Summary

سير العمل على أساس المزيج تجارب التتبع النظائري للتحقيق الأيض الميكروبي من عدة مصادر المغذيات

Published: January 22, 2018
doi:

Summary

ويصف هذا البروتوكول إجراء تجريبي للكمية وشاملة التحقيق الأيض من عدة مصادر المغذيات. يسمح سير العمل هذا، استناداً إلى مجموعة من التجارب الراسم النظائر المشعة وإجراء التحليل، مصير المواد الغذائية المستهلكة ومنشأ الأيضية سينثيتيزيد جزيئات من الكائنات الحية الدقيقة تحديد.

Abstract

دراسات في مجال علم الأحياء الدقيقة تعتمد على تنفيذ مجموعة واسعة من المنهجيات. على وجه الخصوص، تطوير أساليب مناسبة إلى حد كبير يسهم في توفير معرفة واسعة بالتمثيل الغذائي للكائنات الدقيقة التي تنمو في المعرفة كيميائيا الوسائط التي تحتوي على مصادر الكربون والنيتروجين فريدة من نوعها. على النقيض من ذلك، ما زالت إدارة مصادر المغذيات متعددة، على الرغم من وجودها الواسع في البيئات الطبيعية أو الصناعية، من خلال التمثيل الغذائي تقريبا غير مستكشفة. وهذه الحالة يرجع أساسا إلى الافتقار إلى منهجيات مناسبة، مما يعوق التحقيقات.

نحن تقرير استراتيجية تجريبية كمياً وشاملة استكشاف كيفية تشغيل الأيض عندما يتم توفير مغذيات كخليط من جزيئات مختلفة، أي، مورد معقدة. هنا، نحن تصف تطبيقها لتقييم تقسيم مصادر النيتروجين متعددة من خلال شبكة الأيضية الخميرة. سير العمل يجمع بين المعلومات التي تم الحصول عليها من خلال تجارب الراسم النظائر المستقرة باستخدام المحدد 13ج-أو ركائز المسمى ن 15. الأولى تتكون من تخمير موازية واستنساخه في المتوسط نفسها، التي تضم خليط جزيئات المحتوية على ن؛ ومع ذلك، يسمى مصدر نيتروجين محدد في كل مرة. يتم تنفيذ مزيج من الإجراءات التحليلية ([هبلك]، GC-MS) لتقييم أنماط التوسيم للمركبات المستهدفة وقياس الاستهلاك والانتعاش من ركائز في نواتج الأيض الأخرى. تحليل متكامل لمجموعة البيانات كاملة يوفر لمحة عامة عن مصير ركائز المستهلكة داخل الخلايا. ويتطلب هذا النهج بروتوكولا دقيقة لجمع العينات – تيسير نظام الروبوت للرصد على الإنترنت لتخمير – وتحقيق العديد من التحليلات تستغرق وقتاً طويلاً. على الرغم من هذه القيود، فقد أتاح فهم، للمرة الأولى، على تقسيم مصادر النيتروجين متعددة في جميع أنحاء الشبكة الاستقلابية الخميرة. توضيح توزيع النيتروجين من مصادر أكثر وفرة تجاه المركبات الأخرى ن، وتحدد أصول الأيضية للجزيئات المتطايرة والأحماض الأمينية قائمة.

Introduction

فهم كيف يعمل الأيض الميكروبي مسألة أساسية لتصميم استراتيجيات فعالة لتحسين عمليات التخمير وتعدل إنتاج المركبات معفن. التقدم في علم الوراثة وعلم الجينوم الوظيفي في هذين العقدين الماضي ساهمت إلى حد كبير إلى توسيع نطاق معرفة طبولوجيا الشبكات التمثيل الغذائي في العديد من الكائنات الحية الدقيقة. الوصول إلى هذه المعلومات أدت إلى تطوير النهج التي تهدف لإجراء استعراض شامل لوظيفة الخلوية1. غالباً ما تعتمد هذه المنهجيات على تفسير يستند إلى نموذج لمعايير قابلة للقياس. وتشمل هذه البيانات التجريبية، من ناحية، معدلات الإقبال والإنتاج المستقلب، ومن ناحية أخرى، تجارب كمية المعلومات داخل الخلايا التي يتم الحصول عليها من الراسم النظائر. توفر هذه البيانات معلومات أساسية لخصم النشاط في فيفو مسارات مختلفة في تعريف شبكة الاستقلابية2،3،4. التقنيات التحليلية المتاحة حاليا، فقط تمكين الكشف عن دقة وصف أنماط الجزيئات عند استخدام أحد نظائر عنصر مفرد، وربما عندما وسم يشترك مع عنصرين النظائر. وعلاوة على ذلك، تحت ظروف نمو معظم، مصدر الكربون يتكون فقط من واحد أو اثنين–المركبات. ونتيجة لذلك، النهج القائمة على تتبع النظائر ج 13من ركائز الكربون بنجاح وعلى نطاق واسع وطبقت على التوصل إلى فهم كامل للكربون الأيضية شبكة عمليات5،6،7 ،8.

وفي المقابل، في العديد من البيئات الطبيعية والصناعية، المورد متاح النيتروجين التي تدعم النمو الميكروبي غالباً ما تتألف من مجموعة واسعة من الجزيئات. على سبيل المثال، أثناء تخمير النبيذ أو البيرة، يتم توفيرها من النيتروجين كخليط من الأحماض الأمينية والأمونيوم في تركيزات متغير918. هذا الصفيف ن المركبات التي يمكن الوصول إليها لابتناء يجعل هذه الشروط المعقدة وسائل الإعلام مختلفة إلى حد كبير عن تلك التي تستخدم عادة للدراسات الفسيولوجية، كما هذا الأخير يتم تحقيقه باستخدام مصدرا فريداً للنيتروجين، عادة من الأمونيوم.

وعموما، مستوعبة النيتروجين قد أدرجت في البروتينات المركبات مباشرة أو كاتابوليزيد. بنية الشبكة استقلاب النيتروجين في العديد من الكائنات الحية الدقيقة، بما في ذلك الخميرة Saccharomyces cerevisiae، معقد للغاية وفقا لتنوع ركائز. العريضة، ويقوم هذا النظام على تركيبة النواة المركزية استقلاب النيتروجين الذي يحفز إينتيركونفيرسيون من الجلوتامين والغلوتامات و α-كيتوجلوتاراتي10،11، مع اميناز وديميناسيس. من خلال هذه الشبكة، وهي تجمع مجموعات أمين من الأمونيوم أو الأحماض الأمينية الأخرى والإفراج عن الأحماض α-keto. هذه الوسيطة أيضا سينثيتيزيد من خلال الكربون المركزية الأيض (CCM)12،13. هذا العدد الكبير من ردود فعل تشعبت والمواد الوسيطة، تشارك في الانتقاض مصادر خارجية النيتروجين وابتناء قائمة الأحماض الأمينية، يفي بمتطلبات المنشطة للخلايا. كما يؤدي النشاط من خلال هذه الطرق المختلفة المترابطة في إفراز نواتج الأيض. على وجه الخصوص، قد توجيه الأحماض α-keto من خلال المسار ايرليك لإنتاج الكحول أعلى وما خلات إستر المشتقات14، التي هي من المساهمين أساسيا للملامح الحسية للمنتجات. وفي وقت لاحق، كيف تعمل استقلاب النيتروجين دوراً رئيسيا في إنتاج الكتلة الأحيائية وتشكيل الجزيئات المتطايرة (رائحة).

ردود الفعل والأنزيمات والجينات المشاركة في استقلاب النيتروجين توصف على نطاق واسع في الأدب. بيد أن مسألة توزيع مصادر النيتروجين متعددة في جميع أنحاء شبكة التمثيل الغذائي لم تعالج بعد. هناك اثنين من الأسباب الرئيسية التي تفسر هذا النقص في المعلومات. أولاً، نظراً لتعقيد مهمة شبكة استقلاب النيتروجين، كمية كبيرة من البيانات الكمية المطلوبة لفهم كامل لعملها أن لم تكن متاحة حتى الآن. ثانيا، العديد من القيود التجريبية والقيود المفروضة على الطرق التحليلية حالت دون تنفيذ النهج التي كانت تستخدم سابقا لتوضيح الدالة CCM.

للتغلب على هذه المشاكل، اخترنا لوضع نهج مستوى النظام تقوم على التوفيق بين البيانات من سلسلة من التجارب الراسم النظائر. يتضمن سير العمل:
–مجموعة من تخمير نفذت تحت نفس الظروف البيئية، بينما يسمى مصدر مغذيات محددة مختلفة (الركيزة) في كل مرة.
–مزيج من الإجراءات التحليلية ([هبلك]، GC-MS) لتحديد دقيق، في مراحل مختلفة من التخمير، تركيز المتبقية من الركازة المسمى والتركيز وإثراء المركبات المشتقة من النظائر المشعة تقويض للجزيء المسمى، بما في ذلك الكتلة الحيوية المشتقة.
-عملية حسابية للتوازن الشامل والنظائر المشعة لكل تستهلك الجزيء المسمى ومزيد من تحليل متكامل لمجموعة البيانات للحصول على لمحة عامة لإدارة مصادر المغذيات متعددة من الكائنات الحية الدقيقة من خلال تحديد نسب التمويه .

لتطبيق هذه المنهجية، يجب إيلاء الاهتمام لسلوك استنساخه من السلالة/الكائنات الدقيقة بين الثقافات. وعلاوة على ذلك، يجب أخذ عينات من ثقافات مختلفة خلال نفس التقدم التخمير محددة تحديداً جيدا. في الأعمال التجريبية التي ذكرت في هذه المخطوطة، يستخدم نظام الروبوت للرصد على الإنترنت لتخمير لمراعاة هذه القيود.

وعلاوة على ذلك، من الضروري أن تختار مجموعة من ركائز المسمى (مجمع، والطبيعة، ووضع العلامات) التي مناسبة معالجة مشكلة الدراسة العلمية. هنا، تم اختيار 15المسمى ن الأمونيوم، الجلوتامين، وارجينين كمصادر النيتروجين الرئيسية الثلاثة الموجودة في عصير العنب. وهذا يسمح بتقييم نمط توزيع النيتروجين من المركبات المستهلكة للأحماض الأمينية قائمة. نحن تهدف أيضا إلى التحقيق في مصير العمود الفقري الكربون من الأحماض الأمينية المستهلكة ومساهمتها في إنتاج الجزيئات المتقلبة. آيسولوسين، ثريونين، وحمض أميني أساسي للوفاء بهذا الهدف، وشكل موحد لوسين المسمى ج 13، قد أدرجت في الدراسة الأحماض الأمينية المستمدة من المواد الوسيطة الرئيسية للمسار ايرليك.

عموما، فإننا استكشاف كمياً كيف يدير الخميرة مورد نيتروجين معقدة بإعادة توزيع مصادر النيتروجين الخارجية للوفاء بمتطلباتها الابتنائية طوال التخمير أثناء إزالة فائض السلائف الكربون كما بالإضافة إلى ذلك الجزيئات المتقلبة. يمكن تطبيق الإجراءات التجريبية عنها في هذه الورقة للتحقيق في مصادر المغذيات المتعددة الأخرى المستخدمة من قبل أي من الكائنات الدقيقة الأخرى. ويبدو أن نهج مناسب لتحليل تأثير الخلفية الجينية أو الظروف البيئية على السلوك الأيضية للكائنات الحية الدقيقة.

Protocol

1-التخمير وأخذ العينات إعداد الوسائط والتخميرملاحظة: تعريف كل تخمير يتم يضطلع بالتوازي، باستخدام نفس السلالة وفي نفس كيميائيا المتوسطة الاصطناعية (SM، التكوين الواردة في الجدول 1)، الذي يتضمن مزيجاً من الأمونيوم والأحماض الأمينية حسب مصادر النيتروجين15…

Representative Results

ويبين الشكل 3 رسم تخطيطي لسير العمل الذي تنفذه الخميرة من تعدد مصادر النيتروجين التي تم العثور عليها أثناء تخمير النبيذ للتحقيق في الإدارة.للحصول على نقاط مختلفة لأخذ العينات والخصائص البيولوجية معلمات – النمو وأنماط استهلاك النيتروجين وملف التعريف ?…

Discussion

التحديد الكمي لتقسيم المركبات عن طريق شبكات الأيضية باستخدام تجارب التتبع النظائري نهج واعدة لفهم عملية الأيض الميكروبي. هذه المنهجية، بينما طبقت بنجاح مع واحد أو اثنين من ركائز المسمى، لا يمكن حاليا تنفيذ دراسة أيض مصادر مختلفة باستخدام نظائر عنصري مسماة متعددة (أي، ركائز اثنين أو …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن نشكر موريت جان روش وديكين سيلفي وجان-ماري ساباليروليس للمساهمة في تصور نظام الروبوتية ساعد التخمير وبردال مارتين، نيكولا بوفييه وباسكال بريال لتقديم الدعم التقني لهم. التمويل لهذا المشروع كان قدمت دي وزارة التعليم الوطني، de la البحوث وتكنولوجي de la.

Materials

D-Glucose PanReac 141341.0416
D-Fructose PanReac 142728.0416
DL-Malic acid Sigma Aldrich M0875
Citric acid monohydrate Sigma Aldrich C7129
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P5379
Potassium sulfate Sigma Aldrich P0772
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma Aldrich 230391
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C7902
Sodium chloride Sigma Aldrich S9625
Ammonium chloride Sigma Aldrich A4514
Sodium hydroxide Sigma Aldrich 71690
Manganese sulfate monohydrate Sigma Aldrich M7634
Zinc sulfate heptahydrate Sigma Aldrich Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate Sigma Aldrich C7631
Potassium iodine Sigma Aldrich P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate Sigma Aldrich C3169
Boric acid Sigma Aldrich B7660
Ammonium heptamolybdate Sigma Aldrich A7302
Myo-inositol Sigma Aldrich I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma Aldrich 21210
Thiamine, hydrochloride Sigma Aldrich T4625
Nicotinic acid Sigma Aldrich N4126
Pyridoxine Sigma Aldrich P5669
Biotine Sigma Aldrich B4501
Ergostérol Sigma Aldrich E6510
Tween 80 Sigma Aldrich P1754
Ethanol absolute VWR Chemicals 101074F
Iron (III) chloride hexahydrate Sigma Aldrich 236489
L-Aspartic acid Sigma Aldrich A9256
L-Glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L-Alanine Sigma Aldrich A7627
L-Arginine Sigma Aldrich A5006
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
L-Glutamine Sigma Aldrich G3126
Glycine Sigma Aldrich G7126
L-Histidine Sigma Aldrich H8000
L-Isoleucine Sigma Aldrich I2752
L-Leucine Sigma Aldrich L8000
L-Lysine Sigma Aldrich L5501
L-Methionine Sigma Aldrich M9625
L-Phenylalanine Sigma Aldrich P2126
L-Proline Sigma Aldrich P0380
L-Serine Sigma Aldrich S4500
L-Threonine Sigma Aldrich T8625
L-Tryptophane Sigma Aldrich T0254
L-Tyrosine Sigma Aldrich T3754
L-Valine Sigma Aldrich V0500
13C5-L-Valine Eurisotop CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine Eurisotop CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride Eurisotop NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine Eurisotop NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine Eurisotop NLM-396-PK
Ethyl acetate Sigma Aldrich 270989
Ethyl propanoate Sigma Aldrich 112305
Ethyl 2-methylpropanoate Sigma Aldrich 246085
Ethyl butanoate Sigma Aldrich E15701
Ethyl 2-methylbutanoate Sigma Aldrich 306886
Ethyl 3-methylbutanoate Sigma Aldrich 8.08541.0250
Ethyl hexanoate Sigma Aldrich 148962
Ethyl octanoate Sigma Aldrich W244910
Ethyl decanoate Sigma Aldrich W243205
Ethyl dodecanoate Sigma Aldrich W244112
Ethyl lactate Sigma Aldrich W244015
Diethyl succinate Sigma Aldrich W237701
2-methylpropyl acetate Sigma Aldrich W217514
2-methylbutyl acetate Sigma Aldrich W364401
3-methyl butyl acetate Sigma Aldrich 287725
2-phenylethyl acetate Sigma Aldrich 290580
2-methylpropanol Sigma Aldrich 294829
2-methylbutanol Sigma Aldrich 133051
3-methylbutanol Sigma Aldrich 309435
Hexanol Sigma Aldrich 128570
2-phenylethanol Sigma Aldrich 77861
Propanoic acid Sigma Aldrich 94425
Butanoic acid Sigma Aldrich 19215
2-methylpropanoic acid Sigma Aldrich 58360
2-methylbutanoic acid Sigma Aldrich 193070
3-methylbutanoic acid Sigma Aldrich W310212
Hexanoic acid Sigma Aldrich 153745
Octanoic acid Sigma Aldrich W279900
Decanoic acid Sigma Aldrich W236403
Dodecanoic acid Sigma Aldrich L556
Fermentor 1L Legallais AT1357 Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system Dominique Deutscher 029311
Fermenters (250 ml) Legallais AT1352 Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes Sarstedt 62.554.502
Fermentation locks Legallais AT1356 Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract Becton, Dickinson and Company 212750
BactoPeptone Becton, Dickinson and Company 211677
Incubator shaker Infors HT
Particle Counter Beckman Coulter 6605697 Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge Jouan GR412
Plate Butler Robotic system Lab Services BV PF0X-MA Automatic instrument
Plate Butler Software Lab Services BV Robot monitor software
RobView In-house developed calculation software
My SQL International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers Thermo Fisher Scientific 50088009 String Drive 60
BenchBlotter platform rocker Dutscher 60903
Ammonia enzymatic kit R-Biopharm AG 5390
Spectrophotometer cuvettes VWR 634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400 Secomam
Amino acids standards physiological – acidics and neutrals Sigma Aldrich A6407
Amino acids standards physiological – basics Sigma Aldrich A6282
Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent Biochrom BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid Sigma Aldrich S2130
Norleucine Sigma Aldrich N1398
Biochrom 30 AAA Biochrom
EZChrom Elite Biochrom Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium Biochrom BC80-6002-47 Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV Merck Millipore SLGVX13NL Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL VWR 514-4157 Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini Millipore XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm VWR 611-1380
Precision balance Mettler Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried Merck 1029310161 (max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven Legallais
Pierce BCA protein assay kit Interchim UP40840A
Formic acid Fluka 94318
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure Merck 1003171000 Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer Biochrom 80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids Sigma Aldrich AAS18
L-Methionine sulfone Sigma Aldrich M0876
L-Cysteic acid monohydrate Sigma Aldrich 30170
Pyrex glass culture tubes Sigma Aldrich Z653586
Pyridine Acros Organics 131780500 99% Extrapure
Ethyl chloroformate Sigma Aldrich 23131
Dichloromethane Sigma Aldrich 32222
Vials Sigma Aldrich 854165
Microinserts for 1.5ml vials Sigma Aldrich SU860066
GC/MS Agilent Technologies 5890 GC/5973 MS
Chemstation Agilent Technologies Instrument control and data analysis software
Methanol Sigma Aldrich 34860 Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998 ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal Sigma Aldrich 394963
BSTFA Sigma Aldrich 33024
DB-17MS column Agilent Technologies 122-4731 30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous Sigma Aldrich 238597
Technical nitrogen Air products 14629
Zebron ZB-WAX column Phenomenex 7HG-G007-11 30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP Air products 26699
Glass Pasteur pipettes VWR 612-1702

References

  1. Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts. Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).
  2. Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression. J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).
  3. Wiechert, W. 13C metabolic flux analysis. Metab Eng. 3, 195-206 (2001).
  4. Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints. Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).
  5. Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments. BMC Bioinformatics. 9, 266 (2008).
  6. Zamboni, N. 13C metabolic flux analysis in complex systems. Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).
  7. Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis. Biochimie. 91, 697-702 (2009).
  8. Quek, L. -. E., Dietmair, S., Krömer, J. O., Nielsen, L. K. Metabolic flux analysis in mammalian cell culture. Metab Eng. 12, 161-171 (2010).
  9. Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value. J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).
  10. Magasanik, B., Kaiser, C. A. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 290, 1-18 (2002).
  11. Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190, 885-929 (2012).
  12. Cooper, T. G., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 39-99 (1982).
  13. Jones, E. W., Fink, G. R., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 182-299 (1982).
  14. Hazelwood, L. A., Daran, J. -. M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism. Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).
  15. Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions. J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).
  16. Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network. Genome Res. 13, 244-253 (2003).
  17. Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments. Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).

Play Video

Cite This Article
Bloem, A., Rollero, S., Seguinot, P., Crépin, L., Perez, M., Picou, C., Camarasa, C. Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources. J. Vis. Exp. (131), e56393, doi:10.3791/56393 (2018).

View Video