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Neuroscience

マウス胚性幹細胞の皮質介在ニューロン前駆細胞への分化

Published: December 3, 2017 doi: 10.3791/56358
Automatic Translation
1,2, 1
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

このプロトコルでは、変更された胚様体-単層法を用いたマウス胚性幹細胞から皮質介在ニューロン前駆細胞と後細胞分裂の介在ニューロン前駆体を生成するためのメソッドについて説明します。これらの前駆細胞/前駆体生体外で使用することができますまたは蛍光ソート運命決定を研究するため新生児大脳新皮質に移植や治療への応用で使用されます。

Abstract

Gaba 作動性皮質介在ニューロンは、興奮性錐体細胞の出力を調節するだけでなく、アンサンブル錐体細胞の出力を同期で重要な役割を果たす細胞の異種集団です。介在ニューロン機能の欠損は、さまざまな統合失調症、自閉症、てんかんなどの精神・神経疾患に関与しています。胚性幹細胞から皮質介在ニューロンの導出は、彼らの開発と機能の研究では、だけでなく、皮質介在関連疾患の発症分子メカニズムに洞察力を提供します。介在ニューロンはまた生き残るため、移行、および統合ホスト皮質回路移植後、細胞ベースの治療で使用するための理想的な候補者を作る顕著な能力を持っています。Nkx2.1 を表現する介在ニューロン前駆細胞とその子孫なマウス胚性幹細胞 (mESCs) からの派生にスケーラブルな非常に効率的な変更された胚様体-単層メソッドを紹介します。Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP デュアル レポーター mESC ラインを使用して、Nkx2.1 前駆細胞または彼らの Lhx6 を表現するポスト mitotic 子孫蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えを介して分離でき後でダウン ストリーム アプリケーションの数で使用します。我々 はまた運命決定の側面を研究するため、または使用するためサブグループ濃縮介在から寄与する治療への応用に役立つ可能性があります (SST) 介在のサブグループ、パルブアルブミン (PV) またはソマトスタチンの豊かにするメソッドを提供します。移植。

Introduction

マウスとヒトの両方でほぼすべて皮質抑制性介在ニューロン (CIns) の半分で内側の神経節隆起 (MGE) として知られている一時的な皮質下構造内で発信 CIns 他神経細胞とグリア細胞の上皮細胞内前駆細胞サブグループは、転写因子 Nkx2.11,2を表現します。CIn サブグループまたはサブタイプは、形態学的、神経化学的、電気生理学的の交差と接続特性3,4によって定義されます。MGE 派生 CIns に分けられます太陽光発電または SST、電気生理学的および接続の特定の傾向5どの相関式の表現に基づいて主に非重複のサブグループ。特に PV サブグループ、介在神経の機能不全は、複数神経疾患と疾患6,7に関与しています。このメソッドの全体的な目標は、幹細胞由来細胞分裂前駆細胞と太陽光発電または SST CIn の運命: 皮質介在ニューロンの生物学を勉強するため、細胞ベースの治療で使用するための濃縮渡り鳥の前駆体を生成することです。

Nkx2.1 表現する介在ニューロン前駆細胞とその子孫な mESCs からの派生のためのスケーラブルな非常に効率的な手法を提案します。Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP を使用してデュアル レポーター mESC 行8、Nkx2.1 前駆細胞、または彼らの Lhx6 を表現するポスト mitotic 子孫を FACS による分離し後で多くのダウン ストリーム アプリケーションで使用できます。シグナル伝達経路の数、文化の期間、神経新生のモードを操作することによって数百万の蛍光に分類された介在ニューロン前駆体下流のアプリケーション ホストに適してを取得できます。

MESCs9,10、11,12,13,14, Wnt に依存している私たちのメソッドから MGE のような前駆細胞を生成するためにいくつかの他の方法が存在するが価格 939、拮抗薬は、Foxg1/Nkx2.1 胎生前駆細胞の共発現を生成するに特に効果的です。さらに、介在ニューロン前駆細胞や、デュアル レポーター システムを介して彼らポスト mitotic Lhx6 表現の子孫を選択する能力は大きく異なる前駆細胞および彼らの子孫を生成する能力を高めます。

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Protocol

注: このプロトコルで記述されているデュアル レポーター mESC ラインはリクエスト制 (sande@mail.med.upenn.edu です)。

1. メディアの準備

注: は、細胞培養で使用する前に 37 ° C にすべてのメディアを温めます。

  1. (500 mL の準備) のマウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEF) メディア
    1. ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) と 500 mL 0.22 μ m 孔フィルター ユニットを介してフィルターの 449 mL に 50 mL のウシ胎児血清 (FBS) を追加します。
    2. ろ過後 1 mL 抗菌剤 (50 mg/mL) を追加します。1 ヶ月または因数 ≤ で店の 4 ° C でメディアを格納-20 ° C
  2. (500 mL の準備) のための N2 メディア
    1. 5 mL L アラニン L-グルタミンを追加 (100 x) と 500 μ L 2-メルカプトエタノール (55 mM) 489.5 mL DMEM: 栄養混合物 F-12 (DMEM/F-12)、および 500 mL 0.22 μ m 孔フィルター ユニットを介してフィルター。
    2. ろ過後 1 mL 抗菌剤 (50 mg/mL)、5 mL N2 サプリメント B を追加します。最大 1 ヶ月間、暗闇の中で 4 ° C でメディアを保管します。
  3. (500 mL の準備) の成長の無血清培地 (KSR)
    1. 75 mL 無血清培地のサプリメントは、5 mL の L グルタミンを追加 (100 x) 5 mL MEM 非必須アミノ酸 (MEM NEAA) (100 倍) 500 μ L 2-メルカプトエタノール (55 mM) 413.5 mL 非グルタミンを含む DMEM、500 mL 0.22 μ m 孔フィルター ユニットを介してフィルターと。
    2. ろ過後 1 mL 抗菌剤 (50 mg/mL) を追加します。1 ヶ月の 4 ° C でメディアを格納します。
  4. (500 mL の準備) のマウス胚性幹細胞のメディア
    1. 75 mL 幹細胞グレード FBS、5 mL MEM NEAA を追加 (100 x) 5 mL L グルタミン (100 x) 500 μ L 2-メルカプトエタノール (55 mM) 413.5 mL 非グルタミンを含む DMEM、500 mL 0.22 μ m 孔フィルター ユニットを介してフィルターと。
    2. ろ過後 1 mL 抗菌剤 (50 mg/mL) を追加します。1 ヶ月または因数 ≤ で店の暗闇の中で 4 ° C でメディアを保管-20 ° C

2. 培養 mESCs

  1. 3-4 × 10 の4セル/cm2で扱われる組織培養プレートに MEF メディアで有糸分裂アクティブ MEF フィーダー細胞をプレートします。少なくとも 12 h ≥ 95% 相対湿度と 5% CO2と 37 ° C で細胞文化のインキュベーターで、mESCs をめっきする前に解決するを許可します。すぐに使用しない、3 日おきに MEF のメディアを交換してください。処分 MEFs めっき後 7 日以内に使用されていない場合。
  2. マウス白血病の抑制的な要因 (mLIF) (1,000 U/mL) mESC 培地で MEF プレートに mESCs (× 104セル/cm21 4 から密度範囲) を追加します。≥ 95% 相対湿度と 5% CO2と 37 ° C でセルを孵化させなさい。
  3. トリプシン-EDTA (0.05% トリプシン) を使用して mESCs の通路 (1:5-1:10) 皿になったら ~ 70-80% の合流や植民地が接触し始めているかどうか。これは通常、2 日ごとに発生しますが、初期めっき密度に応じて 4 または 5 日にかかることが。
  4. MESC 中多能性を維持する MEF の送り装置の層の mESCs を維持します。
  5. 分化を開始する前に少なくとも一度 MEFs、MEFs を希釈することがなくゼラチン コーティング プレートの上に細胞を通路します。
    1. ゼラチンをリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) Ca2 +/Mg2 +扱われる細胞培養用ディッシュに 0.1% ゼラチン コーティング プレートを準備し、37 ° c 少なくとも 1 h. プレート 1.5-2 x 10 の6セル/10 cm プレートを残して (10 x 2.7 3.64セル/cm2) の細胞は分化を開始する前に 2 日間の拡大して。

3. MGE のような胎生前駆細胞に対する mESCs の差別化

  1. 分化の日 (DD) 0 =「浮遊細胞」
    1. MESCs で育った後 2 日間ゼラチン コーティング プレートはメディアを吸引し、Ca2 +/Mg2 +なし PBS で 1 回洗浄を行う。十分なトリプシン-EDTA (0.05% トリプシン) (通常 4 mL トリプシン-EDTA 1 つ 10 cm 培養皿のため)、プレートの表面をカバーし、4 分の ≥95% の相対湿度と 5% CO2と 37 ° c の定温器に戻るセルに配置を追加します。
    2. 4 分後 mESC メディアで 2 倍のボリュームを使用してトリプシン-EDTA を癒します。適切なサイズの遠心管にセルを転送し、200 x g で 5 分で細胞を遠心分離します。5 分後チューブを削除し、ペレットを乱すことがなくメディアを吸引します。LDN 193189 BMP 阻害剤を含む KSR:N2 メディア (1:1) 1 mL にペレットを再懸濁します (250 nM) および wnt シグナル阻害剤価格 939 (10 μ M)。
    3. 検定または自動化された細胞カウンターを用いた細胞濃度を測定します。LDN 193189 を含む KSR:N2 メディア (1:1) で 75,000 セル/mL を追加することによって胚様体 (EBs) として細胞を成長を開始 (250 nM) および価格 939 (10 μ M) 非付着ティッシュの培養皿で。≥ 95% 相対湿度と 5% CO2と 37 ° C でセルを孵化させなさい。
  2. DD1、≥ 95% 相対湿度、37 ° C で (O/N)「着陸」ポリ-L-リジン (10 μ g/mL PBS で Ca2 +/Mg2 +) のコーティング処理ティッシュの培養皿で一晩セルのまたは少なくとも 1 時間のために準備します。
  3. Dd2 は、ポリ-L-リジンを吸引し、ラミニン (10 μ g/mL PBS で Ca2 +/Mg2 +) でプレートをコート O/N ≥ 95% 相対湿度、37 ° C で。
    注: O/N は最適な少し中 2 h が十分かもしれません。次の日に板を使用しない場合ラミニンを吸引せず Ca2 +/Mg2 +PBS の変更、4 ° C で 2 週間まで保存します。
  4. DD3 (「セルの土地」)
    1. EB 解離を開始する前に、ラミニンを吸引し、プレートをティッシュ文化フードで完全に乾燥します。光沢のあるまたはぬれた目に見えて表示される板は使用しないでください。15 mL チューブに 15 g x または EBs がペレットまでで 3 〜 4 分間遠心するメディアと EBs を転送します。
  5. メディアを吸引し、DNase を含む細胞剥離溶液 3 mL を加える (2 U/mL) と, ≥ 95% 相対湿度、37 ° C で 15 分 5% CO2優しくはじく 3 毎分 EB 解離を支援します。
  6. EBs が表示されなくまたは 15 分が経過した, DNase を含む 6 mL KSR:N2 (1:1) に追加 (1 U/mL) と 200 x g で 5 分間遠心します。
  7. LDN 193189 を含む KSR:N2 (1:1) で細胞をプレート (250 nM)、価格 939 (10 μ M)、ROCK 阻害剤の Y-27632 (10 μ M) で 4.5-5 104セル/cm2倍。

4. SST 豊かプロトコル:「DD12 GFP 高ソニック ・ ザ ・ ヘッジホッグ (SHH)」(3.7 手順からの続き)

  1. DD5、FGF 2 を含んでいる KSR:N2 (1:1) とメディアを変更 (10 ng/mL)、IGF-1 (20 ng/mL)、および SSH (50 ng/mL)。
  2. 日 8 (ステップ 4.4) に再めっき組織培養プレートを準備手順 3.2 3.3 で説明されている手順を使用して。
  3. DD7、FGF 2 を含んでいる KSR:N2 (1:1) とメディアを変更 (10 ng/mL)、IGF-1 (20 ng/mL) と SHH (50 ng/mL)。
  4. DD8、上プレート細胞の再。
    注: この手順は必須ではありません、再めっきセル初期分化、不要な細胞の種類減らすことができます。再メッキして、下流の免疫組織化学的解析を難しく細胞のボールを分割後時点で FACS の効率を高めます。
    1. 再細胞をプレート、≥95% の相対湿度と 5% CO2と 37 ° C で 5 分間トリプシン-EDTA (0.05% トリプシン) でプレートから細胞を分離します。KSR:N2 と 2 倍のボリュームを使用してトリプシン-EDTA を消すし、200 x g で 5 分間遠心フィルターいずれかの塊を削除する 40 μ m のフィルター チューブを介して細胞。FGF 2 を含む 250,000 セル/cm2で N2/KSR (1:1) セルを再プレート (10 ng/mL)、IGF-1 (20 ng/mL) と Y-27632 (10 μ M) SHH と (50 ng/mL)。
      注: 代わりに、再 DD8 に細胞をプレートに決定、SHH を含む KSR:N2 とメディアを変更 (50 ng/mL) DD7 から DD12 2 日おき IGF-1 に追加して、(20 ng/mL) と FGF 2 (10 ng/mL) DD9 まで。
  5. DD10、SHH を含む KSR:N2 とメディアを変更 (50 ng/mL)。
  6. DD12、SST のサブタイプの濃縮細胞を得るためには、使用 FACS して切り離します Lhx6::GFP-のみ発現細胞。
    1. セルをデタッチするには、トリプシン-EDTA よりもむしろ非トリプシン含有細胞解離試薬を使用します。細胞 Ca2 +/Mg2 +なし PBS で 1 回洗浄します。DNase を含む予め温めておいた非トリプシン含有細胞解離試薬を追加 (2 U/mL) のセルにします。≥95% の相対湿度と 5% CO2と 37 ° C で 10-30 分またはセルをデタッチするまでのインキュベーターに入れます。解離を支援するために 5 分ごとの板が軽きます。
      注: DD11 12 文化の 10-15 分のみ必要があります。用 dd15 用 16 文化のため 30 分以上必要があります完全な解離のため。
    2. セルが完全にプレートを持ち上げ、一度 FACS 分離標準プロトコルを使用してに進むか、その他の下流解析のセルを使用します。

5. 太陽光発電豊かプロトコル:「DD11/DD17 mCherry + aPKCi」(3.7 の手順からの続き)

  1. DD5、FGF 2 を含んでいる KSR:N2 (1:1) とメディアを変更 (10 ng/mL) と IGF-1 (20 ng/mL)。
  2. DD8 再めっきの組織培養プレートを準備 3.2 3.3 の手順 (手順 4.4) に記載されている手順を使用して。
  3. DD7、FGF 2 を含んでいる KSR:N2 (1:1) とメディアを変更 (10 ng/mL) と IGF-1 (20 ng/mL)。
  4. DD8 に再セルを次の例外を除き、手順 4.4 で説明したプレート: セルは再メッキしているとき、に置き換える SHH 滑らかアゴニスト (サグ; 30 nM) と非定型の PKC 阻害剤 (aPKCi; 2 μ M) を追加。まとめると、再メッキのメディアは今 N2/KSR (1:1) を含む FGF 2 (10 ng/mL)、IGF-1 (20 ng/mL)、Y-27632 (10 μ M)、サグ (30 nM)、および aPKCi (2 μ M)。
  5. DD10、aPKCi (2 μ M) を含む KSR:N2 のメディアを変更します。
  6. DD11
    注: この時点で、Nkx2.1::mCherry+ 細胞は、太陽光発電 CIns になる濃縮されています。
    1. ステップ 4.6 に記載されている同じプロトコルを使用して FACS のためプレートから細胞をデタッチします。決定は後日分化 Nkx2.1::mCherry+ 細胞を収集する場合は、この手順を無視してください。
  7. DD12、aPKCi (2 μ M) を含む KSR:N2 のメディアを変更します。DD14、aPKCi (2 μ M) を含む KSR:N2 のメディアを変更します。国鉄 DD16、aPKCi (2 μ M) を含む KSR:N2 のメディアを変更します。DD17、ステップ 4.6 に記載されている同じプロトコルを使用して Nkx2.1::mCherry+ 細胞を収集します。

6. 太陽光発電豊かプロトコル:「DD17 mCherry 低分子機構」(3.7 手順からの続き)

  1. DD5、FGF 2 を含んでいる KSR:N2 (1:1) とメディアを変更 (10 ng/mL) と IGF-1 (20 ng/mL)。DD7、FGF 2 を含んでいる KSR:N2 (1:1) とメディアを変更 (10 ng/mL) と IGF-1 (20 ng/mL)。
  2. DD9、KSR:N2 (1:1) では、メディアを変更します。これ以降に成長因子を追加する必要はありません。
    1. DD17 のセルを収穫まで 2 日おきに、メディアを変更していきます。

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Representative Results

このペーパーで説明したプロトコルの公開プロトコル15,16,17の修正版で、私たち Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP デュアル レポーター mESC ラインでの使用に最適化されています。DD0 ~ 5 DD8、再メッキと組み合わせる価格 939 wnt シグナル阻害剤を追加することにより前記の文化のすべての DAPI + 核の 50% 以上も Nkx2.1 を表現している (図 1 a, B)、堅牢な Nkx2.1 誘導を実現します。MCherry と GFP レポーターの免疫組織化学は、Nkx2.1 陽性細胞 (図 1 a) の領域内で明確な表現を示しています。ネイティブのレポーターを使用して生きた細胞の FACS が細胞の個体が明確に分離することができますを示しています: (1) GFP/mCherry (2) mCherry 専用 (4) GFP/mCherry ダブル発現細胞 ( 、(3) GFP のみ発現細胞、細胞を表現する細胞二重否定図 1)。この行を使用して、前駆細胞のごく一部を DD8 9 周り mCherry レポーターをオンに開始します。MCherry レベルは、DD12 13 間にピークし、前駆細胞の細胞周期を終了し、ポスト mitotic の Lhx6::GFP + 介在ニューロン前駆 (図 1) を生成を着実に減少します。同様に、Lhx6::GFP レポーターをオンに DD9 10 とピークの間周り DD13 14 (図 1)。Lhx6::GFP セルの合計数文化の増加は続いていますが、割合はありません、おそらく他系統の増殖が原因。一度 Lhx6::GFP + 記者の表現は、それ残る検出 Lhx6 は安定して成熟した MGE 派生皮質介在ニューロン18,19で表されますので、いつまでも。マウス前脳内重複非主 Nkx2.1 と Lhx6 式ですが、Nkx2.1::mCherry と Lhx6::GFP の共発現培養細胞の一時的な人口があります。これは Nkx2.1 式の通常の期間を超えて mCherry レポーターの perdurance のために少なくとも部分的に二重標識細胞のほとんどは Nkx2.1 蛋白質 (タイソン ・ アンダーソン、未発表) の検出レベルを表現しないでください。継続 Lhx6 記者と桜/Nkx2.1 蛋白質を表現する細胞は線条体介在ニューロンの20にあります。しかし、私たちのライブ イメージングの研究に基づいて、前記 Nkx2.1::mCherry と Lhx6::GFP を表現する同期、新しくポスト mitotic の前駆体が分離することができます約 18 時間の窓がある Tischfield、アンダーソン、未発表・ Tischfieldらを参照してください17). したがって、プロトコルの中に、Nkx2.1::mCherry と任意の時点で Lhx6::GFP 二重陽性細胞を収集することによりお互いの約 18 時間の内で細胞周期を終了している主にセルの人口を得ることが可能です。これは Nkx2.1::mCherry と Lhx6::GFP とは対照的です-のみ発現細胞、さまざまな誕生日のそれぞれ、前駆細胞と前駆物質のさまざまな型を表す。

Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP デュアル レポーター mESC ラインは、SST 運命介在ニューロンの豊かにする使用できます。一般に、SHH を文化に追加し、収集 GFP + 細胞 (例えばDD12) 分化以前の時点では SST のサブタイプの富ませます。我々 の観察に基づき、我々 はない DD5 または DD8 SHH を追加するかどうかに応じて SST:PV 比に有意差を見ている (データは示されていない)。分子機構を追加することによって (50 ng/mL) DD8 12 から、GFP のみ発現細胞を移植平均 SST:PV CIns (図 2 a)15,17の比率は 7:1 取得します。私たちのデュアル レポーター mESC ラインを使用して介在ニューロン運命に及ぼす SHH と文化の時間の詳細については、「タイソンら」を参照してください。15

太陽光発電運命 CIns の豊かにするには、SHH を培地から省略されなければなりません。注記のうち、SHH 前駆細胞分裂21Nkx2.1 式を維持するためにシグナリングの要件と一致して SHH シグナルが存在するこれらの文化で拮抗薬 cyclopamine の排除をシグナリング分子機構から追加される外因性の分子機構なしNkx2.1 式15。セルが DD8 に再メッキなら、この内因性の分子機構は、削除された、このようなそのサグ (30 nM) Nkx2.1 式と CIns の生産を維持する DD8 10 からメディアに追加する必要があります。私たちの以前の研究結果によって培養条件から徴収して SHH と DD17 Nkx2.1::mCherry+ セルの並べ替え、PV:SST 細胞の ~2.6:1 比することができた (図 2 b)15。SST とは対照的サブタイプは、初期の段階で、外因性の分子機構の存在下で豊かにしているは、培養期間を増加し、PV サブタイプ15豊かに外因性 SHH の不足。最近の研究でわかった大幅私たち"MGE"プロトコルに適用されますその aPKCi サイクリン D217、22中間前駆細胞のマーカーを表す Nkx2.1::mCherry の前駆細胞の割合が上昇このプロトコルのバリエーションは、SST の前駆細胞に属します23心室表面に放射状の前駆細胞主に対し太陽光発電表現 CIns に属します中間前駆細胞、主に私達の見つけることに基づいていた。我々 は、ソートすると新生児マウス大脳新皮質に移植、これらの前駆細胞は PV サブタイプを生産するため大きく偏っているを発見しました。DD8 11 から aPKCi を追加し、並べ替え、次に Nkx2.1::mCherry セル、PV:SST サブタイプ (図 2)17の 5.8:1 比を取得することができました。太陽光発電のサブタイプにさらに充実させて、Nkx2.1::mCherry 細胞 DD8 17 から aPCKi の存在下で成長をも分離しました。しかし、我々 は PV のサブタイプが生成されます (図 2 D) の割合が増えたにもかかわらず DD11 で取得することができたを超えて PV:SST 比の増加を達成しなかった。これらのプロトコルごとにフローチャートは、図 3に含まれています。マウスの免疫染色脳移植後 30 日対策太陽光発電、抗-SST (Lhx6::GFP + 細胞の同定を図る) 抗 GFP と抗体は、Lhx6::GFP + 細胞が PV と SST の表現のパターンを持つ成熟した形態学的特徴を示すことを示しています似ている生体内で相手 (図 4および図 5)。

CIn 分化が正常かどうかを決定するを支援するため (図 6, , 図 7図 8) に通常の変動を示すプロトコルの各段階で一連の画像を用意しました。また失敗した分化が DD4 に表示する方法を示す図が含まれます (図 9)。一般に、失敗した分化は低レベル (10% 未満) の Nkx2.1 式と Nkx2.1::mCherry と Lhx6::GFP の誘導が約 1% 以下の割合になります。

Figure 1
図 1: Nkx2.1::mCherry と Lhx6::GFP の介在ニューロン前駆体の生成します。(A) 表示ここでは、Nkx2.1、Nkx2.1::mCherry (RFP) と Lhx6::GFP (GFP) 分化日 12 (DD12) 文化から染色の代表的なイメージ。これらの画像は、ビューの同じフィールドからチャンネルを重複に注意してください。(B) 定量化 DAPI + 文化 DD12 で Nkx2.1 を表現する核の割合の平均値の (n = 3 の独立した分化)。(C) 代表的な FACS プロット デュアル レポーター mESC ラインナップを使用して分離することができます 4 つの異なる細胞集団を示します。なお mCherry は x 軸、GFP は y 軸です。したがって、右上のボックスはダブル mCherry/GFP 陽性細胞を表します。(D) DD6 16 mCherry だけを表現する、GFP のみを表現する、または mCherry/GFP の共発現培養細胞の割合を示すから Nkx2.1::mCherry と Lhx6::GFP の誘導の時間コース。これらのパーセンテージは SST 豊かプロトコル間 SHH の存在下で成長した細胞から得られた、3 独立分化から平均を表します。誤差範囲 (b) と (D) を表す SEM. スケール バー = 150 μ m (A)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 太陽光発電の特異的豊かに培養条件の操作-SST 運命対 mESC 派生皮質介在ニューロン。(A) 割合の PV +、SST +、および PV-SST 介在ニューロン得/DD12、SHH の存在下で成長して表現する細胞が GFP 専用 (50 ng/mL) DD5 12 から新生児の大脳新皮質に移植、移植後 30 日を分析します。(B) 割合の PV +、SST +、および PV-SST 介在ニューロンが DD17、mCherry だけを表現する細胞の移植後補足 SHH の新生児の大脳新皮質に移植したし、30 日を分析せずに成長するときに得られました。(C) 割合の PV +、SST +、および PV-SST 介在ニューロン得/DD11、サグの存在下で育った mCherry 専用の表現する細胞 (30 nM;DD8-10) と aPKCi (2 μ M;DD8-11) 新生児の大脳新皮質に移植、移植後 30 日を分析します。(D) 割合の PV +、SST +、および PV-SST 介在ニューロン得/DD17、サグの存在下で育った mCherry 専用の表現する細胞 (30 nM) DD8 10 と DD8 17 から aPKCi (2 μ M) から新生児の大脳新皮質に移植され、30 日の分析移植後。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 本研究では説明されている PV を SST 豊かの異なるプロトコルを示すフローチャート。(A) すべてのプロトコル、石段を上がる DD0 5 を含む分化の開始が同じ。すべてのセルは BMP 阻害剤 LDN 193189 と wnt シグナル阻害剤価格 939 補われる N2:KSR (1:1) で DD0 ~ 3 胚様体で育てています。DD3、セルは「に上陸した」N2:KSR (1:1) LDN 193189、価格-939、ROCK 阻害剤の Y-27632 を含みます。SST サブタイプの豊かに DD5 12 SHH が追加されます。また、以来、私たちの経験では DD8 対 DD5 から SHH の追加以降はさほど影響しません生成 PV:SST サブタイプの比率、SHH は DD8 12 から追加されます。以前のバージョンのプロトコル (タイソンらを参照してください。15) DD8 の再メッキ ステップを採用していないと代わりに DD5 の外因性の分子機構とメディアを補完します。このプロトコルは、SHH、どちらも大幅に改変する PV:SST 比の導入とともに DD8 の再メッキ ステップを組み込むこと後で変更されました。この「高 SHH」プロトコルで Lhx6::GFP + 細胞外因性 SHH の存在下で成長は FACS DD12 上下流のアプリケーションで使用するために分離されています。(B)「低分子機構「太陽光発電プロトコル DD8 の再メッキのステップと同様に、外因性の分子機構が省略。代わりに、Nkx2.1::mCherry+ 細胞は FACS DD17 上下流のアプリケーションで使用するために分離されています。(C) ため、「+ aPKCi」PV プロトコル aPKCi が DD8 10 からサグと共に追加され、以降 DD10 からのみ aPKCi が追加されます。DD11 または DD17、Nkx2.1::mCherry 細胞は FACS 下流のアプリケーションで使用できる分離されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: Lhx6::GFP + 新生児大脳新皮質にセル 30 日後移植で PV と SST の免疫染色。(A)、SST-表現の Lhx6::GFP + セル 30 日移植後新生児の大脳新皮質にハイパワー イメージ。4 つの画像の各列内、下の差し込み印刷イメージの 3 チャネルと Lhx6::GFP、太陽光発電、および SST の表現の単一チャネル イメージです。上部のパネルのように、この Lhx6::GFP + 神経細胞は成熟した形態を示唆する複数のプロセスを詳しく説明します。2 太陽光発電-表現の Lhx6::GFP + セル 30 日移植後 (B) 高出力イメージ。(C) 高出力イメージの SST-/太陽光発電-ダブル ネガティブ、Lhx6::GFP + 細胞。ただし、このセルは、完全な分化と皮質統合一貫した複数のプロセスを詳しく説明、このセルは明らかには太陽光発電や SST は表現できません。Lhx6::GFP + セルに隣接する PV + 核があるが、それが重なり合っていないことに注意してください。スケール バー = 50 μ m (A ~ C)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: 中、低電力太陽光発電、SST、および Lhx6::GFP の蛋白質の表現のイメージ 30 日新生児の大脳新皮質に移植後。(A) 30 Lhx6::GFP + セル 30 日移植後を含むマウス大脳皮質の領域のミディアム パワー イメージ。これらの細胞は、太陽光発電プロトコル (+ DD8 11; から aPKCi を使用して栽培されました。FACS を分離し、移植 DD11 の Nkx2.1::mCherry+)。ここに見られる 30 セル、16 エクスプレス PV、4 エクスプレス SST、および 10 エクスプレス PV も SST。(B) 低消費電力イメージ、多数を含むマウス大脳皮質の領域の分化 Lhx6::GFP + セル 30 日移植後。Lhx6::GFP + プロセス皮質を通して走ることの豊かさに注意してください。時折細胞は統合し、プロセス成熟した表現型と一貫性のある手の込んだに見せかける、海馬にもあります。スケールバー = 50 μ m (A);550 μ m (B)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 6
図 6: マウス胚性線維芽細胞の送り装置の層と未分化幹細胞の正常な外観。(A) 表示ここでは、4 X、10 X 倍率明視野画像、マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEF) の送り装置の典型的な外観めっき後の 24 h の層を示します。(B) は私たちのマウスの典型的な外観胚性幹細胞 (mESCs) MEF の送り装置にめっき後 2 日。注意: 植民地、楕円形または卵形の外観ですが、明るい境界があります。植民地は、この明るい境界を失うまたは外側突起の送信を開始、これらのセルを差別化することがあります兆候では。(C) 表示ここでは、再コーティング ゼラチン料理に分化を開始する前に MEF の送り装置を希釈するためにめっき後 mESCs 1 と 2 日です。幹細胞ゼラチンに 48 時間後かなり展開、明るい境界と卵形の外観を再取得し始めることに注意してください。スケールバー = 100 μ m 4 X、10 X の写真。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 7
図 7: マウス胚性幹細胞の分化の 1 7 から日外観。(A) 1 日フローティング、幹細胞を見ることができる後成形小さな胚様体 (EBs)。2 日間で、EBs はかなり成長しています。メモいくつかの EBs が一緒に立ち往生して、細胞の大規模なクラスターを形成します。これが負の分化に影響を与えることが見つからなかった。3 日後、EBs はさらに大きく成長しているし、いくつかはもはやそれらを介して光を送信します。バック グラウンドで細胞の残骸を見ることは正常です。(B) 表示ここでは、幹細胞分化の日 4 に着陸後 24 h (DD4) です。細胞の密度に注意してください。多くは分化につれて増加する小さなプロセスを拡張し始めています。ここで、セルが全体に広がる小さな黒いドットでも着色されていることに注意してください。セルの光沢のあるまたは同種表示される場合、それは異常な分化の兆候です。DD5 によって (C) 細胞は、増殖し、神経のロゼットを形成し続けています。多くの細胞は、薄い、長いプロセスを拡張しています。(D) によって DD7 セルは合流する必要があります。通常、大規模なフラット、多核巨細胞の細胞 (おそらく上衣またはグリア細胞) が神経前駆細胞の層内の円形の島を作成する前記「スイスチーズ」パターンです。時折細胞密度が通常よりも高い場合、この「スイスチーズ」パターンはない開発中央画像に示すように。分化によって神経誘導に影響を与える可能性があります。4 x、10 x 倍率を示します。スケールバー = 100 μ m 4 X、10 X の写真。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 8
図 8: 14 から 9 日分化の外観。(A) 単一細胞が再メッキ後の 1 日を視覚化できます。神経前駆細胞の典型的なバイポーラ外見に注意してください。文化はいくつかの他の浸潤細胞の種類と同種です。密度はこの段階に適しています。DD11 によって (B) 細胞が単層に成長しました。大きな分化の初期のステージに似た多核細胞は「卵のような"見ることができる全体で散在させていて。DD13 によって (C) は、細胞が増殖し続けています。小さな塚を形成する彼らで今見ることができます。多くの"卵のような「細胞も存在しています。これ以降、文化大きくマウンドを除いて、いくつかの変更だけが表示されます。4 X、10 xx、倍率 20 倍を示し。スケールバー = 100 μ m 4 X、10 X の写真とスケール バー = 20 X 写真で 50 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 9
図 9: 4 日目失敗した分化の外観。DD4 にはプロトコルの最も困難なステップの 1 つに従うので、差別化の成功を評価の面で重要である: DD3 の着陸。DD4、によって細胞は胚様体から分離されている後に回復する 24 h があった。ここで見ることができる、細胞のほとんどは、光沢があり、同種の表示です。通常、暗い外観を持つ全体に広がる小さな黒いドットに表示される臨時のセルです。さらに、大型のフラット細胞 (左下のパネルで見ることができる) としては異常な分化を示しています。下の右側のパネルでセル (黄色の矢印) の少なくとも 3 つの小さいグループは不良の分化、不完全な EB 解離または細胞培養プレートの表面は服薬アドヒアランス不良を示す小さなの胚様体として表示されます。これらの画像は健康な通常図 7 b、描写に示したのとは対照的 DD4 上のセルに表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Discussion

この方法は J1 から派生した mESCs (SCRC-1010) をパターンで非常に効果的な他 mESC 回線とクローン分離変数の成功を経験した.たとえば、Foxg1::venus mESCs (EB3 派生;男女ら13) 応答このプロトコルと DD12 Foxg1 誘導が不十分な通常 1-2% 程度です。理由は我々 は完全に理解していないが、(JQ27 と呼ばれる) この議定書に記載されている行と同時に分離された (JQ59 と呼ばれる) もう一つの Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP のデュアル レポーターのクローンを生成 1% 未満 Nkx2.1 発現細胞成長してきたとき同じ条件にします。親行 (J1;ATCC SCRC-1010)、しかし、このプロトコルによく反応する、DD12図 1 bに示されるものと同様の Nkx2.1 発現細胞の割合を生成します。必要な場合は、行単位の分化条件を最適化する価格 939 と SHH/サグの濃度を調整できます。しかし、MGE のような前駆細胞に mESC の他の行を区別するためにこのプロトコルを使用して我々 の経験は限られています。

私たち Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP デュアル レポーター mESC ラインについては、すべて Nkx2.1 + 細胞は mCherry を表現します。MCherry + のほぼすべてのセルは、Nkx2.1 蛋白質を表現、記者式は Nkx2.1 蛋白質の表現、(DD7-9) の分化の初期段階、特に中に後ろ遅れます。Nkx2.1 + 着実に mCherry を発現する細胞の一部が分化のコース全体で増加します。ピーク レベル (~ DD12 14) mCherry は前駆細胞17を表現するすべての Nkx2.1 の約 30% で表されます。さらに、ドライブ mCherry 表現するために使用同じ細菌人工染色体は、トランスジェニック マウス24の Nkx2.1 式ドメインで Cre リコンビナーゼをドライブに使用されています。これらのマウスで Cre 式だった、MGE のほとんど背側領域の Nkx2.1 発現細胞内で弱いと下ラベル SST 表現 CIns 地域25から生成される主に知られているにこのマウスのマッピングを運命が登場 26,,2728。ただし、これらの不一致にもかかわらず GFP や mCherry 発現細胞の数百万分離できます FACS のほんの数時間で。

この手法の 2 つの主な利点があります。まず、Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP デュアル レポーター mESC ラインナップと組み合わせると、濃縮太陽光発電または SST 運命: 皮質介在ニューロンのサブタイプになる介在ニューロン前駆体の大規模な番号を取得することが可能です。2 番目の主な利点は、どの介在細胞を得ることができる運命数が多いと比較的簡単です。いくつかの他の変更された EB 技術 MGE 前駆細胞とニューロンを区別するために存在しますが、これらのプロトコルは通常 Dkk113,14,29など Wnt 阻害分子の使用に依存。Wnt シグナル阻害剤価格 939 が淡蒼球の胎生の前駆細胞の生成を高める Foxg1 と Nkx2.1 式15によって証明されるよう私達が見つけた。

前述したように、mESCs から MGE のような前駆細胞を生成するいくつかの他の方法が存在します。渡辺ら14は、再付着表面にめっき後サスペンションの無血清培養法を開発する第 1 であることによって mESCs から胎生分化の分野を開拓しました。彼らは、Wnt と節点の拮抗、Dkk1、LeftyA、それぞれ、効率的に運転 mESCs 早い神経外胚葉性系統13に見つけた。SHH をこれらの文化に適用すると、彼らは文化の共発現 Nkx2.1/Foxg1 間 5-15% のすべてのセルを観測し、MGE のような前駆細胞13としてみなすことができます。しかし、来る多くの研究の基盤を敷設しながら本研究は MGE 前駆細胞を分離または CIn のサブタイプの特定を豊かにする方法を持っていなかった。

数年後、男女ら13 mESC 派生腹胎生組織の準仕様を達成するために特定の分子機構における、様々 な成長因子の時間管理との組み合わせで同じ懸濁液の無血清培養法を使用しました。彼らは Foxg1::venus 記者13を表現する文化で 45-68% のすべてのセルの間に起因した Dkk1 治療後 DD3 12 からその分子機構管理を発見 Foxg1::venus 記者行を使用して。Foxg1::venus + 人口、内細胞の約 32% は Nkx2.113を表明しました。サグの SHH を代入して Fgf8 を追加するには、彼らはさらに Foxg1::venus + の人口約 4113内 Nkx2.1 前駆細胞の割合を強化しました。運命の試金される、これらの細胞は約 17 %sst、PV 21%、18 %npy、および 8% カルレチニン サブタイプ13を生産しました。しかし、この研究は、CIn の MGE 派生運命対 CGE を指定する方法を説明、PV や SST のサブタイプ選択的に豊かにする方法は説明しなかった。

次の年、Cambrayら11は、分化にアクチビンの効果とマウスと人間の Esc から派生した胎生神経前駆体のアイデンティティを調査するのに DD5 の再メッキと無血清単層法を使用しました。本研究では、プロトコルの Nkx2.1 細胞の割合が報告されていないが彼らを報告する培養細胞の約 54% が共同 Nestin/Foxg1 DD2 (5 日間無料メディア続いて追加 2 日間文化の血清の成長の上を表現再メッキ) 後11。彼らはまた表現ということアクチビンの追加、セルの ~ 55% 共同ネスチン カルレチニン発現皮質ニューロンの大部分を生産仙骨神経節隆起のようなセルを表す可能性がありますこれらの細胞を示す CouptfII 報告11します。 確かに、8 日間の培養 (13 日全体) によって細胞の 39% は共同共同 GABA/BIII-チューブリン11を表現する細胞の 59% が見つかりました、カルレチニン/BIII-チューブリンを表現する発見されました。本研究は、太陽光発電や SST のサブタイプの生産を調査しませんでした。

変更された EB 方法、陳らでもう一度12要素に従うと幹細胞由来細胞 MGE12が浄化される可能性がありますその MGE 固有エンハンサーを示した。この研究では、彼らは mESCs の Lhx6::GFP 記者ライン; を使用して MGE のような前駆細胞への分化監督中に異なる培養条件の効果を比較しました。本稿で説明した Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP デュアル レポーター行の親行を務めた同じライン。彼らは示したこと Dkk1 をカルチャに追加することによって DD0 ~ 3 条件添加に続いて、サグの上方の ~ 10% 文化のすべてのセルの表現 Lhx6::GFP12。彼らはまたそれの男女らによって記述された Foxg1::venus 行に適用されます、同じプロトコルを発見12、Foxg1::venus レポーターを表現するすべてのセルの約 37% となりました。CIn サブタイプ マーカーの次の平均正答率が観察された Lhx6::GFP 細胞が移植された生体にいた、: 16% NPY12SST は 58%、22% 太陽光発電。

最近では、他のグループは、CIns を直接指定するのに系列を定義する転写因子の強制発現を使用しています。おそらくこれの最初のデモンストレーションだったペトロスらによって10人で Lhx6::GFP 細菌人工染色体を含むように変更された Ainv15 mESCs Nkx2.1 式を運転するドキシサイクリン誘導性プロモーターを使用します。この調査は、現在原稿なく価格 93910添加を説明したような培養条件を使用しました。しかし、理由はよくわかっていないが、Lhx6::GFP + 細胞のより低いパーセントはこの原稿10J1 Lhx6::GFP 親の行を使用する場合と比較して同じ分化条件下で観察されました。No による細胞の式 (合計 % 不明)、Nkx2.1 の合計数の緩やかな減少があった Foxg1 の同じようなレベルを達成するにもかかわらず Lhx6::GFP レポーター10を表現するすべてのセルの 2% を超える。本研究では、esc キー行もともとプロトコルの開発に使用されたものとは異なる微分のプロトコルに適用する際研究者が直面している様々 な ESC ラインと課題の間存在する本質的な違いを強調表示します。

エレガントなアプローチは、Auらを使用してください。9は、渡辺らが開発した同じ腹胎生分化パラダイムを用いた皮質介在ニューロンの特定のサブタイプを生成するのに転写因子の連続強制発現を使用14中 Foxg1 +、Nkx2.1 +、および olig 2 + 文化生成の前駆物質の正確なパーセンテージを報告しない彼らは、彼らの文化のすべてのセルの約 50% が gaba 作動性ニューロン9に区別される状態します。11 日後の分化で EBs が解離し、E13.5 MGE ホスト胚9に移植します。これらの (1% 未満) の小さな割合の MGE から Dlx5/6-eGFP レポーターによって同定され、運命の9の分析された大脳皮質に移行します。太陽光発電、SST、その選ばれた強制誘導戦略9に基づく CGE のような運命の比率の様々 な検討を行った。興味深いことに、転写因子 Lmo3 の発現と彼らは観察の平均約 57% 太陽光発電、21 %sst と 15 %cge 派生サブタイプ (SST-/リーリン + や VIP-のみ +)9。生産約 32 %sst、35% の PV と 25 %cge 派生サブタイプ9Nkx2.1/Dlx2 GOF 線使用する観測された海面水温のサブタイプの最大の割合を求めた。

2015 年、Colasanteらに30は、GAD67 GFP レポーター マウス線維芽細胞内の 5 つの転写因子 (Foxg1、Sox2、Ascl1、Dlx5、および Lhx6) の強制発現では換算 gaba 作動性のような CIns のすべてのセルの 15% を示した。驚くことに、これらの細胞の約 90% は SST30を表現する希少な細胞のみで太陽光発電を表現するようになった。このメソッドは、mESCs には適用されませんでしたがそれはすべてのセルの約 30% が gaba 作動性アイデンティティ30を採用したことが推定されたヒト Ips で使用されました。

図 2のように、太陽光発電や SST CIns の豊かな人口を生成するいくつかの方法があります。DD17 プロトコルを介して太陽光発電プロトコル利用した aPKCi の主な利点は、セルを 1 つのより多くの分離、細胞生存率、および文化の期間です。図 1に DD17 誘導レベルのデータを表示しない我々 が約倍 mCherry + 細胞 DD11 で DD17 である (データは示されていない)。移植細胞を収集する場合我々 より多くの約細胞の 30-50% が注入のために集中させる過程で失われるので、有益である細胞 (下記参照) を開始します。さらに、セルが氷の上の時間の量を制限し、全体のコストを削減、FACS の短縮と細胞の大きい数が取得できます。おそらく桜 + 細胞の割合は前駆細胞であるので文化 (例えばDD11) の初期の段階から細胞は新生児の大脳新皮質に移植後 DD17 細胞と比較して大きい生存を展示します。生菌の大規模な番号が必要な場合たとえば、てんかんを治療する細胞移植の場合開始に大きい人口と大きな可能性を持っていることが特長です。

プロトコルによって図 2に示すように Lhx6::GFP 陽性細胞の約 25 39% は移植後はルーチンの免疫組織化学的に太陽光発電または SST タンパク質の検出レベルを表現しない 30 日を分析しました。一般に、これら太陽光発電-SST 細胞表現 Sox6、「タイソンらMGE 派生皮質介在ニューロンのマーカーと同様に、GABA/15, Tischfield et al.17). PV の 1% 未満/SST-Lhx6::GFP + セルのカルレチニン、リーリン、ニューロペプチド Y など、他の介在のサブグループのエクスプレス マーカー (データは示されていない)。これは、生体内運命マッピング研究の間を示しているに似ています 〜 MGE 派生介在ニューロンの 15-25% が太陽光発電または SST23,25,31を表現しないでください。我々 はことを発見したときに Nkx2.1::mCherry+ または Lhx6::GFP + 細胞は隔離され、ラット皮質フィーダー体外にメッキ、~ Lhx6::GFP + 細胞分析太陽光発電-28 日間培養した後の 40-70%/SST-、大多数の人の肯定的な染色を行うことでSST を表現します。太陽光発電のこの増加/成熟した太陽光発電式、またはフィーダー細胞から最適な電気生理学的入力のためのケースをすることができる特に SST セルが現在ある生体内で、外因性成熟信号の不在のためあります。我々 は運命分析よりもむしろ生体外で分化の新生児の大脳新皮質に移植細胞を好む理由がであるかもしれないものは何でも。

ほとんどの移植実験をお勧めします DD0 浮かぶ 2 つの 10 cm 非付着ティッシュの培養皿の最小 N2/KSR の 10 mL で 10 の5 mESCs x 各含む 7.5 (10 の4セル/mL x 7.5; 20 mL の総数)。一緒に、両方のプレートはどの 5.4 × 10 の6セルを (50,000 セル/cm2; 約 110 cm2の合計) 2 つの治療 6 ウェル培養プレートのシードに使用することができます DD3 の EB 解離後通常 8-12 x 10 の6セルを得られます。DD8、によって各 6 ウェル プレート利回り約 5-7 x 10 の7セルを種子密度 250,000 セル/cm2 (4.05 × 3 6 ウェルの場合 10 の7セルの合計を必要とする 5 つの 6 ウェル プレートに追加 3 するために使用することができます。プレートまたは 5 6 ウェル プレートの場合 10 の7セル x 6.75)。DD14、によって各 6 ウェル プレートは通常、1 〜 2.5 x 10 の6 mCherry または GFP 発現細胞をもたらします。実験のニーズに応じて我々 は 7.5 x 6 x 106 mESCs 大移植プロジェクトの上向きに小規模な免疫組織化学分析のための 10 の5 mESCs の最小値を漂わせました。

プロトコルの最も重要な手順は、初め分化前の多能性の状態と DD3 の着陸/解離のステップで mESCs を維持しています。細胞は適切に維持されていて、DD3 の着陸/解離は慎重に行われます通常、分化は成功でしょう。茎セルだけ健康に見えるし、差別化を使用する必要があります。EBs は DD0 ~ 3 間を形成または複数フォームを失敗した場合、小さな、非対称的な体分化は成功する可能性があります。さらに、EB DD3 の解離、中に EB の注意深く監視する必要までもはや目に見える非トリプシン含有細胞解離リージェントへの長期暴露を避けるために目で。

本稿で示された結果は、試薬の品質制御を用いた最適条件下で得られました。これは、拡張機能、mCherry、GFP レポーター表現して我々 は時折、堅牢な Nkx2.1 誘導を達成する難しさを持っているので注意して重要です。我々 の経験に基づいて、これらの変更の最も可能性の高いアカウントを FBS のロットごとに変動と考えます。など、政府短期証券の mESCs を維持することにとって最高の仕事を決定するための異なった多くをテストすることをお勧めします。我々 は 2 i/LIF システム (無血清培地、MEK 阻害剤 PD03259010 と GSK 3 α/β 阻害剤 CHIR99021 を含む) を使用していない、無血清 mESC 条件はより一貫性のある結果が生じることが可能です。我々 は、しかし、この仮説をテストしていないと無血清 mESC メディアの使用が mESCs の MGE のような前駆細胞への分化をどのように影響するかどうかに関してのデータをありません。さらに、早かった、可能な限り新鮮な成長因子を使用することができる単一の使用のためにそれら。ユーザーによって細胞の密度が特に DD3 の着陸手順の中に、適切な細胞の生存を達成するために増加する必要があります。

介在ニューロンは、生き残るため、移行、および統合ホスト回路移植後驚くべき能力を持っています。てんかんマウスモデルと神経と神経精神疾患の他のモデルに介在ニューロン前駆細胞を移植するためにこのプロトコルを使用できますよう、(サウスウェルらを参照してください。32介在細胞のレビューのためのタイソンとアンダーソン33ベースのセラピー)。たとえば、ドネガンらの最近の研究します。34豊かに統合失調症のモデルマウスに移植の PV と SST CIns の集団。彼らは太陽光発電と SST 濃縮太陽光発電集団彼らを勉強していた統合失調症 endophenotypes の正規化と苗、マウスの行動にさまざまな効果を豊かに、発見しました。

近年、PiggyBac トランスポゾン システムは、システムの数の遺伝子を安定に発現を達成するために使用されています。迅速かつ簡単に作成安定的介在の開発中に特定の遺伝子の役割を研究するドキシサイクリン誘導マイクロ Rna 構成要素を表現するこのシステムを使いました。我々 はまた、この技術を使用してデュアル レポーターのチャネルロドプシン 2 (ChR2) を生じるにエクスプレス mESC 行を作成するドライブ mESC 派生介在ニューロンまたはオンまたはオフに移植する DREADD 受容体技術細胞集団。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

このプロトコルを開発することの彼らの初期の作品の Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP デュアル レポーター mESC ライン ジェニファー タイソン、アシフ Maroof、ティム ・ ペトロスを開発するため清徐に感謝しております。また、テクニカル サポートにチョップ流れ cytometry コアを感謝いたします。この作品は、NIH R01 MH066912 (SA) と F30 MH105045 02 (DT) によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media -- add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots

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マウス胚性幹細胞の皮質介在ニューロン前駆細胞への分化
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Tischfield, D. J., Anderson, S. A.… More

Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).

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