複数の栄養源の微生物代謝を調査するため同位体トレーサー実験の組み合わせに基づいてワークフロー
Summary
このプロトコルでは、定量的かつ包括的に複数の栄養源の代謝を調査する実験手順について説明します。このワークフローは、同位体トレーサー実験と分析手順の組み合わせに基づいて決定する微生物による消費された栄養素の運命と分子 synthetized の代謝の起源をことができます。
Abstract
微生物学の分野の研究は、幅広い方法論の実装に依存します。特に、適切なメソッドの開発は大幅にユニークな窒素と炭素源を含む化学的に定義されているメディアに成長している微生物の代謝の広範な知識を提供することに貢献しています。対照的に、自然や産業の環境の彼らの広範な存在にもかかわらず、複数の栄養源の代謝を通して管理ほぼ未踏のままです。このような状況は、調査を妨げる適切な方法論の不足のために主にです。
定量的かつ包括的には、異なる分子、すなわち、複雑なリソースの混合物として、栄養が提供されるときの代謝の動作を調べる実験方法を報告する.ここでは、酵母の代謝ネットワークを介して複数の窒素源の分割の評価への応用について述べる。ワークフローは、選択された13c や15N 標識基板を用いた安定同位体トレーサー実験時に得られた情報を組み合わせたものです。それは最初の N を含む分子の混合物が含まれています同じ媒体で並列で再現可能な発酵に成っています。ただし、選択した窒素源は、各時間が付いています。分析的手続 (HPLC、GC-MS) の組み合わせを実装するは、ターゲット化合物のラベリング パターンを評価し、消費および他の代謝産物の基板の回収を定量化します。完全なデータセットの統合的解析は、細胞内で消費された基板の運命の概要を説明します。このアプローチが発酵のオンライン監視用ロボット支援システムによるサンプル-容易のコレクションの正確なプロトコルを必要とする- と多くの時間がかかる解析の成果。これらの制約にもかかわらず、それは酵母の代謝ネットワーク全体で複数の窒素源の分割を初めて理解できました。我々 は他の N 化合物へより豊かな情報源からの窒素の再分配を解明し、揮発性分子とアミノ酸の代謝の起源を決定します。
Introduction
理解微生物代謝の動作方法は、発酵プロセスを改善し、発酵化合物の生産を調節する効率的な戦略の設計にとって重要な問題です。ゲノミクス、これらの最後の 2 つの数十年の機能ゲノミクスの進歩は主多くの微生物の代謝ネットワークのトポロジの知識の拡張に貢献しました。この情報へのアクセスは、1細胞機能の包括的な概観を目指すアプローチの開発につながった。これらの方法論はしばしばモデルに基づく測定可能なパラメーターの解釈に依存しています。これらの実験データは一方で、代謝産物の吸収と生産率、そして、同位体トレーサーから得られる定量的な細胞内の情報が、他の一方で、実験します。これらのデータは、定義された代謝ネットワーク2,3,4で異なる経路の体内活動の控除の基本情報を提供します。現在、利用可能な解析技術だけ単一要素の同位体を用いたとき分子のパターンを分類の正確な検出を有効にしておそらく共同 2 つの同位体要素をラベル付けするとき。さらに、ほとんどの成長条件の下で炭素源はのみ 1 つまたは 2 つの化合物の構成します。その結果、炭素基板から13C 同位体トレーサーの手法を用いて広くそして首尾よく適用された炭素代謝ネットワーク操作5,6,7 の完全な理解を開発するには ,8。
対照的に、多くの自然と産業環境微生物の発育をサポートする利用可能な窒素リソースは分子の広い範囲の多くの場合で構成します。たとえば、ワインやビールの発酵中に窒素は 18 のアミノ酸と可変濃度9時アンモニウムの混合物として提供されます。この同化のためのアクセス可能な N 化合物の配列は通常アンモニウム窒素のユニークなソースを使用して、後者が達成、大きく異なる生理学的な研究は、一般的に使用されるこれらの複雑なメディア状況を作る。
全体的にみて、窒素化合物を直接タンパク質に組み込むか異化が内在化しています。酵母を含む多くの微生物の窒素代謝のネットワーク構造は基材の多様性に従って非常に複雑です。図解すると、このシステムは、グルタミン、グルタミン酸、および α-ケトグルタル酸10、11トランスアミナーゼと deaminases の相互変換を触媒する窒素代謝の中核の組み合わせに基づいています。このネットワークを通じてアンモニウムまたは他のアミノ酸のアミン グループを集められ α-ケト酸をリリースします。これらの中間体から中央の炭素代謝 (CCM)12,13synthetized しています。この多数分岐反応と中間体、外因性の窒素源の異化と蛋白質構成アミノ酸の同化作用に関与するは、細胞の同化の要件を満たしています。これらの異なる相互接続されたルート経由でアクティビティは、代謝産物の排泄にもなります。特に、α-ケト酸は、高級アルコールとその酢酸エステル誘導体14製品の感覚のプロファイルに不可欠な貢献を生成するエールリッヒ経路を介してリダイレクトされます。その後、窒素代謝がどのように動作するバイオマス生産と揮発性分子 (香り) の形成に重要な役割を果たしています。
反応、酵素、窒素代謝に関与する遺伝子が広範囲の文献に記載されています。ただし、代謝ネットワーク全体で複数の窒素源の分布の問題がまだ解決されていません。この情報の欠如を説明する 2 つの主な理由があります。まず、窒素代謝ネットワークの重要な複雑さの観点から大量の定量的データは利用できなかったその操作の完全な理解に必要な今まで。第二に、多くの実験的制約と分析法の制限防止 CCM 機能の解明のために以前使用されたアプローチの実装。
これらの問題を克服するために、一連の同位体トレーサー実験からのデータの照合に基づいているシステム レベルのアプローチを開発しました。ワークフローは次のとおりです。
-同じ環境条件の下で発酵のセット実施別選択した栄養源 (基質) はたびにラベルが付いています。
● ラベルの付いた基板と濃度の残留濃度の由来化合物の同位体濃縮発酵の各段階での正確な定量分析法 (HPLC、GC-MS) の組み合わせで派生バイオマスを含む分類された分子の異化。
-それぞれの質量、同位体のバランスの計算消費標識分子と流束比の決定することによって微生物による複数の栄養源の管理のグローバル概要を取得するデータセットのそれ以上の統合解析.
この方法論を適用するには、文化のひずみ/微生物の再現可能な動作に注意を支払わなければなりません。さらに、異なった文化からのサンプルは、同じの明確に定義された発酵進行中に取られなければなりません。本稿で報告した実験的な作品、ロボット支援システムはこれらの制約を考慮して発酵のオンライン監視の使用です。
さらに、研究の科学的な問題に対処する適切なラベル付けされた基板 (化合物、自然とラベルの位置) のセットを選ぶことが不可欠です。ここでは、アルギニン、グルタミン、 15N 標識アンモニアは、グレープ ジュースは、3 つの主要な窒素源として選択されました。これは窒素化合物の消費から蛋白質構成アミノ酸に再分配のパターンを評価する許可。また揮発性分子の生産への貢献と消費されるアミノ酸の炭素骨格の運命を調査することを目指しました。満たすためにこの目的、均一に13C 標識ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシンに含まれていた研究エールリッヒ経路の主要な中間体から派生するアミノ酸として。
全体的に、酵母が外因性窒素源として炭素前駆体の過剰をさらに除去しながら発酵を通してその同化の要件を満たすための再配布によって複雑な窒素リソースを管理する方法を模索して定量的揮発性分子。本稿で報告した実験の手順は、他の微生物によって使用される他の複数の栄養源を調査に適用できます。それは、微生物の代謝に及ぼす遺伝的背景や環境の影響の分析のための適切なアプローチのように見えます。
Protocol
Representative Results
Discussion
微生物代謝の操作を理解するための有望なアプローチは、同位体トレーサー実験による代謝ネットワークを通じて化合物の分配を定量化します。この手法は、1 つまたは 2 つのラベルの付いた基板で正常に適用されている間現在実装できません複数標識元素同位体 (すなわち、2 つ以上の基板) を使用してさまざまなソースの代謝を研究します。確かに、利用可能な分析技術は、共同 2 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ジャン ・ ロッシュ ムレ、シルヴィ Dequin と発酵のロボット支援システムの構想に貢献するジャン = マリー ・ Sabalyrolles とマルティーヌ Pradal、ニコラ ・ ブーヴィエとパスカル Brial テクニカル サポートのために感謝しますこのプロジェクトは、凝った et ミニステール ・ デ ・教育、国立図書館、デ ラによって提供された資金デ ラ テク。
Materials
| D-Glucose | PanReac | 141341.0416 | |
| D-Fructose | PanReac | 142728.0416 | |
| DL-Malic acid | Sigma Aldrich | M0875 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma Aldrich | C7129 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| Potassium sulfate | Sigma Aldrich | P0772 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 230391 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A4514 | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 71690 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z4750 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | C7631 | |
| Potassium iodine | Sigma Aldrich | P4286 | |
| Cobalt (II) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | C3169 | |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B7660 | |
| Ammonium heptamolybdate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Myo-inositol | Sigma Aldrich | I5125 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma Aldrich | 21210 | |
| Thiamine, hydrochloride | Sigma Aldrich | T4625 | |
| Nicotinic acid | Sigma Aldrich | N4126 | |
| Pyridoxine | Sigma Aldrich | P5669 | |
| Biotine | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Ergostérol | Sigma Aldrich | E6510 | |
| Tween 80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 101074F | |
| Iron (III) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489 | |
| L-Aspartic acid | Sigma Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L-Alanine | Sigma Aldrich | A7627 | |
| L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G7126 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H8000 | |
| L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| L-Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | |
| L-Methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
| L-Phenylalanine | Sigma Aldrich | P2126 | |
| L-Proline | Sigma Aldrich | P0380 | |
| L-Serine | Sigma Aldrich | S4500 | |
| L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tryptophane | Sigma Aldrich | T0254 | |
| L-Tyrosine | Sigma Aldrich | T3754 | |
| L-Valine | Sigma Aldrich | V0500 | |
| 13C5-L-Valine | Eurisotop | CLM-2249-H-0.25 | |
| 13C6-L-Leucine | Eurisotop | CLM-2262-H-0.25 | |
| 15N-Ammonium chloride | Eurisotop | NLM-467-1 | |
| ALPHA-15N-L-Glutamine | Eurisotop | NLM-1016-1 | |
| U-15N4-L-Arginine | Eurisotop | NLM-396-PK | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 270989 | |
| Ethyl propanoate | Sigma Aldrich | 112305 | |
| Ethyl 2-methylpropanoate | Sigma Aldrich | 246085 | |
| Ethyl butanoate | Sigma Aldrich | E15701 | |
| Ethyl 2-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 306886 | |
| Ethyl 3-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 8.08541.0250 | |
| Ethyl hexanoate | Sigma Aldrich | 148962 | |
| Ethyl octanoate | Sigma Aldrich | W244910 | |
| Ethyl decanoate | Sigma Aldrich | W243205 | |
| Ethyl dodecanoate | Sigma Aldrich | W244112 | |
| Ethyl lactate | Sigma Aldrich | W244015 | |
| Diethyl succinate | Sigma Aldrich | W237701 | |
| 2-methylpropyl acetate | Sigma Aldrich | W217514 | |
| 2-methylbutyl acetate | Sigma Aldrich | W364401 | |
| 3-methyl butyl acetate | Sigma Aldrich | 287725 | |
| 2-phenylethyl acetate | Sigma Aldrich | 290580 | |
| 2-methylpropanol | Sigma Aldrich | 294829 | |
| 2-methylbutanol | Sigma Aldrich | 133051 | |
| 3-methylbutanol | Sigma Aldrich | 309435 | |
| Hexanol | Sigma Aldrich | 128570 | |
| 2-phenylethanol | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Propanoic acid | Sigma Aldrich | 94425 | |
| Butanoic acid | Sigma Aldrich | 19215 | |
| 2-methylpropanoic acid | Sigma Aldrich | 58360 | |
| 2-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | 193070 | |
| 3-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | W310212 | |
| Hexanoic acid | Sigma Aldrich | 153745 | |
| Octanoic acid | Sigma Aldrich | W279900 | |
| Decanoic acid | Sigma Aldrich | W236403 | |
| Dodecanoic acid | Sigma Aldrich | L556 | |
| Fermentor 1L | Legallais | AT1357 | Fermenter handmade for fermentation |
| Disposable vacuum filtration system | Dominique Deutscher | 029311 | |
| Fermenters (250 ml) | Legallais | AT1352 | Fermenter handmade for fermentation |
| Sterile tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Fermentation locks | Legallais | AT1356 | Fermetation locks handmade for fermentation |
| BactoYeast Extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | |
| BactoPeptone | Becton, Dickinson and Company | 211677 | |
| Incubator shaker | Infors HT | ||
| Particle Counter | Beckman Coulter | 6605697 | Multisizer 3 Coulter Counter |
| Centrifuge | Jouan | GR412 | |
| Plate Butler Robotic system | Lab Services BV | PF0X-MA | Automatic instrument |
| Plate Butler Software | Lab Services BV | Robot monitor software | |
| RobView | In-house developed calculation software | ||
| My SQL | International source database | ||
| Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers | Thermo Fisher Scientific | 50088009 | String Drive 60 |
| BenchBlotter platform rocker | Dutscher | 60903 | |
| Ammonia enzymatic kit | R-Biopharm AG | 5390 | |
| Spectrophotometer cuvettes | VWR | 634-0678 | |
| Spectrophotometer UviLine 9400 | Secomam | ||
| Amino acids standards physiological – acidics and neutrals | Sigma Aldrich | A6407 | |
| Amino acids standards physiological – basics | Sigma Aldrich | A6282 | |
| Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent | Biochrom | BC80-6000-06 | |
| Sulfosalycilic acid | Sigma Aldrich | S2130 | |
| Norleucine | Sigma Aldrich | N1398 | |
| Biochrom 30 AAA | Biochrom | ||
| EZChrom Elite | Biochrom | Instrument control and Data analysis software | |
| Ultropac 8 resin Lithium | Biochrom | BC80-6002-47 | Lithium High Resolution Physiological Column |
| Filter Millex GV | Merck Millipore | SLGVX13NL | Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm) |
| Membrane filter PALL | VWR | 514-4157 | Supor-450 47mm 0.45µm |
| Vacuum pump Millivac Mini | Millipore | XF5423050 | |
| Aluminium smooth weigh dish 70mm | VWR | 611-1380 | |
| Precision balance | Mettler | Specifications AE163 | |
| Dimethyl sulfoxid dried | Merck | 1029310161 | (max. 0.025% H2O) SeccoSolv |
| Combustion oven | Legallais | ||
| Pierce BCA protein assay kit | Interchim | UP40840A | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure | Merck | 1003171000 | Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Lithium acetate buffer | Biochrom | 80-2038-10 | |
| Commercial solution of hydrolyzed amino acids | Sigma Aldrich | AAS18 | |
| L-Methionine sulfone | Sigma Aldrich | M0876 | |
| L-Cysteic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 30170 | |
| Pyrex glass culture tubes | Sigma Aldrich | Z653586 | |
| Pyridine | Acros Organics | 131780500 | 99% Extrapure |
| Ethyl chloroformate | Sigma Aldrich | 23131 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 32222 | |
| Vials | Sigma Aldrich | 854165 | |
| Microinserts for 1.5ml vials | Sigma Aldrich | SU860066 | |
| GC/MS | Agilent Technologies | 5890 GC/5973 MS | |
| Chemstation | Agilent Technologies | Instrument control and data analysis software | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Chromasolv, for HPLC |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | ChromasolvPlus, for HPLC |
| N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal | Sigma Aldrich | 394963 | |
| BSTFA | Sigma Aldrich | 33024 | |
| DB-17MS column | Agilent Technologies | 122-4731 | 30m*0.25mm*0.15µm |
| Sodium sulfate, anhydrous | Sigma Aldrich | 238597 | |
| Technical nitrogen | Air products | 14629 | |
| Zebron ZB-WAX column | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m*0.25mm*0.25µm |
| Helium BIP | Air products | 26699 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1702 |
References
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