Arbetsflödet baserat på kombinationen av isotopiska Tracer experiment att undersöka mikrobiell metabolismen av flera näringskällor

Summary

Det här protokollet beskriver en experimentell förfarande för att kvantitativt och grundligt undersöka metabolismen av flera näringskällor. Detta arbetsflöde, baserat på en kombination av isotopiska tracer experiment och en analytisk procedur, tillåter ödet för förbrukade näringsämnen och molekyler synthetized metabolisk ursprung av mikroorganismer skall fastställas.

Abstract

Studier inom mikrobiologi är beroende av genomförandet av en rad olika metoder. Särskilt bidrar utvecklingen av lämpliga metoder väsentligen till att ge omfattande kunskap av metabolismen av mikroorganismer växer i kemiskt definierade media som innehåller unika kväve och kolkällor. Förvaltningen genom metabolism av flera näringskällor, trots deras bred närvaro i naturliga eller industriella miljöer, är däremot fortfarande nästan outforskade. Denna situation beror främst på bristen på lämpliga metoder, som hindrar utredningar.

Vi rapporterar en experimentell strategi att kvantitativt och grundligt utforska hur ämnesomsättningen fungerar när ett näringsämne tillhandahålls som en blandning av olika molekyler, dvs, en komplex resurs. Här, beskriver vi sin ansökan för att bedöma delningen av flera kväve källor genom jäst metaboliska nätverk. Arbetsflödet kombinerar information som erhålls under stabil isotop tracer experiment med valda ¹³C- eller ¹⁵N-märkt substrat. Den första består av parallella och reproducerbara fermentering i samma medium, som innehåller en blandning av N-innehållande molekyler; en valda kväve källa är dock märkt varje gång. En kombination av analytiska förfaranden (HPLC, GC-MS) genomförs att bedöma märkning mönster av riktade föreningar och kvantifiera konsumtion och återvinning av substrat i andra metaboliter. En integrerad analys av hela datamängden innehåller en översikt över ödet av förbrukade substrat inom celler. Denna strategi kräver en korrekt protokoll för insamling av prover – underlättas av ett robot-assisterad system för online-övervakning av fermentering – och uppnåendet av många tidskrävande analyser. Trots dessa begränsningar är tillåtet det att förstå, för första gången av uppdelning av flera kväve källor i hela jäst metabola nätverket. Vi klarlagd omfördelning av kväve från mer rikliga källor mot andra N-föreningar och beslutsam metabolisk ursprung flyktiga molekyler och proteinogena aminosyror.

Introduction

Förståelse är hur mikrobiell ämnesomsättning fungerar en nyckelfråga för design av effektiva strategier för att förbättra jäsningsprocesser och modulera produktion av fermentativa föreningar. Framstegen inom genomik och funktionsgenomik i dessa senaste två decennierna i hög grad bidragit till att utöka kunskapen om topologin för metaboliska nätverk i många mikroorganismer. Tillgång till denna information ledde till utvecklingen av metoder som syftar till en omfattande översikt av cellulär funktion¹. Dessa metoder är ofta beroende av en modellbaserad tolkning av mätbara parametrar. Dessa experimentella data inkluderar, å ena sidan, metabolit upptag och produktion priser och, å andra kvantitativa intracellulära informationen som erhålls från isotopen tracer experiment. Dessa uppgifter ger viktig information för avdrag för aktiviteten i vivo av olika vägar i en definierad metaboliska nätverk^2,3,4. För närvarande är de tillgängliga analytiska teknikerna bara aktivera exakt detektion av märkning mönster av molekyler när du använder en enda element isotop och eventuellt när Co märkning med två isotopiska element. Dessutom under de flesta odlingsbetingelser består kol källan bara av en eller två-föreningar. Följaktligen, metoder som bygger på ¹³C-isotopiska spårämnen från kol substrat allmänt och framgångsrikt tillämpades för att utveckla en fullständig förståelse av kol metabola network operations^{5,6,7 ,8}.

Däremot i många naturliga och industriella miljöer består resursen tillgängligt kväve som stöder mikrobiell tillväxt ofta av ett brett utbud av molekyler. Exempelvis under jäsning av vin eller öl tillhandahålls kväve som en blandning av 18 aminosyror och ammonium vid varierande koncentrationer⁹. Denna samling av N-föreningar som är tillgängliga för anabolism gör dessa komplexa media villkor avsevärt skiljer sig från de vanligaste för fysiologiska studier, eftersom det senare uppnås med hjälp av en unik källa till kväve, vanligtvis ammonium.

Sammantaget internaliserat kväve föreningar kan ingå i proteiner eller kataboliseras direkt. Nätstrukturen av kväve metabolism i många mikroorganismer, inklusive jästen Saccharomyces cerevisiae, är mycket komplext i enlighet med mångfalden av substrat. Schematiskt, är detta system baserat på en kombination av den centrala kärnan av kväve metabolism vilket katalyserar omvandling av glutamin, glutamat och α-ketoglutarat^10,11, med transaminaser och deaminases. Genom detta nätverk, amine grupper från ammonium eller andra aminosyror är samlade och α-keto syror släppt. Dessa intermediärer är också synthetized genom centrala kol metabolism (CCM)^12,13. Detta stora antal Grenade reaktioner och intermediärer, involverade i både katabolismen av exogena kväve källor och anabolism proteinogena aminosyror, uppfyller de anabola kraven i cellerna. Aktiviteten via dessa olika sammanlänkade vägar leder även utsöndring av metaboliter. I synnerhet kan α-keto syror omdirigeras via Ehrlich vägen att producera högre alkoholer och deras acetat ester derivat¹⁴, som är viktig bidragsgivare till de sensoriska profilerna av produkter. Därefter spelar hur kväve ämnesomsättning fungerar en nyckelroll i produktion av biomassa och bildandet av flyktiga molekyler (arom).

De reaktioner, enzymer och gener som är involverade i metabolismen av kväve är utförligt beskrivna i litteraturen. Dock har frågan om fördelningen av flera kväve källor i hela ett metaboliska nätverk inte ännu tagits upp. Det finns två huvudsakliga skäl som förklarar denna brist på information. Först, med tanke på viktiga komplexiteten av kväve metabolism nätverket, en stor mängd kvantitativa data krävs för en fullständig förståelse av verksamheten som inte var tillgänglig förrän nu. Andra, många experimentella begränsningar och begränsningar av analysmetoder hindrade genomförandet av strategier som tidigare användes för förtydligandet av CCM funktion.

För att övervinna dessa problem, valde vi att utveckla en strategi för system-nivå som baseras på försoningen av data från en serie isotopiska tracer experiment. Arbetsflödet innehåller:
-En uppsättning av fermentering som utförs under samma miljöförhållanden, medan en annan valda näringsämnen källa (substrat) är märkta varje gång.
-En kombination av analytiska förfaranden (HPLC, GC-MS) för en noggrann bestämning, i olika skeden av jäsning, av kvarvarande koncentrationen av märkt substrat och koncentrationen och isotopiska anrikningen av föreningar som härrör från katabolismen av märkt molekylen, inklusive härledda biomassa.
-En beräkning av massa och isotopiska balansen för varje konsumeras märkt molekyl och ytterligare en integrerad analys av datamängden att få en global översikt över förvaltningen av flera näringskällor av mikroorganismer genom bestämning av flux nyckeltal .

För att tillämpa denna metod, måste det uppmärksammas att reproducerbara beteendet av stam/mikroorganism mellan kulturer. Prover från olika kulturer måste dessutom tas under samma väldefinierade jäsning. I experimentella arbetet redovisas i detta manuskript, används ett robot-assisterad system för online-övervakning av fermentering att ta hänsyn till dessa begränsningar.

Dessutom är det viktigt att välja en uppsättning märkt substrat (förening, natur och ställning märkning) som är lämpligt att ta itu med vetenskapliga problemet av studien. Här valdes ¹⁵N-märkt ammonium, glutamin och arginin som de tre stora kväve källorna hittade i druvjuice. Detta gjorde att bedöma mönstret av kväve omfördelning från förbrukade föreningar till proteinogena aminosyror. Vi syftar också till att utreda ödet för kol ryggraden i de förbrukade aminosyrorna och deras bidrag till produktionen av flyktiga molekyler. För att uppfylla detta mål, enhetligt ¹³C-märkta leucin, ingick isoleucin, treonin och valin i studien som aminosyror som härleds från stora intermediärer av Ehrlich väg.

Sammantaget utforskade vi kvantitativt hur jäst hanterar en komplex kväve resurs genom att omfördela exogena kväve källor för att uppfylla dess anabola krav under hela jäsningen medan dessutom att ta bort överskottet av kol prekursorer som flyktiga molekyler. Experimentella förfarandet redovisas i detta dokument kan användas för att undersöka andra flera näringskällor används av någon annan mikroorganism. Det verkar vara en lämplig metod för analys av effekterna av genetisk bakgrund eller miljöförhållanden på metabola uppförandet av mikroorganismer.

Protocol

1. jäsning och provtagning Förberedelse av media och komposterObs: Alla fermentering är utföras parallellt, med hjälp av samma stam och i samma kemiskt definierade syntetiskt medium (SM, sammansättning anges i tabell 1), som innehåller en blandning av ammonium och aminosyror som kväve källor15. För varje jäsning tillhandahålls en enda kväve förening uteslutande i ett enhetligt märkta 13C eller 15N formulär (100%…

Representative Results

Figur 3 visar en schematisk bild av det arbetsflöde som genomfördes för att undersöka hanteringen av jäst av flera kväve källorna som finns under vin jäsning.På olika punkter för provtagning, biologiska parametrar – tillväxt egenskaper, kväve konsumtionsmönster och profilen för proteinogena aminosyror – Visa en hög reproducerbarhet bland fermentering (figur 4). Denna konsekvens validerar relevansen av den s…

Discussion

Kvantifiering av uppdelning av föreningar genom metaboliska nätverk med isotopiska tracer experiment är en lovande strategi för att förstå driften av mikrobiell metabolism. Denna metod, kan medan tillämpats med ett eller två märkta substrat, inte för närvarande tillämpas för att studera metabolismen av olika källor med hjälp av flera märkta elementärt isotoper (dvs, mer än två substrat). Faktiskt, de tillgängliga analytiska teknikerna aktivera noggrann bestämning av märkning konsumtionsmön…

Materials

D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	230391
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9625
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A4514
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	71690
Manganese sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	M7634
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma Aldrich	C7631
Potassium iodine	Sigma Aldrich	P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C3169
Boric acid	Sigma Aldrich	B7660
Ammonium heptamolybdate	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inositol	Sigma Aldrich	I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma Aldrich	21210
Thiamine, hydrochloride	Sigma Aldrich	T4625
Nicotinic acid	Sigma Aldrich	N4126
Pyridoxine	Sigma Aldrich	P5669
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Ergostérol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Ethanol absolute	VWR Chemicals	101074F
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	236489
L-Aspartic acid	Sigma Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanine	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G3126
Glycine	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidine	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Aldrich	L8000
L-Lysine	Sigma Aldrich	L5501
L-Methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Sigma Aldrich	P2126
L-Proline	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptophane	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrosine	Sigma Aldrich	T3754
L-Valine	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valine	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine	Eurisotop	NLM-396-PK
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	270989
Ethyl propanoate	Sigma Aldrich	112305
Ethyl 2-methylpropanoate	Sigma Aldrich	246085
Ethyl butanoate	Sigma Aldrich	E15701
Ethyl 2-methylbutanoate	Sigma Aldrich	306886
Ethyl 3-methylbutanoate	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Ethyl hexanoate	Sigma Aldrich	148962
Ethyl octanoate	Sigma Aldrich	W244910
Ethyl decanoate	Sigma Aldrich	W243205
Ethyl dodecanoate	Sigma Aldrich	W244112
Ethyl lactate	Sigma Aldrich	W244015
Diethyl succinate	Sigma Aldrich	W237701
2-methylpropyl acetate	Sigma Aldrich	W217514
2-methylbutyl acetate	Sigma Aldrich	W364401
3-methyl butyl acetate	Sigma Aldrich	287725
2-phenylethyl acetate	Sigma Aldrich	290580
2-methylpropanol	Sigma Aldrich	294829
2-methylbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-methylbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-phenylethanol	Sigma Aldrich	77861
Propanoic acid	Sigma Aldrich	94425
Butanoic acid	Sigma Aldrich	19215
2-methylpropanoic acid	Sigma Aldrich	58360
2-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	193070
3-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	W310212
Hexanoic acid	Sigma Aldrich	153745
Octanoic acid	Sigma Aldrich	W279900
Decanoic acid	Sigma Aldrich	W236403
Dodecanoic acid	Sigma Aldrich	L556
Fermentor 1L	Legallais	AT1357	Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system	Dominique Deutscher	029311
Fermenters (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes	Sarstedt	62.554.502
Fermentation locks	Legallais	AT1356	Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Incubator shaker	Infors HT
Particle Counter	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
Plate Butler Robotic system	Lab Services BV	PF0X-MA	Automatic instrument
Plate Butler Software	Lab Services BV		Robot monitor software
RobView			In-house developed calculation software
My SQL			International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter platform rocker	Dutscher	60903
Ammonia enzymatic kit	R-Biopharm AG	5390
Spectrophotometer cuvettes	VWR	634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400	Secomam
Amino acids standards physiological – acidics and neutrals	Sigma Aldrich	A6407
Amino acids standards physiological – basics	Sigma Aldrich	A6282
Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent	Biochrom	BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid	Sigma Aldrich	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm	VWR	611-1380
Precision balance	Mettler		Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried	Merck	1029310161	(max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven	Legallais
Pierce BCA protein assay kit	Interchim	UP40840A
Formic acid	Fluka	94318
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure	Merck	1003171000	Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer	Biochrom	80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids	Sigma Aldrich	AAS18
L-Methionine sulfone	Sigma Aldrich	M0876
L-Cysteic acid monohydrate	Sigma Aldrich	30170
Pyrex glass culture tubes	Sigma Aldrich	Z653586
Pyridine	Acros Organics	131780500	99% Extrapure
Ethyl chloroformate	Sigma Aldrich	23131
Dichloromethane	Sigma Aldrich	32222
Vials	Sigma Aldrich	854165
Microinserts for 1.5ml vials	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Instrument control and data analysis software
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal	Sigma Aldrich	394963
BSTFA	Sigma Aldrich	33024
DB-17MS column	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous	Sigma Aldrich	238597
Technical nitrogen	Air products	14629
Zebron ZB-WAX column	Phenomenex	7HG-G007-11	30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP	Air products	26699
Glass Pasteur pipettes	VWR	612-1702