में या अलग एकल कोशिकाओं के रूप में17। इस प्रक्रिया के दौरान, ट्यूमर कोशिकाओं को अक्सर उपकला mesenchymal संक्रमण (EMT), आकृति विज्ञान और सेल आसंजन क्षमता17,18में परिवर्तन में जिसके परिणामस्वरूप से गुजरना ।

कुछ तकनीकों के लिए प्रवास और इन विट्रो मेंट्यूमर कोशिकाओं के आक्रमण की क्षमता का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है । उनमें से, घाव हीलिंग परख सबसे कुशल और किफायती19है । सबसे पहले, इस विधि कोशिकाओं की एक धाराप्रवाह monolayer पर एक कृत्रिम अंतराल के निर्माण, इस प्रकार कोशिकाओं को स्थानांतरित करने और अंतर को बंद करने की अनुमति शामिल है । दूसरा, अंतराल की छवियाँ शुरुआत और प्रयोग के अंत में कब्जा कर लिया जा सकता है. अंत में, अंतर बंद करने की तुलना सेल माइग्रेशन की दर निर्धारित करने के लिए किया जाता है । एक चरण के विपरीत माइक्रोस्कोप आमतौर पर पारंपरिक घाव उपचार परख के लिए छवियों पर कब्जा करने के लिए प्रयोग किया जाता है । घाव भरने की परख का एक और लाभ यह है कि यह आंशिक रूप से vivo ट्यूमर सेल प्रवास में जैसा दिखता है । इसी तरह vivo में ट्यूमर मेटास्टेसिस, सेल माइग्रेशन घाव-हीलिंग परख में उपकला चादरें और अलग एकल कोशिकाओं के प्रवास के दोनों सामूहिक प्रवास से पता चलता है.

हालांकि, सेल माइग्रेशन गतिशील होने के लिए जाना जाता है, और वास्तविक समय में कोशिकाओं के आंदोलन दस्तावेज़ के लिए एक की जरूरत है । उदाहरण के लिए, एक पारंपरिक घाव-चिकित्सा परख एक शोधकर्ता को एकल सेल आंदोलन का विश्लेषण करने की अनुमति नहीं है । दूसरी ओर, घाव चिकित्सा परख के लिए प्रसंस्कृत कोशिकाओं अक्सर सीरम-कोशिका प्रसार को बाधित भूखे हैं । इस सेल प्रसार के कारण अंतर बंद करने की संभावना को शासन करने के लिए किया जाता है । बहरहाल, वहां अभी भी कुछ प्रसार और कोशिका मृत्यु हो, और चरण इसके विपरीत पहले और प्रयोग के बाद छवियों के लिए उन दोनों के बीच अंतर करने में असमर्थ रहे है हो जाएगा ।

लाइव सेल इमेजिंग तकनीक पारंपरिक घाव उपचार परख की इस सीमा के पते । एक सह2 मशीन और उचित तापमान नियंत्रण के साथ संयुक्त एक जीवित इमेजिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, शोधकर्ताओं के सुझावों पर स्थित सक्रिय रूप से पलायन कोशिकाओं की आवाजाही को अनुरेखण करते हुए अंतराल आकार और समय के साथ बंद होने की अपनी दर को मापने कर सकते हैं आक्रामक सामने । इसलिए, सेल प्रवास की निगरानी करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग के कार्यांवयन केवल सेल प्रवास के बेहतर दृश्य प्रदान नहीं करेगा, लेकिन यह भी संभावना सेल प्रवास और सेल प्रसार के बीच अंतर करने के लिए अनुमति देगा, इस प्रकार एक और अधिक प्रदान सेल माइग्रेशन का विश्वसनीय विश्लेषण ।

इस अध्ययन में, MCF10A स्तन उपकला कोशिकाओं घाव चिकित्सा परख और लाइव सेल इमेजिंग के संयोजन के लिए सेल माइग्रेशन में TIP60 की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया । MCF10A कोशिकाओं में वृद्धि हुई माइग्रेशन क्षमताओं में TIP60 परिणाम की कमी.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. तैयारी

  1. MCF10A कल्चर मीडियम तैयार करें: Dulbecco के संशोधित ईगल मीडियम (DMEM)/F12 (1:1) के साथ 5% हार्स सीरम, 20 एनजी/एमएल उपकला वृद्धि कारक, ०.५ मिलीग्राम/एमएल hydrocortisone, १०० एनजी/एमएल हैजा विष, और 10 µ जी/एमएल इंसुलिन ।
  2. तैयार सीरम मुक्त मध्यम: DMEM/F12 (1:1) के साथ 20 एनजी/एमएल उपकला वृद्धि कारक, ०.५ मिलीग्राम/एमएल hydrocortisone, १०० एनजी/एमएल हैजा विष, और 10 µ जी/एमएल इंसुलिन ।
  3. निंन सिरना अनुक्रम का उपयोग करें:
    siControl:
    फॉरवर्ड: ५ '-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-३ '
    रिवर्स: 5 '-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3 '
    siTIP60:
    फॉरवर्ड: ५ '-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-३ '
    रिवर्स: 5 '-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3 '
  4. 10 सेमी सेल संस्कृति व्यंजन और 24 अच्छी तरह से प्लेट का प्रयोग करें ।

2. सिरना का उपयोग TIP60 के क्षणिक कमी

  1. 1 दिन पर, aliquot 15 µ एल के अभिकर्मक रिएजेंट (जैसे, Lipofectamine RNAiMAX) और कम सीरम मध्यम (जैसे, Opti-मेम) के 2 मिलीलीटर और उंहें प्रत्येक µ के 10 सिरना एल के साथ मिश्रण (10 µ एम स्टॉक), क्रमशः ।
  2. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण की मशीन ।
  3. बीज 1 x 106 MCF10A कोशिकाओं एक साथ एक 10 सेमी डिश में संस्कृति माध्यम के 3 मिलीलीटर के साथ । किसी hemocytometer का उपयोग करके कक्षों की गणना करना.
  4. 10 सेमी डिश के लिए ड्रॉप द्वारा सिरना मिश्रण ड्रॉप जोड़ें ।
  5. यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को समान रूप से ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में डालने से पहले वितरित कर रहे है डिश शेक ।
  6. मशीन के 6 एच के बाद, ताजा संस्कृति माध्यम के 8 मिलीलीटर के साथ सिरना-युक्त माध्यम की जगह ।
  7. 2 दिन पर, सिरना मिश्रण का एक और बैच तैयार है और उंहें 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
  8. संस्कृति माध्यम के 8 मिलीलीटर बाहर महाप्राण 1 दिन पर जोड़ा गया है और यह ताजा संस्कृति माध्यम के 3 मिलीलीटर के साथ बदलें ।
  9. सिरना मिश्रण के दूसरे बैच के पकवान बूंद से ड्रॉप करने के लिए जोड़ें । यह सुनिश्चित करने के लिए कि रिएजेंट पूरी तरह से उंहें मशीन में डालने से पहले मिश्रित कर रहे है व्यंजन शेक ।
  10. 6 घंटे के बाद, सिरना-युक्त मध्यम ताजा संस्कृति माध्यम के 8 मिलीलीटर के साथ बदलें ।

3. घाव भरने की परख के लिए बीज कोशिकाओं

  1. 3 दिन पर, मध्यम त्यागें और एक बार फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) बफर के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने । पंजाबियों बफर छोड़ो ।
  2. Trypsinize प्लेट के लिए 1x trypsin-EDTA बफर की 1 मिलीलीटर जोड़कर siControl और siTIP60-उपचारित कोशिकाओं को बाहर निकाले । यह 20 मिनट के लिए मशीन में वापस रखो ।
  3. प्रत्येक प्लेट के लिए पूरा संस्कृति माध्यम के 4 मिलीलीटर जोड़ें, pipetting द्वारा कोशिकाओं reसस्पेंड, और एक 15 एमएल ट्यूब करने के लिए उन्हें हस्तांतरण ।
  4. 5 मिनट के लिए २०० जी पर केंद्रापसारक और supernatant हटा दें ।
  5. सीरम मुक्त माध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित और एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना ।
  6. siControl और siTIP60 दोनों के लिए 6 x 105 कोशिकाओं/एमएल का एक सेल सस्पेंशन तैयार करें; सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं । १००% प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए एक 24-अच्छी तरह से प्लेट की अच्छी तरह से एक के लिए सेल निलंबन के ५०० µ एल जोड़ें । बीज 5 से 6 कुओं प्रत्येक के लिए siControl और siTIP60 ।
  7. धीरे से थाली हिला आगे पीछे और फिर पक्ष को भी वितरण सुनिश्चित करने के पक्ष । एक परिपत्र गति से बचें । 24 घंटे के लिए मशीन में थाली छोड़ दो ।
  8. शेष कोशिकाओं फसल TIP60 की पछाड़ना दक्षता की जांच करने के लिए । ऐसा करने के लिए, शेष सेल निलंबन २०० g पर 5 मिनट के लिए और supernatant निकालें ।
  9. एक वाणिज्यिक एजेंट का उपयोग कर आरएनए अलग, निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन, और पछाड़ना दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर के लिए आगे बढ़ें.

4. घाव पैदा

  1. एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के तहत जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को पूरी तरह से जुड़े रहे हैं । कोशिकाओं के एक धाराप्रवाह monolayer कोशिकाओं का गठन किया है कि पूरी तरह से संलग्न कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप (4x, 10x, और 20X आवर्धन) के तहत कक्षों का निरीक्षण करें ।
    नोट: siControl कक्ष आमतौर पर siTIP60 कक्षों से बेहतर अनुलग्न करते हैं । यह उंमीद है क्योंकि TIP60 की कमी कोशिकाओं को और अधिक mesenchymal-20की तरह बनाता है । यहां, एक सामांय benchtop सफेद प्रकाश चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का प्रयोग किया जाता है ।
  2. घाव उत्पन्न करने के लिए, धीरे से एक २०० µ एल पिपेट टिप के साथ अच्छी तरह से केंद्र भर में एक सीधी रेखा खरोंच; उत्पन्न घाव की लंबाई अच्छी तरह से व्यास के रूप में एक ही है । शेष सभी कुओं के लिए यह चरण दोहराएँ. एक नए पिपेट टिप के लिए एक अच्छी तरह का प्रयोग करें ।
  3. धीरे से एक अच्छी तरह से 5 बार सीरम मुक्त माध्यम का उपयोग करने के लिए अलग कोशिकाओं को दूर धोने ।
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से सीरम मुक्त माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें और सेल इमेजिंग जीने के लिए आगे बढ़ना ।

5. लाइव सेल इमेजिंग का सेटअप

  1. कक्ष में तापमान ३७ डिग्री सेल्सियस तक पहुँच सुनिश्चित करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग की स्थापना करने से पहले माइक्रोस्कोप और तापमान नियंत्रण पर न्यूनतम 1 एच पर बारी.
  2. लाइव सेल इमेजिंग शुरू करने से पहले कार्बन डाइऑक्साइड (CO2) गैस की आपूर्ति चालू करें । 5% के लिए सह2 एकाग्रता निर्धारित करें ।
  3. माइक्रोस्कोप के मंच पर 24-वेल प्लेट रखें और इमेजिंग के लिए 10x आवर्धन के साथ उद्देश्य लेंस का चयन करें । eyepieces के बजाय कैमरे के लिए उत्सर्जित प्रकाश प्रत्यक्ष और घाव और इसके चारों ओर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए ध्यान समायोजित करें ।
    नोट: इस मामले में, चरण कंट्रास्ट के साथ सफ़ेद प्रकाश का उपयोग किया गया था ।
  4. एक जीवित सेल पर्यवेक्षक प्रणाली का प्रयोग एक अच्छी तरह से घाव की स्थिति को चिह्नित करने के लिए ।
    नोट: लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम की स्वचालित अवस्था अनेक स्थानों पर छवि प्राप्ति के लिए अनुमति देती है. छवियां हर चिह्नित स्थिति में एक बार हर अंतराल पर ले रहे हैं ।
  5. समय स्थिति सेट करें: 1 h अंतराल और ७२ h अवधि; इस सेटिंग के अनुसार, सिस्टम प्रत्येक चिह्नित स्थान पर तस्वीरें ले जाएगा ७२ घंटे के लिए हर घंटे की निगरानी के लिए किसी भी वांछित समय अंतराल और अवधि निर्धारित करें ।
    नोट: यहां, ७२ ज की अवधि सबसे अच्छा है क्योंकि इन कोशिकाओं को सीरम मुक्त माध्यम में ७२ एच के बाद मर शुरू करते हैं ।

6. ट्रैकिंग एकल सेल आंदोलन

  1. डेटा निर्यात करें ७२ h. के बाद डेटा दोनों JPEG प्रारूप में छवियों के रूप में और AVI प्रारूप में वीडियो के रूप में निर्यात ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है क्योंकि ImageJ सॉफ्टवेयर केवल AVI प्रारूप में वीडियो पहचान कर सकते हैं । siTIP60 और siControl कक्षों के बीच विभिंन कक्ष माइग्रेशन गति को वीडियो में स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है ।
  2. ImageJ सॉफ्टवेयर में AVI वीडियो खोलें ।
  3. MTrackJ प्लगइन खोलें (प्लगइन डाउनलोड और अलग से स्थापित किया जाना चाहिए): प्लगइंस > MTrackJ ।
  4. MtrackJ टूलबार में "add" टैब पर क्लिक करके वीडियो से चुने गए एकल कक्षों के लिए एक ट्रैक जोड़ें । इनवेसिव मोर्चे की नोक पर एक सेल चुनें और एक सेल है कि अपने दम पर (एकल सेल प्रवास) माइग्रेट कर सकते हैं । वीडियो पर चुना कोशिकाओं के आंदोलन का पालन करें और MtrackJ का उपयोग कर उन्हें ट्रेस.
  5. उपकरण पट्टी पर "माप" टैब पर क्लिक करके आंदोलन की दूरी को मापने ।
    नोट: यहाँ, siControl में लगभग कोई कक्ष एकल कक्षों के रूप में चले गए, यह एकल-कक्ष आंदोलन को मापने के लिए कठिन बना, जबकि siTIP60 कक्षों के कई एकल कक्षों के रूप में चले गए. हालांकि, आक्रामक मोर्चे पर स्थित कोशिकाओं की आवाजाही अभी भी पता लगाया जा सकता है और दोनों siControl और siTIP60 कोशिकाओं में की गणना ।
  6. AVI प्रारूप में पटरियों के साथ वीडियो सहेजें ।

7. सेल माइग्रेशन क्षमता का ठहराव

  1. ठहराव के लिए, 0 पर छवियों का चयन करें एच और छवियों पर "n" एच, जहां "n" timepoint को संदर्भित करता है जब या तो siTIP60 या siControl कोशिकाओं को पूरी तरह से घाव बंद कर दिया है ।
    नोट: यहाँ, ४८ ज चुना गया था, के रूप में siTIP60 कोशिकाओं में घाव लगभग पूरी तरह से बंद कर दिया गया.
  2. प्रतिशत माइग्रेशन निंन सूत्र का उपयोग कर ImageJ का उपयोग कर रहा है: (0 एच पर घाव के क्षेत्र में घाव के क्षेत्र "n" h)/0 h x १०० पर घाव के क्षेत्र ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

जनरल स्कीमा के लाइव सेल इमेजिंग-सेल माइग्रेशन परख आधारित
चित्र 1a इस प्रोटोकॉल का स्कीमा है । siControl के साथ transfected MCF10A कोशिकाओं ठेठ उपकला आकृति विज्ञान दिखाया. TIP60 की कमी के बाद, MCF10A कोशिकाओं को नियंत्रण कोशिकाओं (चित्र 1b) की तुलना में अधिक mesenchymal थे.

TIP60 पछाड़ना दक्षता की परीक्षा
चित्रा 2 TIP60 पछाड़ना दक्षता से पता चलता है. siTIP60 उपचार के बाद TIP60 अभिव्यक्ति स्तर में काफी कमी आई । TIP60 के अलावा कई सेल प्रवास से संबंधित प्रोटीन के भाव भी20की जांच की गई । उदाहरण के लिए, उपकला आसंजन अणु की अभिव्यक्ति (EpCAM), जो एक उपकला मार्कर है, कमी आई थी, जबकि Fibronectin के भाव (FN1) और SNAIL2 (SNAI2), जो दोनों EMT ड्राइवरों हैं, पर बढ़ गया TIP60 की घट. इन आंकड़ों का सुझाव है कि MCF10A कोशिकाओं में लाइव सेल इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया TIP60 स्तर पर्याप्त रूप से कम थे ।

TIP60 की कमी से सेल माइग्रेशन का डायनेमिक बदलता है
चित्रा 3 siControl और siTIP60 कोशिकाओं के लिए लिया वीडियो से पता चलता है. वीडियो स्पष्ट रूप से siControl की तुलना में siTIP60 की एक तेजी से सेल प्रवास दिखा । इसके अलावा, siControl और siTIP60 कोशिकाओं के बीच सेल प्रवास के गतिशील में एक अंतर यह भी देखा गया था (यानी, siControl कोशिकाओं को एक पत्रक के रूप में चले गए, जबकि अधिक एकल सेल आंदोलन siTIP60 कोशिकाओं में मनाया गया था) ।

TIP60 पछाड़ना के बाद सेल माइग्रेशन में वृद्धि
आरेख 4 siControl और siTIP60 कक्षों के लिए कक्ष माइग्रेशन का ठहराव दिखाता है । TIP60 की कमी के बाद माइग्रेट कक्षों का प्रतिशत काफी बढ़ गया.

TIP60 घट सेल माइग्रेशन का पैटर्न बदलता है
चित्रा 5 एकल सेल आंदोलन ट्रैकिंग वीडियो से पता चलता है. अधिकांश siControl कक्षों ने सामूहिक रूप से कक्ष पत्रकों के भाग के रूप में माइग्रेट किए, और केवल दो कक्षों में एकल-कक्ष माइग्रेशन दिखाया, जबकि अधिकांश siTIP60 कक्षों में एकल-कक्ष माइग्रेशन दिखाई दिया. कक्ष माइग्रेशन के प्रतिमान में परिवर्तन इंगित करता है कि समाप्त TIP60 वाले कक्षों में एक अधिक mesenchymal phenotype है ।

Figure 1
चित्र 1: प्रायोगिक अवलोकन और प्रतिनिधि छवियां. (A) प्रोटोकॉल का स्कीमा । (B) siControl या siTIP60 के साथ transfected MCF10A कक्षों की प्रतिनिधि छवियां । MCF10A कोशिकाओं TIP60 की कमी के बाद एक अधिक mesenchymal आकृति विज्ञान दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: TIP60 कुशलतापूर्वक siTIP60 अभिकर्मक के बाद समाप्त किया गया था । TIP60, EpCAM, FN1, और SNAI2के व्यंजक स्तर की जांच करने के लिए रीयल-टाइम मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग किया गया था । कुल आरएनए अलग था विनिर्माण प्रोटोकॉल के बाद Trizol एजेंट का उपयोग कर । प्रत्येक नमूने की कुल आरएनए के 2 µ g को सीडीएनए बनाने के लिए उपयोग किया गया था. परिणाम गुना-परिवर्तन के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । Actin एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । त्रुटि पट्टी से कम 3 स्वतंत्र प्रयोगों से मानक विचलन इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: siControl और siTIP60 कोशिकाओं के लाइव सेल इमेजिंग वीडियो सेल आंदोलन के विभिन्न पैटर्न दिखाते हैं । समय अंतराल 1 h पर सेट किया गया था और अवधि ७२ h तक थी । वीडियो एक जीस जी सेल पर्यवेक्षक का उपयोग कर लिया गया था । कृपया इन वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
आरेख 4: कक्ष माइग्रेशन के प्रतिशत का ठहराव. (A) live-सेल इमेजिंग वीडियो से प्रतिनिधि छवियां प्राप्त की गईं । 0 एच और ४८ एच में लिया गया चित्र इस्तेमाल किया गया । (B) ४८ h के भीतर कक्ष माइग्रेशन के प्रतिशत का ठहराव निंन सूत्र का उपयोग करके ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर किया गया था: (0 एच पर घाव के क्षेत्र में "n" h)/0 h x १०० पर घाव के क्षेत्र/ त्रुटि पट् टी कम से तीन स्वतंत्र प्रयोगों से मानक विचलन को इंगित करती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: लाइव सेल इमेजिंग वीडियो एकल सेल आंदोलन की ट्रैकिंग दिखाएँ. रंगीन लाइनें प्रत्येक चयनित पृथक एकल कक्ष के प्रवासी ट्रैक दिखाते हैं । कृपया इन वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह ज्ञात है कि कक्ष माइग्रेशन की प्रक्रिया में, कक्ष या तो अनुयाई पत्रकों के रूप में ले जा सकते हैं; ढीले समूहों; या एकल, पृथक कक्ष । मोड और सेल आक्रमण के गतिशील एक शर्त से दूसरे में भिंन हो सकते हैं, और phenotype घंटे के भीतर बदल सकते हैं । पारंपरिक घाव हीलिंग परख एक लंबे समय के अंतराल के साथ एक खुर्दबीन से लिया स्नैपशॉट चित्र पर आधारित है, जैसे 12 या 24 एच । यह यह मुश्किल घाव बंद करने के गतिशील और सेल आंदोलनों के पैटर्न पर कब्जा करने के लिए बनाता है ।

दूसरी ओर, लाइव सेल इमेजिंग सिस्टम एक बहुत छोटे अंतराल (30 मिनट या 1 एच) पर और सटीक एक ही स्थिति है, जो मैन्युअल रूप से लिया छवियों के लिए संभव नहीं है पर सेल प्रवास की निगरानी । सिस्टम स्वचालित है, और शोधकर्ताओं को केवल प्रयोगों के अंत में डेटा निर्यात करने की आवश्यकता है । यह सेल आंदोलन के पैटर्न और वास्तविक समय में घाव बंद करने की प्रक्रिया पर नजर रखने के लिए संभव बनाता है । इस अध्ययन में, एक मात्रात्मक रहते-घाव भरने की परख में सेल इमेजिंग प्रणाली के शामिल गतिशील कोशिका आंदोलन के कब्जा के लिए अनुमति देता है, साथ ही नियंत्रण या TIP60-घट कोशिकाओं में घाव बंद करने की प्रक्रिया । एक लाइव सेल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर लिया वीडियो से, siControl कोशिकाओं के अधिकांश एक अनुयाई शीट के रूप में चले गए, जबकि TIP60-समाप्त कोशिकाओं अलग एकल कोशिकाओं के रूप में चले गए (चित्रा 3 और चित्रा 5).

कोशिका प्रसार और कोशिका मृत्यु एक घाव भरने परख में सेल प्रवास के अध्ययन जटिल हो सकता है । इसलिए, घाव भरने परख सीरम मुक्त माध्यम में किया जाता है सेल प्रसार के प्रभाव को कम करने के लिए । इसके अलावा, TIP60 के पछाड़ना सेल अस्तित्व पर इसके प्रभाव को कम करने के लिए अनुकूलित किया गया था । हालांकि, यह कोशिका प्रसार और घाव चिकित्सा परख में कोशिका मौत के प्रभाव को खत्म करने के लिए असंभव है । स्नैपशॉट केवल एक निश्चित समय बिंदु पर घाव बंद करने को कैप्चर कर सकते हैं, यह अलग करने के लिए असंभव है कि क्या घाव बंद होने सेल माइग्रेशन या सेल प्रसार के कारण था । लाइव सेल इमेजिंग सेल प्रवास की गतिशीलता पर नज़र रखता है और व्यक्तिगत सेल आंदोलन को ट्रैक करता है, यह शोधकर्ताओं सेल प्रसार और कोशिका मौत से सेल प्रवास भेद करने के लिए संभव बना रही है । इस अध्ययन में, एकल-सेल ट्रैकिंग siTIP60 हालत में अलग एकल कोशिकाओं के प्रवास पथ से पता चला है, जबकि siControl कोशिकाओं ज्यादातर चादरें के रूप में चले गए । लाइव सेल इमेजिंग प्रणाली भी सामूहिक सेल प्रवास (यानी, कोशिकाओं में एक एकजुट समूह के रूप में चले गए) siTIP60 कोशिकाओं में siControl कोशिकाओं की तुलना में वृद्धि पर कब्जा कर लिया । वीडियो से, MCF10A siTIP60 अधिक एकल सेल आंदोलनों और siControl (चित्रा 5) की तुलना में उपकला सेल शीट के तेजी से प्रवास दिखाया.

इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल विभिंन मापदंडों प्रयोगात्मक विफलता से बचने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है । सबसे पहले, क्षणिक अभिकर्मक के बाद कोशिका मौतों की संख्या सेल माइग्रेशन पर प्रभाव को कम करने के लिए 10% से कम होना चाहिए । इस मामले में, TIP60 की कमी सेल अस्तित्व को कम कर सकते हैं; इसलिए, शोधकर्ताओं इस संभावित phenotype के बारे में पता होना चाहिए, क्योंकि यह सेल प्रवास जटिल हो सकता है । इस समस्या से बचने के लिए, शोधकर्ताओं को अपने लक्ष्य जीन चूस करने के लिए इस्तेमाल किया सिरना की कोशिका संख्या और राशि का अनुकूलन करना चाहिए. MCF10A के लिए, 20 एनएम siTIP60 के साथ 1 x 106 कोशिकाओं को इस अध्ययन में अनुकूलित शर्त थी । दूसरा, MCF10A कोशिकाओं अक्सर संकुल और गिनती के लिए मुश्किल हैं । कक्ष गणना में त्रुटियाँ विभिन्न स्थितियों में प्रारंभिक कक्ष संख्याओं में एक महत्वपूर्ण अंतर को जन्म दे सकती हैं, और यह घाव-चिकित्सा परख में एक विस्थापित चर हो सकता है. इस समस्या से बचने के लिए trypsinize MCF10A कोशिकाओं को कम से 20 मिनट के लिए । पूरा विकास मध्यम जोड़ें trypsinization को रोकने के लिए और ऊपर और नीचे के झुरमुट को फैलाने के लिए 20 बार pipetting द्वारा मिश्रण और गिनती करने के लिए आसान बनाने के लिए । तीसरा, कोशिकाओं को आम तौर पर अच्छी तरह से 24 के लिए वरीयता प्राप्त थाली के बाद के केंद्र में हैं । एक भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए सीडिंग के बाद कोशिकाओं को फिर से निलंबित. इस मशीन में डालने से पहले थाली आगे और पीछे और पक्ष को हिला । चौथा, TIP60 की कमी सेल अधिक mesenchymal और इस तरह संलग्न करने के लिए कठिन बनाता है । यदि ऐसा होता है, समय की एक लंबी अवधि के लिए मशीन में थाली छोड़ दें । 24 ज के बाद, कोशिकाओं को आम तौर पर संलग्न हैं । कोशिकाओं को अभी भी ठीक से संलग्न नहीं हैं, तो शोधकर्ताओं सेल सीडिंग के लिए पूर्ण विकास माध्यम का उपयोग करें और कोशिकाओं को पूरी तरह से संलग्न कर रहे हैं जब यह सीरम मुक्त माध्यम से प्रतिस्थापित कर सकते हैं. इन कोशिकाओं को आमतौर पर पूर्ण माध्यम में 12 ज के बाद संलग्न हैं । पांचवां, घाव के किनारे चिकनी नहीं हो सकता है । चिकनी किनारों बनाने के लिए scratching की गति बढ़ाएं । छठा, घाव भी माइक्रोस्कोप के कैमरे के माध्यम से कल्पना करने के लिए बड़ा हो सकता है । घाव पैदा करने के लिए कम शक्ति के साथ २०० µ l पिपेट युक्तियों का प्रयोग करें । वैकल्पिक रूप से, एक सुई एक छोटे अंतर उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । सातवें, कुछ कोशिकाओं है कि खरोंच के दौरान अलग कर रहे है फिर से अपर्याप्त बहाकर के कारण घाव को संलग्न कर सकते हैं । पंजाबियों की बजाय सीरम मुक्त माध्यम के साथ कुओं को कम से 5 बार धोएं । आठवें, कोशिकाओं को कुछ धोने के बाद थाली से अलग करने के लिए शुरू कर सकते हैं । हालांकि, धोने की संख्या में समझौता नहीं किया जा सकता है ताकि यह सुनिश्चित करने के लिए कि अलग कोशिकाओं घाव करने के लिए फिर से अनुलग्न नहीं है । इस मामले में, शोधकर्ताओं ने कोशिकाओं को धीरे धो सकते है 3 बार और 1 ज की एक अधिकतम समय के लिए मशीन के अंदर थाली छोड़ दो कोशिकाओं को धोने के बाकी के लिए आगे बढ़ने से पहले बसने । नौवें, माइक्रोस्कोप ध्यान खो सकते हैं, और छवियों को आधे रास्ते प्रयोग के माध्यम से धुंधला हो सकता है । माइक्रोस्कोप के आसपास के तापमान में परिवर्तन का कारण हो सकता है, तापमान समायोजित चरण दूरी पर एक मामूली प्रभाव पड़ता है । शोधकर्ताओं ने प्रयोग शुरू करने के लिए सुनिश्चित करें कि मशीन की कोशिकाओं पर ध्यान समायोजित करने से पहले गर्म है पहले से कम 1 ज में माइक्रोस्कोप और तापमान नियंत्रण पर बारी चाहिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम उनके सहायक चर्चा और टिप्पणियों के लिए झा प्रयोगशाला के सदस्यों को धंयवाद । sj राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन सिंगापुर से अनुदान द्वारा समर्थित और सिंगापुर के कैंसर विज्ञान संस्थान (आर-713-006-014-271) को उत्कृष्टता पहल के अपने अनुसंधान केन्द्रों के तहत शिक्षा मंत्रालय, राष्ट्रीय चिकित्सा अनुसंधान परिषद् (CBRG-काटकर; BNIG11nov001 और सीएस-IRG; आर-713-000-162-511), शिक्षा मंत्रालय के अकादमिक अनुसंधान कोष (मो AcRF टीयर 1 T1-2012 Oct-04) । Y.Z., G.S.C., और C.Y.T. एक के बाद स्नातक सिंगापुर के कैंसर विज्ञान संस्थान, राष्ट्रीय सिंगापुर विश्वविद्यालय द्वारा संमानित फैलोशिप द्वारा समर्थित थे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MCF10A cell ATCC CRL-10317TM Breast epithelial cell
DMEM/F12 media (1:1) Gibco 11330-032 MCF10A culture media
Epithelial growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Supplements for MCF10A culture media
Cholera Toxin Sigma-Aldrich C-8052 Supplements for MCF10A culture media
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H-0888 Supplements for MCF10A culture media
Insulin Sigma-Aldrich I-1882 Supplements for MCF10A culture media
House serum Gibco 16050-122 Supplements for MCF10A culture media
Trypsin Gibco 25200-056 For MCF10A detach from plate
Hemacytometer Fisher Scientific 267110 For counting cell
Opti-MEM reduced serum media Gibco 31985-070 For siRNA mixture
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen/Life Technologies 56532 Transfect reagent
Trizol reagent Invitrogen/Life Technologies 15596-026 For mRNA extraction
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 170-8891 For cDNA generation
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5125 For real time qPCR
7500 Fast Real Time PCR system Biosystems Real time qPCR mechine
10-cm dish Greiner bio-one 664160 For Knockdown experiment
24-well plate Cellstar 662160 For wound healing assay
siControl siRNA Self designed Self designed CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT
siTIP60 siRNA Self designed Self designed UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT
Live cell observer Zeiss Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
  2. Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53. J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).
  3. Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).
  4. Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. Cellular functions of TIP60. Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).
  5. Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT. Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).
  6. Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity. Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).
  7. Sykes, S. M., et al. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction. Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).
  8. Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis. Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).
  9. Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival. J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).
  10. Gorrini, C., et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response. Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).
  11. Jha, S., et al. Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway. Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).
  12. Kim, J. H., et al. Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes. Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).
  13. Sakuraba, K., et al. Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer. Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).
  14. Subbaiah, V. K., et al. E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60. Oncogene. , (2015).
  15. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  16. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  17. Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).
  18. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).
  19. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
  20. Zhang, Y., et al. TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program. J Mol Cell Biol. , (2016).
  21. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
  22. Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).

Tags

कैंसर अनुसंधान अंक १३० लाइव सेल इमेजिंग सेल प्रवासन घाव हीलिंग TIP60 क्षणिक घट MCF10A
TIP60 के क्षणिक कमी के बाद स्तन उपकला कोशिका प्रवास के लाइव इमेजिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Chia, G. S., Tham, C. Y., … More

Zhang, Y., Chia, G. S., Tham, C. Y., Jha, S. Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60. J. Vis. Exp. (130), e56248, doi:10.3791/56248 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter