זרימת עבודה המבוסס על השילוב של מעקב איזוטרופי ניסויים כדי לחקור את חילוף החומרים מיקרוביאלית של מקורות מזון רבים

Summary

פרוטוקול זה מתאר תהליך ניסוי לחקור באופן כמותי ומקיף על חילוף החומרים של מקורות מזון רבים. זרימת עבודה זו, המבוססת על שילוב של ניסויים מעקב איזוטרופי שגרת אנליטית, מאפשר את גורלו של חומרים מזינים נצרך המקור מטבולית של מולקולות synthetized על-ידי מיקרואורגניזמים נקבע.

Abstract

מחקרים בתחום המיקרוביולוגיה להסתמך על ביצוע מגוון רחב של מתודולוגיות. בפרט, פיתוח שיטות המתאימות תורמת באופן משמעותי במתן ידע נרחב על חילוף החומרים של המיקרואורגניזמים הגדלים בתקשורת כימית מוגדרים המכילים חנקן ייחודי ומקורות פחמן. לעומת זאת, הניהול באמצעות חילוף החומרים ממספר מקורות מזון, למרות נוכחותם רחבה בסביבה טבעית או תעשייתית, נשאר כמעט שאינו גלוי. המצב הזה הוא בעיקר בגלל חוסר של מתודולוגיות מתאימים, שפוגעת חקירות.

אנחנו מדווחים על אסטרטגיית ניסיוני לחקור באופן כמותי ומקיף איך חילוף החומרים פועל כאשר התזונתי מסופק הוא תערובת של מולקולות שונות, קרי, משאב מורכבים. כאן, אנו מתארים את היישום שלה לשם הערכת חלוקת ממספר מקורות חנקן דרך הרשת מטבולית שמרים. זרימת העבודה משלב מידע שהתקבל במהלך איזוטופ יציב מעקב ניסויים באמצעות שנבחרו ¹³C – או ¹⁵התווית על-ידי N סובסטרטים. תחילה מורכבת fermentations מקבילים, לשחזור במדיום אותו, הכולל תערובת של מולקולות המכילות N; עם זאת, מקור חנקן שנבחר מסומן בכל פעם. שילוב של תהליכים אנליטיים (HPLC, GC-MS) מיושמת כדי להעריך את הדפוסים תיוג של תרכובות יישוב וכדי לכמת את צריכת ושחזור של מצעים בשנת מטבוליטים אחרים. ניתוח משולב של ערכת הנתונים השלם מספק מבט על גורלם של סובסטרטים נצרך בתוך התאים. גישה זו דורשת פרוטוקול מדויק עבור האוסף של דוגמאות – הקל על-ידי מערכת בסיוע רובוט לניטור המקוון של fermentations – ואת ההישג של אינספור ניתוחים גוזלת זמן. למרות אילוצים אלה, זה מותר הבנה, בפעם הראשונה, חלוקת מקורות חנקן רבים ברחבי הרשת מטבולית שמרים. מבואר הפצה מחדש של חנקן ממקורות שופע יותר לכיוון N-תרכובות אחרות ואנו נחוש את המקורות מטבולית של מולקולות נדיפות וחומצות אמינו proteinogenic.

Introduction

ההבנה כיצד פועלת מטבוליזם מיקרוביאלי היא סוגיה מרכזית על עיצוב האתר של אסטרטגיות יעילות כדי לשפר תהליכי תסיסה, לווסת את הייצור של תרכובות fermentative. ההתקדמות גנומיקה, גנומיקה תפקודית בשני עשורים האחרונים אלו תרמו במידה רבה הרחבת הידע של הטופולוגיה של רשתות מטבוליות של מיקרואורגניזמים רבים. הגישה למידע זה הוביל לפיתוח גישות המטרה עבור סקירה מקיפה של תפקוד התאים¹. מתודולוגיות אלה לעיתים קרובות לסמוך על פרשנות המבוססת על מודל של פרמטרים מדידים. נתונים ניסיוני אלה כוללים, מצד אחד, ספיגת מטבוליט וקצבי ייצור ו, מצד שני, ניסויים כמותיים תאיים המתקבל איזוטופ מעקב. נתונים אלה מספקים מידע חיוני עבור ניכוי של הפעילות ויוו של מסלולים שונים הרשת המוגדרות מטבוליים^2,3,4. כיום, טכניקות אנליטיות זמין רק לאפשר את איתור מדויק של תיוג דפוסים של מולקולות בעת שימוש איזוטופ רכיב אחד ואולי גם כאשר תיוג במשותף עם שני אלמנטים איזוטרופי. יתר על כן, תחת רוב תנאי הגידול, מקור פחמן מורכבת רק אחד או שניים-תרכובות. כתוצאה מכך, גישות המבוסס על ¹³C-איזוטרופי קליעים נותבים של פחמן סובסטרטים נרחב ובהצלחה הוחלו לפתח הבנה מלאה של פחמן רשת מטבולית פעולות^{5,6,7 ,8}.

לעומת זאת, רבים בסביבות טבעיים ותעשייתיים, המשאב חנקן זמין התומך צמיחת חיידקים מורכב לעיתים קרובות של מגוון רחב של מולקולות. לדוגמה, במהלך התסיסה יין או בירה, חנקן מסופק הוא תערובת של 18 חומצות אמינו, אמוניום ריכוזים משתנים⁹. זה מגוון של תרכובות N הנגישים עבור אנאבוליזם הופך תנאים אלה מדיה מורכבת מאוד שונים מאלה הנפוץ עבור מחקרים פיזיולוגיים, כמו האחרון מושגות באמצעות מקור ייחודי של חנקן, בדרך כלל אמוניום.

בסך הכל, הפנימו עשוי להיות שולבו חלבונים או catabolized ישירות תרכובות חנקן. מבנה הרשת של חילוף החומרים חנקן מיקרואורגניזמים רבים, כולל את השמרים האפייה, מורכב מאוד בהתאם המגוון של סובסטרטים. סכמטי, מערכת זו מבוססת על השילוב של הליבה המרכזית של חילוף החומרים של חנקן אשר מזרז את interconversion של גלוטמין, גלוטמט וα-ketoglutarate^10,11, עם הטרנסאמינאז ורמת deaminases. דרך רשת זו, אמין קבוצות אמוניום או חומצות אמיניות אחרות נאספים ושוחררה חומצות α-קטו. Intermediates אלה הם גם synthetized עד^12,פחמן מרכזי חילוף החומרים (CCM)¹³. זה מספר רב של תגובות מסועף, intermediates, מעורב קטבוליזם של מקורות חנקן אקסוגני והן את אנאבוליזם proteinogenic חומצות אמינו, ממלא את הדרישות anabolic של התאים. הפעילות דרך המסלולים מחוברים שונים תוצאות גם הפרשה של מטבוליטים. בפרט, חומצות α-קטו ייתכן שתנותב דרך ארליך בשביל לייצר כהלים גבוה יותר, שלהם אצטט אסתר נגזרים¹⁴, אשר חיוני כתורמים הפרופילים חושית של מוצרים. לאחר מכן, איך פועל חנקן מטבוליזם תפקיד המפתח לייצור ביומסה, היווצרות של מולקולות נדיפות (ארומה).

תגובות, אנזימים, גנים המעורבים בחילוף החומרים חנקן מתוארים בהרחבה בספרות. עם זאת, סוגיית חלוקת מקורות חנקן רבים ברחבי רשת מטבולית לא כבר טופלה. ישנן שתי סיבות עיקריות להסביר חוסר מידע. ראשית, על רקע המורכבות חשוב של הרשת חילוף החומרים חנקן, כמות גדולה של נתונים כמותיים נדרשת עבור הבנה מלאה של הפעולה שלו, זה לא היה זמין עד עכשיו. שנית, רבים ניסיוני אילוצים ומגבלות של שיטות אנליטיות מנעו את יישום גישות ששימשו בעבר הבהרה של הפונקציה CCM.

כדי להתגבר על בעיות אלה, בחרנו לפתח גישה ברמת המערכת המבוסס על הפיוס של נתונים מתוך סדרה של ניסויים איזוטרופי מעקב. זרימת העבודה כוללת:
-קבוצת fermentations מתבצעת תחת באותם תנאים סביבתיים, בעוד מקור מזין שנבחר שונה (סובסטרט) נקראת בכל פעם.
-שילוב של תהליכים אנליטיים (HPLC, GC-MS) לקביעת מדויק, בשלבים שונים של התסיסה, של ריכוז המצע שכותרתו וריכוז שיורית והעשרה איזוטרופי של תרכובות הנגזרים קטבוליזם של מולקולת שכותרתו, כולל ביומסה נגזר.
-חישוב של האיזון מסה ו איזוטרופי לכל נצרך מולקולה שכותרתו, ניתוח משולב נוסף של ערכת הנתונים כדי לקבל סקירה הכללית של ההנהלה של מקורות מזון רבים על-ידי מיקרואורגניזמים באמצעות הקביעה של יחסי גודל השטף .

כדי להחיל מתודולוגיה זו, ישולם תשומת לב להתנהגות לשחזור של הזן/בקטריה בין תרבויות. יתר על כן, יש לקחת דגימות מתרבויות שונות במהלך התקדמות התסיסה מוגדרים היטב אותו. עבודה ניסיונית דיווח בכתב היד, מערכת בסיוע רובוט משמש לניטור המקוון של fermentations להביא בחשבון אילוצים אלה.

יתר על כן, זה חיוני לבחור סט מצעים עם תוויות (מתחם טבע, המיקום של תיוג) המתאים לדון בבעיית המדעי של המחקר. . הנה, ¹⁵התווית על-ידי N אמוניום, גלוטמין וארגינין נבחרו שלושה מקורות חנקן העיקריים שנמצאו מיץ ענבים. פעולה זו מותרת הערכת הדפוס של חנקן הפצה מחדש של תרכובות נצרך כדי חומצות האמינו את proteinogenic. אנחנו נועד גם כדי לחקור את גורלו של עמוד השדרה פחמן של חומצות האמינו נצרך את ותרומתם הייצור של מולקולות נדיפות. לפגוש את המטרה, בצורה אחידה ¹³התווית על-ידי C לאוצין, איזולאוצין, תראונין, ולין נכללו במחקר כמו חומצות אמינו הנגזרים intermediates העיקריים של הנתיב ארליך.

בסך הכל, באופן כמותי חרשנו שבו שמרים מנהל משאב חנקן מורכבים, בעזרת חנקן אקסוגני מקורות כדי למלא את הדרישות anabolic שלה במהלך התסיסה בעת הסרת בנוסף עודף של פחמן מבשרי כמו מולקולות נדיפות. ניתן להחיל את הליך ניסיוני דיווח בעיתון הזה לחקור מקורות תזונתיים מרובים אחרים בשימוש על ידי כל מיקרואורגניזם אחר. זה נראה גישה המתאים לניתוח של ההשפעה של הרקע הגנטי או תנאי הסביבה על התנהגות מטבולית של מיקרואורגניזמים.

Protocol

1. תסיסה ודגימה הכנת fermenters ומדיההערה: כל fermentations מתבצעות בחוץ במקביל, תוך שימוש המתח אותו, באותו כימית מוגדר בינוני סינתטי (SM, קומפוזיציה הניתנים טבלה 1), אשר כוללת תערובת של אמוניה וחומצות אמינו כמו חנקן ממקורות15. עבור כל התסיסה, תרכובת חנקן אחד מסופק ב…

Representative Results

תרשים 3 מציג תרשים סכימטי של זרימת העבודה שיושמה כדי לחקור את הניהול על ידי שמרים של מקורות חנקן מרובות שנמצאו במהלך התסיסה היין.עבור נקודות שונות של הדגימה, המאפיינים ביולוגי פרמטרי – צמיחה, דפוסי צריכת החנקן לפרופיל של proteinogenic חומצות אמינו – הצג הפאר?…

Discussion

לכימות חלוקת תרכובות דרך רשתות מטבוליות באמצעות מעקב איזוטרופי הניסויים היא גישה מבטיחה להבנת פעולת חילוף החומרים מיקרוביאלי. מתודולוגיה זו, בעוד הוחלו בהצלחה עם מצעים עם תוויות אחד או שניים, כעת אפשרות ליישם ללמוד מטבוליזם של מקורות שונים באמצעות מספר איזוטופים אלמנטלים שכותרתו (קרי<…

Materials

D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	230391
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9625
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A4514
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	71690
Manganese sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	M7634
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma Aldrich	C7631
Potassium iodine	Sigma Aldrich	P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C3169
Boric acid	Sigma Aldrich	B7660
Ammonium heptamolybdate	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inositol	Sigma Aldrich	I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma Aldrich	21210
Thiamine, hydrochloride	Sigma Aldrich	T4625
Nicotinic acid	Sigma Aldrich	N4126
Pyridoxine	Sigma Aldrich	P5669
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Ergostérol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Ethanol absolute	VWR Chemicals	101074F
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	236489
L-Aspartic acid	Sigma Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanine	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G3126
Glycine	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidine	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Aldrich	L8000
L-Lysine	Sigma Aldrich	L5501
L-Methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Sigma Aldrich	P2126
L-Proline	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptophane	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrosine	Sigma Aldrich	T3754
L-Valine	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valine	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine	Eurisotop	NLM-396-PK
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	270989
Ethyl propanoate	Sigma Aldrich	112305
Ethyl 2-methylpropanoate	Sigma Aldrich	246085
Ethyl butanoate	Sigma Aldrich	E15701
Ethyl 2-methylbutanoate	Sigma Aldrich	306886
Ethyl 3-methylbutanoate	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Ethyl hexanoate	Sigma Aldrich	148962
Ethyl octanoate	Sigma Aldrich	W244910
Ethyl decanoate	Sigma Aldrich	W243205
Ethyl dodecanoate	Sigma Aldrich	W244112
Ethyl lactate	Sigma Aldrich	W244015
Diethyl succinate	Sigma Aldrich	W237701
2-methylpropyl acetate	Sigma Aldrich	W217514
2-methylbutyl acetate	Sigma Aldrich	W364401
3-methyl butyl acetate	Sigma Aldrich	287725
2-phenylethyl acetate	Sigma Aldrich	290580
2-methylpropanol	Sigma Aldrich	294829
2-methylbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-methylbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-phenylethanol	Sigma Aldrich	77861
Propanoic acid	Sigma Aldrich	94425
Butanoic acid	Sigma Aldrich	19215
2-methylpropanoic acid	Sigma Aldrich	58360
2-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	193070
3-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	W310212
Hexanoic acid	Sigma Aldrich	153745
Octanoic acid	Sigma Aldrich	W279900
Decanoic acid	Sigma Aldrich	W236403
Dodecanoic acid	Sigma Aldrich	L556
Fermentor 1L	Legallais	AT1357	Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system	Dominique Deutscher	029311
Fermenters (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes	Sarstedt	62.554.502
Fermentation locks	Legallais	AT1356	Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Incubator shaker	Infors HT
Particle Counter	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
Plate Butler Robotic system	Lab Services BV	PF0X-MA	Automatic instrument
Plate Butler Software	Lab Services BV		Robot monitor software
RobView			In-house developed calculation software
My SQL			International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter platform rocker	Dutscher	60903
Ammonia enzymatic kit	R-Biopharm AG	5390
Spectrophotometer cuvettes	VWR	634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400	Secomam
Amino acids standards physiological – acidics and neutrals	Sigma Aldrich	A6407
Amino acids standards physiological – basics	Sigma Aldrich	A6282
Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent	Biochrom	BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid	Sigma Aldrich	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm	VWR	611-1380
Precision balance	Mettler		Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried	Merck	1029310161	(max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven	Legallais
Pierce BCA protein assay kit	Interchim	UP40840A
Formic acid	Fluka	94318
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure	Merck	1003171000	Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer	Biochrom	80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids	Sigma Aldrich	AAS18
L-Methionine sulfone	Sigma Aldrich	M0876
L-Cysteic acid monohydrate	Sigma Aldrich	30170
Pyrex glass culture tubes	Sigma Aldrich	Z653586
Pyridine	Acros Organics	131780500	99% Extrapure
Ethyl chloroformate	Sigma Aldrich	23131
Dichloromethane	Sigma Aldrich	32222
Vials	Sigma Aldrich	854165
Microinserts for 1.5ml vials	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Instrument control and data analysis software
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal	Sigma Aldrich	394963
BSTFA	Sigma Aldrich	33024
DB-17MS column	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous	Sigma Aldrich	238597
Technical nitrogen	Air products	14629
Zebron ZB-WAX column	Phenomenex	7HG-G007-11	30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP	Air products	26699
Glass Pasteur pipettes	VWR	612-1702