कार्यप्रवाह Isotopic अनुरेखक प्रयोगों के संयोजन पर आधारित कई पोषक तत्वों के स्रोतों के माइक्रोबियल चयापचय की जांच करने के लिए
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया के लिए मात्रात्मक और व्यापक कई पोषक तत्वों के स्रोतों के चयापचय की जांच । इस कार्यप्रवाह, isotopic अनुरेखक प्रयोगों और एक विश्लेषणात्मक प्रक्रिया के संयोजन पर आधारित है, भस्म पोषक तत्वों के भाग्य और सूक्ष्मजीवों द्वारा synthetized अणुओं के चयापचय मूल निर्धारित किया जा करने के लिए अनुमति देता है.
Abstract
माइक्रोबायोलॉजी के क्षेत्र में अध्ययन के तरीके की एक विस्तृत श्रृंखला के कार्यांवयन पर भरोसा करते हैं । विशेष रूप से, उचित तरीकों के विकास में काफी रासायनिक परिभाषित अद्वितीय नाइट्रोजन और कार्बन स्रोतों युक्त मीडिया में बढ़ रही सूक्ष्मजीवों के चयापचय के व्यापक ज्ञान प्रदान करने के लिए योगदान देता है । इसके विपरीत, कई पोषक तत्वों के स्रोतों के चयापचय के माध्यम से प्रबंधन, प्राकृतिक या औद्योगिक वातावरण में अपनी व्यापक उपस्थिति के बावजूद, वस्तुतः बेरोज़गार रहता है । यह स्थिति मुख्य रूप से उपयुक्त तरीके की कमी की वजह से है, जो जांच में बाधा डालती है.
हम मात्रात्मक और व्यापक रूप से पता लगाने के लिए एक प्रायोगिक कार्यनीति की रिपोर्ट करते हैं कि जब एक पोषक तत्व विभिन्न अणुओं, यानी, एक जटिल संसाधन के मिश्रण के रूप में प्रदान किया जाता है, तो चयापचय कैसे संचालित होता है. यहां, हम खमीर चयापचय नेटवर्क के माध्यम से कई नाइट्रोजन स्रोतों के विभाजन का आकलन करने के लिए अपने आवेदन का वर्णन । कार्यप्रवाह चयनित 13C-या 15N-लेबल वाले सब्सट्रेट का उपयोग कर स्थिर आइसोटोप अनुरेखक प्रयोगों के दौरान प्राप्त जानकारी को संयोजित करता है. यह पहले एक ही माध्यम है, जो N-युक्त अणुओं का मिश्रण भी शामिल में समानांतर और प्रतिलिपि किण्वन के होते हैं; हालांकि, एक चयनित नाइट्रोजन स्रोत हर बार लेबल है । विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं का एक संयोजन (HPLC, जीसी-MS) लक्षित यौगिकों के लेबलिंग पैटर्न का आकलन करने के लिए और अन्य चयापचयों में सब्सट्रेट्स की खपत और वसूली को बढ़ाता है के लिए लागू किया जाता है. पूर्ण डेटासेट के एक एकीकृत विश्लेषण कोशिकाओं के भीतर भस्म सब्सट्रेट के भाग्य का एक सिंहावलोकन प्रदान करता है. इस दृष्टिकोण नमूनों के संग्रह के लिए एक सटीक प्रोटोकॉल की आवश्यकता है-एक रोबोट द्वारा सुविधा-किण्वन की ऑनलाइन निगरानी के लिए प्रणाली की सहायता-और कई समय लेने वाले विश्लेषण की उपलब्धि । इन बाधाओं के बावजूद, यह समझने की अनुमति दी, पहली बार के लिए, खमीर चयापचय नेटवर्क भर में एकाधिक नाइट्रोजन स्रोतों के विभाजन । हमने अन्य एन-यौगिकों की ओर अधिक प्रचुर स्रोतों से नाइट्रोजन के पुनर्वितरण का आविर्भाव किया और अस्थिर अणुओं और proteinogenic अमीनो अम्लों के चयापचय मूल का निर्धारण किया.
Introduction
समझ कैसे माइक्रोबियल चयापचय संचालित कुशल रणनीतियों के डिजाइन के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा किण्वन प्रक्रियाओं में सुधार और fermentative यौगिकों के उत्पादन को मिलाना है । इन पिछले दो दशकों में जीनोमिक्स और कार्यात्मक जीनोमिक्स में अग्रिम मोटे तौर पर कई सूक्ष्मजीवों में चयापचय नेटवर्क के टोपोलॉजी के ज्ञान का विस्तार करने के लिए योगदान दिया । सेलुलर समारोह1के एक व्यापक सिंहावलोकन के लिए लक्ष्य दृष्टिकोण के विकास के लिए नेतृत्व इस जानकारी के लिए उपयोग । इन तरीकों अक्सर एक मॉडल पर निर्भर औसत दर्जे का मापदंडों की व्याख्या आधारित है । इन प्रयोगात्मक डेटा में शामिल हैं, एक हाथ पर, metabolite और उत्पादन दर और, दूसरी ओर, मात्रात्मक intracellular जानकारी आइसोटोप अनुरेखक प्रयोगों से प्राप्त की है. इन आंकड़ों में एक परिभाषित चयापचय नेटवर्क2,3,4में विभिंन रास्ते के vivo में गतिविधि की कटौती के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करते हैं । वर्तमान में, उपलब्ध विश्लेषणात्मक तकनीक केवल अणुओं के लेबलिंग पैटर्न का सटीक पता लगाने जब एक एकल तत्व आइसोटोप का उपयोग कर और संभवतः जब सह दो isotopic तत्वों के साथ लेबलिंग सक्षम करें । इसके अलावा, सबसे अधिक वृद्धि की स्थिति के तहत, कार्बन स्रोत केवल एक या दो यौगिकों के होते हैं । नतीजतन, 13सी के आधार पर दृष्टिकोण कार्बन सब्सट्रेट से isotopic अनुरेखकों व्यापक रूप से और सफलतापूर्वक कार्बन चयापचय नेटवर्क आपरेशनों के एक पूर्ण समझ को विकसित करने के लिए लागू किया गया5,6,7 ,8.
इसके विपरीत, कई प्राकृतिक और औद्योगिक वातावरण में, माइक्रोबियल विकास का समर्थन करता है कि उपलब्ध नाइट्रोजन संसाधन अक्सर अणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला से बना है । उदाहरण के लिए, शराब या बियर किण्वन के दौरान, नाइट्रोजन 18 अमीनो एसिड और अमोनियम के एक मिश्रण के रूप में चर सांद्रता9पर प्रदान की जाती है । N यौगिकों कि उपचय के लिए सुलभ है इन जटिल मीडिया की स्थिति आमतौर पर शारीरिक अध्ययन के लिए इस्तेमाल उन लोगों से बहुत अलग बनाता है के इस सरणी, के रूप में बाद नाइट्रोजन का एक अनूठा स्रोत, आमतौर पर अमोनियम का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं ।
कुल मिलाकर, आंतरिक नाइट्रोजन यौगिकों सीधे प्रोटीन या catabolized में शामिल किया जा सकता है । कई सूक्ष्मजीवों में नाइट्रोजन चयापचय के नेटवर्क संरचना, खमीर Saccharomyces cerevisiaeसहित, सब्सट्रेट की विविधता के अनुसार बहुत जटिल है । योजनाबद्ध रूप से, यह प्रणाली नाइट्रोजन चयापचय के केंद्रीय कोर के संयोजन पर आधारित है जो glutamine, ग्लूटामेट, और α-ketoglutarate10,11, ट्रांसएमिनेस और deaminases के साथ catalyzes का रूपांतरण करते हैं । इस नेटवर्क के माध्यम से अमोनियम या अन्य अमीनो एसिड से अमीन समूह इकट्ठे होते हैं और α-कीटो एसिड जारी किया जाता है । ये मध्यवर्ती केंद्रीय कार्बन चयापचय (सीसीएम)१२,१३के माध्यम से भी synthetized हैं. शाखाई प्रतिक्रियाओं और मध्यवर्ती की यह बड़ी संख्या, दोनों catabolism में शामिल exogenous नाइट्रोजन स्रोतों और proteinogenic अमीनो एसिड की उपचय, कोशिकाओं की anabolic आवश्यकताओं को पूरा करता है. इन अलग जुड़े मार्गों के माध्यम से गतिविधि भी चयापचयों के उत्सर्जन में परिणाम है । विशेष रूप से, α-कीटो एसिड Ehrlich मार्ग के माध्यम से पुनर्निर्देशित किया जा सकता है उच्च शराब और उनके एसीटेट एस्टर डेरिवेटिव14है, जो उत्पादों की संवेदी प्रोफाइल के लिए आवश्यक योगदानकर्ताओं के उत्पादन के लिए । इसके बाद, कैसे नाइट्रोजन चयापचय संचालित बायोमास उत्पादन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और अस्थिर अणुओं (सुगंध) के गठन ।
प्रतिक्रियाओं, एंजाइमों, और नाइट्रोजन चयापचय में शामिल जीन बड़े पैमाने पर साहित्य में वर्णित हैं । हालांकि, एक चयापचय नेटवर्क भर में एकाधिक नाइट्रोजन स्रोतों के वितरण के मुद्दे को अभी तक संबोधित नहीं किया गया है । वहां दो मुख्य कारण है कि जानकारी के इस कमी की व्याख्या कर रहे हैं । सबसे पहले, नाइट्रोजन चयापचय नेटवर्क की महत्वपूर्ण जटिलता को ध्यान में रखते हुए, मात्रात्मक डेटा की एक बड़ी राशि है कि अब तक उपलब्ध नहीं था अपने अभियान की एक पूरी समझ के लिए आवश्यक है । दूसरा, कई प्रयोगात्मक बाधाओं और विश्लेषणात्मक तरीकों की सीमाओं दृष्टिकोण है कि पहले सीसीएम समारोह के elucidation के लिए इस्तेमाल किया गया के कार्यांवयन को रोका ।
इन समस्याओं को दूर करने के लिए, हम isotopic अनुरेखक प्रयोगों की एक श्रृंखला से डेटा की सुलह पर आधारित है कि एक प्रणाली स्तर दृष्टिकोण विकसित करने के लिए चुना. कार्यप्रवाह में शामिल हैं:
-एक अलग चयनित पोषक तत्व स्रोत (सब्सट्रेट) हर बार लेबल है, जबकि एक ही पर्यावरण की स्थिति के तहत बाहर किए गए किण्वन का एक सेट ।
-एक सटीक दृढ़ संकल्प के लिए विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं का एक संयोजन (HPLC, जीसी-MS), किण्वन के विभिन्न चरणों में, लेबल सब्सट्रेट और एकाग्रता और यौगिकों कि से प्राप्त कर रहे हैं की isotopic संवर्धन के अवशिष्ट एकाग्रता के catabolism से प्राप्त बायोमास सहित, लेबल अणु की ।
-प्रत्येक भस्म लेबल अणु के लिए बड़े पैमाने पर और isotopic संतुलन और डेटासेट के एक और एकीकृत विश्लेषण प्रवाह अनुपात के निर्धारण के माध्यम से सूक्ष्मजीवों द्वारा कई पोषक तत्वों के स्रोतों के प्रबंधन के एक वैश्विक सिंहावलोकन प्राप्त करने के लिए की गणना .
इस पद्धति को लागू करने के लिए, ध्यान तनाव के प्रतिलिपि व्यवहार करने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए/ इसके अलावा, विभिंन संस्कृतियों से नमूने एक ही अच्छी तरह से परिभाषित किण्वन प्रगति के दौरान लिया जाना चाहिए । प्रायोगिक काम में इस पांडुलिपि में रिपोर्ट, एक रोबोट की सहायता प्रणाली के लिए इन बाधाओं के लिए खाते में किण्वन के ऑनलाइन निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है ।
इसके अलावा, यह लेबल सब्सट्रेट (यौगिक, प्रकृति, और लेबलिंग की स्थिति) है कि अध्ययन की वैज्ञानिक समस्या का पता करने के लिए उपयुक्त है का एक सेट का चयन करने के लिए आवश्यक है । यहां, 15N-लेबल अमोनियम, glutamine, और arginine तीन प्रमुख नाइट्रोजन अंगूर के रस में पाया सूत्रों के रूप में चुना गया । यह proteinogenic अमीनो एसिड के लिए भस्म यौगिकों से नाइट्रोजन पुनर्वितरण के पैटर्न का आकलन करने की अनुमति दी । हम भी भस्म अमीनो एसिड की कार्बन रीढ़ की किस्मत की जांच और अस्थिर अणुओं के उत्पादन के लिए उनके योगदान के उद्देश्य से । इस उद्देश्य को पूरा करने के लिए, समान रूप से 13सी-लेबल leucine, isoleucine, threonine, और वैलिन अध्ययन में एमिनो एसिड है कि Ehrlich मार्ग के प्रमुख मध्यवर्ती से प्राप्त कर रहे है के रूप में शामिल थे ।
कुल मिलाकर, हम मात्रात्मक पता लगाया कैसे खमीर redistributing exogenous नाइट्रोजन स्रोतों से एक जटिल नाइट्रोजन संसाधन का प्रबंधन करने के लिए किण्वन भर में अपने anabolic आवश्यकताओं को पूरा करते हुए इसके अलावा कार्बन के रूप में अग्रदूतों की अतिरिक्त हटाने अस्थिर अणुओं । इस पत्र में बताया प्रयोगात्मक प्रक्रिया अन्य कई पोषक तत्वों किसी भी अंय सूक्ष्मजीवों द्वारा इस्तेमाल की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है । यह सूक्ष्मजीवों के चयापचय व्यवहार पर आनुवंशिक पृष्ठभूमि या पर्यावरणीय परिस्थितियों के प्रभाव के विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त दृष्टिकोण प्रतीत होता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
चयापचय नेटवर्क के माध्यम से यौगिकों के विभाजन को बढ़ाता है isotopic अनुरेखक प्रयोगों का उपयोग माइक्रोबियल चयापचय के संचालन को समझने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है. इस पद्धति, एक या दो लेबल सब्सट्रेट के साथ स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम जीन रॉच Mouret, सिल्वी Dequin और जीन मैरी Sabalyrolles की अवधारणा में योगदान के लिए धंयवाद के लिए रोबोट की सहायता किण्वन प्रणाली और मार्टिन Pradal, निकोलस Bouvier और पास्कल Brial उनके तकनीकी सहायता के लिए । इस परियोजना के लिए धन Ministère de l’Education राष्ट्रीयकरण, de la सूक्ष्म एट डे ला Technologie द्वारा प्रदान किया गया था ।
Materials
| D-Glucose | PanReac | 141341.0416 | |
| D-Fructose | PanReac | 142728.0416 | |
| DL-Malic acid | Sigma Aldrich | M0875 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma Aldrich | C7129 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| Potassium sulfate | Sigma Aldrich | P0772 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 230391 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A4514 | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 71690 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z4750 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | C7631 | |
| Potassium iodine | Sigma Aldrich | P4286 | |
| Cobalt (II) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | C3169 | |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B7660 | |
| Ammonium heptamolybdate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Myo-inositol | Sigma Aldrich | I5125 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma Aldrich | 21210 | |
| Thiamine, hydrochloride | Sigma Aldrich | T4625 | |
| Nicotinic acid | Sigma Aldrich | N4126 | |
| Pyridoxine | Sigma Aldrich | P5669 | |
| Biotine | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Ergostérol | Sigma Aldrich | E6510 | |
| Tween 80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 101074F | |
| Iron (III) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489 | |
| L-Aspartic acid | Sigma Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L-Alanine | Sigma Aldrich | A7627 | |
| L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G7126 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H8000 | |
| L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| L-Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | |
| L-Methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
| L-Phenylalanine | Sigma Aldrich | P2126 | |
| L-Proline | Sigma Aldrich | P0380 | |
| L-Serine | Sigma Aldrich | S4500 | |
| L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tryptophane | Sigma Aldrich | T0254 | |
| L-Tyrosine | Sigma Aldrich | T3754 | |
| L-Valine | Sigma Aldrich | V0500 | |
| 13C5-L-Valine | Eurisotop | CLM-2249-H-0.25 | |
| 13C6-L-Leucine | Eurisotop | CLM-2262-H-0.25 | |
| 15N-Ammonium chloride | Eurisotop | NLM-467-1 | |
| ALPHA-15N-L-Glutamine | Eurisotop | NLM-1016-1 | |
| U-15N4-L-Arginine | Eurisotop | NLM-396-PK | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 270989 | |
| Ethyl propanoate | Sigma Aldrich | 112305 | |
| Ethyl 2-methylpropanoate | Sigma Aldrich | 246085 | |
| Ethyl butanoate | Sigma Aldrich | E15701 | |
| Ethyl 2-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 306886 | |
| Ethyl 3-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 8.08541.0250 | |
| Ethyl hexanoate | Sigma Aldrich | 148962 | |
| Ethyl octanoate | Sigma Aldrich | W244910 | |
| Ethyl decanoate | Sigma Aldrich | W243205 | |
| Ethyl dodecanoate | Sigma Aldrich | W244112 | |
| Ethyl lactate | Sigma Aldrich | W244015 | |
| Diethyl succinate | Sigma Aldrich | W237701 | |
| 2-methylpropyl acetate | Sigma Aldrich | W217514 | |
| 2-methylbutyl acetate | Sigma Aldrich | W364401 | |
| 3-methyl butyl acetate | Sigma Aldrich | 287725 | |
| 2-phenylethyl acetate | Sigma Aldrich | 290580 | |
| 2-methylpropanol | Sigma Aldrich | 294829 | |
| 2-methylbutanol | Sigma Aldrich | 133051 | |
| 3-methylbutanol | Sigma Aldrich | 309435 | |
| Hexanol | Sigma Aldrich | 128570 | |
| 2-phenylethanol | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Propanoic acid | Sigma Aldrich | 94425 | |
| Butanoic acid | Sigma Aldrich | 19215 | |
| 2-methylpropanoic acid | Sigma Aldrich | 58360 | |
| 2-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | 193070 | |
| 3-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | W310212 | |
| Hexanoic acid | Sigma Aldrich | 153745 | |
| Octanoic acid | Sigma Aldrich | W279900 | |
| Decanoic acid | Sigma Aldrich | W236403 | |
| Dodecanoic acid | Sigma Aldrich | L556 | |
| Fermentor 1L | Legallais | AT1357 | Fermenter handmade for fermentation |
| Disposable vacuum filtration system | Dominique Deutscher | 029311 | |
| Fermenters (250 ml) | Legallais | AT1352 | Fermenter handmade for fermentation |
| Sterile tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Fermentation locks | Legallais | AT1356 | Fermetation locks handmade for fermentation |
| BactoYeast Extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | |
| BactoPeptone | Becton, Dickinson and Company | 211677 | |
| Incubator shaker | Infors HT | ||
| Particle Counter | Beckman Coulter | 6605697 | Multisizer 3 Coulter Counter |
| Centrifuge | Jouan | GR412 | |
| Plate Butler Robotic system | Lab Services BV | PF0X-MA | Automatic instrument |
| Plate Butler Software | Lab Services BV | Robot monitor software | |
| RobView | In-house developed calculation software | ||
| My SQL | International source database | ||
| Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers | Thermo Fisher Scientific | 50088009 | String Drive 60 |
| BenchBlotter platform rocker | Dutscher | 60903 | |
| Ammonia enzymatic kit | R-Biopharm AG | 5390 | |
| Spectrophotometer cuvettes | VWR | 634-0678 | |
| Spectrophotometer UviLine 9400 | Secomam | ||
| Amino acids standards physiological – acidics and neutrals | Sigma Aldrich | A6407 | |
| Amino acids standards physiological – basics | Sigma Aldrich | A6282 | |
| Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent | Biochrom | BC80-6000-06 | |
| Sulfosalycilic acid | Sigma Aldrich | S2130 | |
| Norleucine | Sigma Aldrich | N1398 | |
| Biochrom 30 AAA | Biochrom | ||
| EZChrom Elite | Biochrom | Instrument control and Data analysis software | |
| Ultropac 8 resin Lithium | Biochrom | BC80-6002-47 | Lithium High Resolution Physiological Column |
| Filter Millex GV | Merck Millipore | SLGVX13NL | Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm) |
| Membrane filter PALL | VWR | 514-4157 | Supor-450 47mm 0.45µm |
| Vacuum pump Millivac Mini | Millipore | XF5423050 | |
| Aluminium smooth weigh dish 70mm | VWR | 611-1380 | |
| Precision balance | Mettler | Specifications AE163 | |
| Dimethyl sulfoxid dried | Merck | 1029310161 | (max. 0.025% H2O) SeccoSolv |
| Combustion oven | Legallais | ||
| Pierce BCA protein assay kit | Interchim | UP40840A | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure | Merck | 1003171000 | Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Lithium acetate buffer | Biochrom | 80-2038-10 | |
| Commercial solution of hydrolyzed amino acids | Sigma Aldrich | AAS18 | |
| L-Methionine sulfone | Sigma Aldrich | M0876 | |
| L-Cysteic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 30170 | |
| Pyrex glass culture tubes | Sigma Aldrich | Z653586 | |
| Pyridine | Acros Organics | 131780500 | 99% Extrapure |
| Ethyl chloroformate | Sigma Aldrich | 23131 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 32222 | |
| Vials | Sigma Aldrich | 854165 | |
| Microinserts for 1.5ml vials | Sigma Aldrich | SU860066 | |
| GC/MS | Agilent Technologies | 5890 GC/5973 MS | |
| Chemstation | Agilent Technologies | Instrument control and data analysis software | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Chromasolv, for HPLC |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | ChromasolvPlus, for HPLC |
| N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal | Sigma Aldrich | 394963 | |
| BSTFA | Sigma Aldrich | 33024 | |
| DB-17MS column | Agilent Technologies | 122-4731 | 30m*0.25mm*0.15µm |
| Sodium sulfate, anhydrous | Sigma Aldrich | 238597 | |
| Technical nitrogen | Air products | 14629 | |
| Zebron ZB-WAX column | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m*0.25mm*0.25µm |
| Helium BIP | Air products | 26699 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1702 |
References
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