Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

سير العمل على أساس المزيج تجارب التتبع النظائري للتحقيق الأيض الميكروبي من عدة مصادر المغذيات

doi: 10.3791/56393 Published: January 22, 2018

Summary

ويصف هذا البروتوكول إجراء تجريبي للكمية وشاملة التحقيق الأيض من عدة مصادر المغذيات. يسمح سير العمل هذا، استناداً إلى مجموعة من التجارب الراسم النظائر المشعة وإجراء التحليل، مصير المواد الغذائية المستهلكة ومنشأ الأيضية سينثيتيزيد جزيئات من الكائنات الحية الدقيقة تحديد.

Abstract

دراسات في مجال علم الأحياء الدقيقة تعتمد على تنفيذ مجموعة واسعة من المنهجيات. على وجه الخصوص، تطوير أساليب مناسبة إلى حد كبير يسهم في توفير معرفة واسعة بالتمثيل الغذائي للكائنات الدقيقة التي تنمو في المعرفة كيميائيا الوسائط التي تحتوي على مصادر الكربون والنيتروجين فريدة من نوعها. على النقيض من ذلك، ما زالت إدارة مصادر المغذيات متعددة، على الرغم من وجودها الواسع في البيئات الطبيعية أو الصناعية، من خلال التمثيل الغذائي تقريبا غير مستكشفة. وهذه الحالة يرجع أساسا إلى الافتقار إلى منهجيات مناسبة، مما يعوق التحقيقات.

نحن تقرير استراتيجية تجريبية كمياً وشاملة استكشاف كيفية تشغيل الأيض عندما يتم توفير مغذيات كخليط من جزيئات مختلفة، أي، مورد معقدة. هنا، نحن تصف تطبيقها لتقييم تقسيم مصادر النيتروجين متعددة من خلال شبكة الأيضية الخميرة. سير العمل يجمع بين المعلومات التي تم الحصول عليها من خلال تجارب الراسم النظائر المستقرة باستخدام المحدد 13ج-أو ركائز المسمى ن 15. الأولى تتكون من تخمير موازية واستنساخه في المتوسط نفسها، التي تضم خليط جزيئات المحتوية على ن؛ ومع ذلك، يسمى مصدر نيتروجين محدد في كل مرة. يتم تنفيذ مزيج من الإجراءات التحليلية ([هبلك]، GC-MS) لتقييم أنماط التوسيم للمركبات المستهدفة وقياس الاستهلاك والانتعاش من ركائز في نواتج الأيض الأخرى. تحليل متكامل لمجموعة البيانات كاملة يوفر لمحة عامة عن مصير ركائز المستهلكة داخل الخلايا. ويتطلب هذا النهج بروتوكولا دقيقة لجمع العينات – تيسير نظام الروبوت للرصد على الإنترنت لتخمير – وتحقيق العديد من التحليلات تستغرق وقتاً طويلاً. على الرغم من هذه القيود، فقد أتاح فهم، للمرة الأولى، على تقسيم مصادر النيتروجين متعددة في جميع أنحاء الشبكة الاستقلابية الخميرة. توضيح توزيع النيتروجين من مصادر أكثر وفرة تجاه المركبات الأخرى ن، وتحدد أصول الأيضية للجزيئات المتطايرة والأحماض الأمينية قائمة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

فهم كيف يعمل الأيض الميكروبي مسألة أساسية لتصميم استراتيجيات فعالة لتحسين عمليات التخمير وتعدل إنتاج المركبات معفن. التقدم في علم الوراثة وعلم الجينوم الوظيفي في هذين العقدين الماضي ساهمت إلى حد كبير إلى توسيع نطاق معرفة طبولوجيا الشبكات التمثيل الغذائي في العديد من الكائنات الحية الدقيقة. الوصول إلى هذه المعلومات أدت إلى تطوير النهج التي تهدف لإجراء استعراض شامل لوظيفة الخلوية1. غالباً ما تعتمد هذه المنهجيات على تفسير يستند إلى نموذج لمعايير قابلة للقياس. وتشمل هذه البيانات التجريبية، من ناحية، معدلات الإقبال والإنتاج المستقلب، ومن ناحية أخرى، تجارب كمية المعلومات داخل الخلايا التي يتم الحصول عليها من الراسم النظائر. توفر هذه البيانات معلومات أساسية لخصم النشاط في فيفو مسارات مختلفة في تعريف شبكة الاستقلابية2،3،4. التقنيات التحليلية المتاحة حاليا، فقط تمكين الكشف عن دقة وصف أنماط الجزيئات عند استخدام أحد نظائر عنصر مفرد، وربما عندما وسم يشترك مع عنصرين النظائر. وعلاوة على ذلك، تحت ظروف نمو معظم، مصدر الكربون يتكون فقط من واحد أو اثنين--المركبات. ونتيجة لذلك، النهج القائمة على تتبع النظائر ج 13من ركائز الكربون بنجاح وعلى نطاق واسع وطبقت على التوصل إلى فهم كامل للكربون الأيضية شبكة عمليات5،6،7 ،8.

وفي المقابل، في العديد من البيئات الطبيعية والصناعية، المورد متاح النيتروجين التي تدعم النمو الميكروبي غالباً ما تتألف من مجموعة واسعة من الجزيئات. على سبيل المثال، أثناء تخمير النبيذ أو البيرة، يتم توفيرها من النيتروجين كخليط من الأحماض الأمينية والأمونيوم في تركيزات متغير918. هذا الصفيف ن المركبات التي يمكن الوصول إليها لابتناء يجعل هذه الشروط المعقدة وسائل الإعلام مختلفة إلى حد كبير عن تلك التي تستخدم عادة للدراسات الفسيولوجية، كما هذا الأخير يتم تحقيقه باستخدام مصدرا فريداً للنيتروجين، عادة من الأمونيوم.

وعموما، مستوعبة النيتروجين قد أدرجت في البروتينات المركبات مباشرة أو كاتابوليزيد. بنية الشبكة استقلاب النيتروجين في العديد من الكائنات الحية الدقيقة، بما في ذلك الخميرة Saccharomyces cerevisiae، معقد للغاية وفقا لتنوع ركائز. العريضة، ويقوم هذا النظام على تركيبة النواة المركزية استقلاب النيتروجين الذي يحفز إينتيركونفيرسيون من الجلوتامين والغلوتامات و α-كيتوجلوتاراتي10،11، مع اميناز وديميناسيس. من خلال هذه الشبكة، وهي تجمع مجموعات أمين من الأمونيوم أو الأحماض الأمينية الأخرى والإفراج عن الأحماض α-keto. هذه الوسيطة أيضا سينثيتيزيد من خلال الكربون المركزية الأيض (CCM)12،13. هذا العدد الكبير من ردود فعل تشعبت والمواد الوسيطة، تشارك في الانتقاض مصادر خارجية النيتروجين وابتناء قائمة الأحماض الأمينية، يفي بمتطلبات المنشطة للخلايا. كما يؤدي النشاط من خلال هذه الطرق المختلفة المترابطة في إفراز نواتج الأيض. على وجه الخصوص، قد توجيه الأحماض α-keto من خلال المسار ايرليك لإنتاج الكحول أعلى وما خلات إستر المشتقات14، التي هي من المساهمين أساسيا للملامح الحسية للمنتجات. وفي وقت لاحق، كيف تعمل استقلاب النيتروجين دوراً رئيسيا في إنتاج الكتلة الأحيائية وتشكيل الجزيئات المتطايرة (رائحة).

ردود الفعل والأنزيمات والجينات المشاركة في استقلاب النيتروجين توصف على نطاق واسع في الأدب. بيد أن مسألة توزيع مصادر النيتروجين متعددة في جميع أنحاء شبكة التمثيل الغذائي لم تعالج بعد. هناك اثنين من الأسباب الرئيسية التي تفسر هذا النقص في المعلومات. أولاً، نظراً لتعقيد مهمة شبكة استقلاب النيتروجين، كمية كبيرة من البيانات الكمية المطلوبة لفهم كامل لعملها أن لم تكن متاحة حتى الآن. ثانيا، العديد من القيود التجريبية والقيود المفروضة على الطرق التحليلية حالت دون تنفيذ النهج التي كانت تستخدم سابقا لتوضيح الدالة CCM.

للتغلب على هذه المشاكل، اخترنا لوضع نهج مستوى النظام تقوم على التوفيق بين البيانات من سلسلة من التجارب الراسم النظائر. يتضمن سير العمل:
--مجموعة من تخمير نفذت تحت نفس الظروف البيئية، بينما يسمى مصدر مغذيات محددة مختلفة (الركيزة) في كل مرة.
--مزيج من الإجراءات التحليلية ([هبلك]، GC-MS) لتحديد دقيق، في مراحل مختلفة من التخمير، تركيز المتبقية من الركازة المسمى والتركيز وإثراء المركبات المشتقة من النظائر المشعة تقويض للجزيء المسمى، بما في ذلك الكتلة الحيوية المشتقة.
-عملية حسابية للتوازن الشامل والنظائر المشعة لكل تستهلك الجزيء المسمى ومزيد من تحليل متكامل لمجموعة البيانات للحصول على لمحة عامة لإدارة مصادر المغذيات متعددة من الكائنات الحية الدقيقة من خلال تحديد نسب التمويه .

لتطبيق هذه المنهجية، يجب إيلاء الاهتمام لسلوك استنساخه من السلالة/الكائنات الدقيقة بين الثقافات. وعلاوة على ذلك، يجب أخذ عينات من ثقافات مختلفة خلال نفس التقدم التخمير محددة تحديداً جيدا. في الأعمال التجريبية التي ذكرت في هذه المخطوطة، يستخدم نظام الروبوت للرصد على الإنترنت لتخمير لمراعاة هذه القيود.

وعلاوة على ذلك، من الضروري أن تختار مجموعة من ركائز المسمى (مجمع، والطبيعة، ووضع العلامات) التي مناسبة معالجة مشكلة الدراسة العلمية. هنا، تم اختيار 15المسمى ن الأمونيوم، الجلوتامين، وارجينين كمصادر النيتروجين الرئيسية الثلاثة الموجودة في عصير العنب. وهذا يسمح بتقييم نمط توزيع النيتروجين من المركبات المستهلكة للأحماض الأمينية قائمة. نحن تهدف أيضا إلى التحقيق في مصير العمود الفقري الكربون من الأحماض الأمينية المستهلكة ومساهمتها في إنتاج الجزيئات المتقلبة. آيسولوسين، ثريونين، وحمض أميني أساسي للوفاء بهذا الهدف، وشكل موحد لوسين المسمى ج 13، قد أدرجت في الدراسة الأحماض الأمينية المستمدة من المواد الوسيطة الرئيسية للمسار ايرليك.

عموما، فإننا استكشاف كمياً كيف يدير الخميرة مورد نيتروجين معقدة بإعادة توزيع مصادر النيتروجين الخارجية للوفاء بمتطلباتها الابتنائية طوال التخمير أثناء إزالة فائض السلائف الكربون كما بالإضافة إلى ذلك الجزيئات المتقلبة. يمكن تطبيق الإجراءات التجريبية عنها في هذه الورقة للتحقيق في مصادر المغذيات المتعددة الأخرى المستخدمة من قبل أي من الكائنات الدقيقة الأخرى. ويبدو أن نهج مناسب لتحليل تأثير الخلفية الجينية أو الظروف البيئية على السلوك الأيضية للكائنات الحية الدقيقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-التخمير وأخذ العينات

  1. إعداد الوسائط والتخمير
    ملاحظة: تعريف كل تخمير يتم يضطلع بالتوازي، باستخدام نفس السلالة وفي نفس كيميائيا المتوسطة الاصطناعية (SM، التكوين الواردة في الجدول 1)، الذي يتضمن مزيجاً من الأمونيوم والأحماض الأمينية حسب مصادر النيتروجين15. لكل التخمير، يتم توفيرها مركب النتروجين واحد حصرا في شكل موحد المسمى 13ج أو نموذج 15ن (100%)، بينما لا يزال الآخرون غير مسمى. لكل مصدر النيتروجين المسمى الذي يتم استخدامه في مجموعة التجارب (هنا: 15NH4، يو-15N4-الأرجنتين، يو-15N2-جلن، يو-13C6-لوي، يو-13C5-فال، يو-13C6-إيل، يو-13C4-الثريونين)، وهما وتعد المخمرات. لكل شرط، تتم التخمير المكررة باستخدام فقط غير مسمى جزيئات (تخمير التحكم 7).
    1. لكل N-مصدر لدراستها، وإعداد 500 مل SM المسمى المتوسط الذي يحتوي على كافة مصادر النيتروجين المذكورة في الجدول 1، باستثناء المجمع لاستخدامها في 100% النموذج.
      ملاحظة: يتم إضافة الجزيء المسمى في الخطوات التالية.
    2. بسترة كل المتوسطة في قارورة ل 1 (10 دقيقة، 100 درجة مئوية) التي تحتوي على شريط إثارة مغناطيسية. وزن المقدار المناسب من جزيء المسمى للوصول إلى تركيز النهائية التي يتم الإبلاغ عنها في الجدول 1 وحله في الأجل المتوسط.
    3. تعقيم المتوسطة استخدام نظام ترشيح فراغ المتاح (غشاء اسيتات السليولوز، 0.22 ميكرومتر). باستخدام اسطوانة قياس عقيمة، تقسيم المتوسطة بين المخمرات معقمة قبل سنتين (250 مل) التي تحتوي على شريط إثارة مغناطيسية وهي مجهزة بإقفال التخمير تجنب دخول الأوكسجين ولكن السماح بالإفراج عن أول أكسيد الكربون2.
    4. الحرارة قوارير التخمير إلى 28 درجة مئوية عن طريق وضعها في غرفة الحضانة لليلة واحدة (درجة الحرارة في 28 درجة مئوية).
  2. التطعيم والرصد لتخمير
    1. تنمو سلالة S. cerevisiae في أنابيب معقمة تحتوي على 10 مل متوسطة YPD في 28 درجة مئوية مع الهز (150 لفة في الدقيقة) ح 12. ثم بيبيت 1 مل YPD بريكولتوري ونقلها إلى 10 مل من SM المتوسطة (في أنابيب معقمة 15 مل). احتضان ثقافة ح 12 في 28 درجة مئوية مع الهز (150 لفة في الدقيقة).
    2. تحت الاندفاق الصفحي، جمع من بريكولتوري الكوة والتحديد الكمي للسكان الخلية باستخدام عداد جسيمات إلكترونية التي يتم تركيبها مع فتحه 100 ميكرومتر. الطرد المركزي بريكولتوري (2,000 x ز، 15 دقيقة، 4 درجة مئوية) وتعليق بيليه في وحدة تخزين مناسبة من الماء المعقم للحصول على تركيز نهائي 2.5 × 108 خلايا/مل. تطعيم كل تخمير مع 1 مل تعليق خلية.
      ملاحظة: النظام الروبوتية المستخدمة لرصد التقدم المحرز في التخمير يرد في الشكل 1.
    3. إعداد منهاج التخمير بتثبيت التخمير في أدلة الدعم التي يتم وضعها على لوحات التحريك 21-الموقف بشكل صحيح وتعيين معدل إثارة 270 لفة في الدقيقة. لبدء الرصد المباشر لكل التخمير، بدء تشغيل التطبيق الروبوت--عنصر تحكم، ثم انقر فوق الزر "بدء الفحص" وحدد حجم التخمر سيضطلع (300 مل).
    4. واجهة عرض يسمح الإشارة إلى عدد وموقف المخمرات على المنصة. لضمان حدوث ذلك، انقر على الحق في مكان فتحه واختر "تمكين" تفعيل رصد تخمير يقع في هذا الموضع.
    5. تهيئة البرنامج حساب، تعمل بشكل دائم على النظام، قبل البدء في اكتساب الوزن. انقر فوق الزر "إينيتياليسير"، والتحقق من صحة مع "موافق". انقر على زر "ابدأ" روبوت لمراقبة التطبيق لبدء عمليات الشراء الوزن.
  3. إجراءات أخذ العينات
    ملاحظة: لكل تخمير، وتؤخذ عينات عندما يصل إنتاج2 CO (القيمة المعروضة على شبكة الإنترنت على الكمبيوتر الذي يشغل البرنامج حساب) النقطة المحددة المطلوبة: 5، 10 و 40 و 90 جرام/لتر في هذه الدراسة.
    1. أخذ العينات الداخلي للثقافات مع مركبات مسماة.
      1. الطرد المركزي عينتين 6 مل (2,000 x ز, 5 دقيقة, 4 درجة مئوية). حفظ وتخزين supernatants المجمدة في مختبرين اثنين في-80 درجة مئوية. تغسل الكريات مرتين مع 5 مل المقطر ماء ومخزن في-80 درجة مئوية لقياس الفاسدون النظائر.
    2. أخذ العينات الداخلي للثقافات دون مركبات مسماة
      1. حصاد 10 مل ثقافة، والذي سيتم استخدامه لتحديد الوزن الجاف. بيليه الخلايا من 10 مل عينتين بالطرد المركزي (2,000 x ز, 5 دقيقة, 4 درجة مئوية). تغسل الكريات مرتين مع 10 مل ماء المقطر وتخزينها في-80 درجة مئوية لتحديد محتوى البروتين والأحماض الأمينية.

2-التحديد الكمي لمصادر النيتروجين المستهلكة

  1. تصميم الانزيمية تركيزات الأمونيا المتبقية
    ملاحظة: يتم تحديد تركيز الأمونيا في supernatants استخدام مجموعة المستندة إلى إنزيم تجارية؛ جميع الكواشف توفرها الشركة المصنعة.
    1. تعد حلاً الأمونيا قياسية (61.4 مغ/لتر) بإذابة 25 ملغ من دقة وزنه (NH4)2حتى4 في قارورة حجمية 100 مل.
    2. للوفاء بإرشادات الشركة المصنعة، نفذ إضعاف 1:2 للعينات التي أخذت قبل التخمير والساعة 5 غ/لتر من CO2 صدر. ضبط الأس الهيدروجيني للعينات لما يقرب من 8 بإضافة 1 م كوه. يحيط علما بحجم المضافة وأخذها في الاعتبار في معامل التخفيف.
    3. في 4 مل جهاز المطياف الضوئي الترعة، المقطر مزيج 100 ميكروليتر من عينة (المخفف إذا لزم الأمر)، المياه أو محلول الأمونيا القياسية مع 2 مل كاشف 1 (0.75 مم ADP و 30 U/mL غلوتامات نازعة في المخزن المؤقت للأس الهيدروجيني 7.8) و 500 ميليلتر من كاشف 2 (1.3 مم NADH). احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وقراءة امتصاص NADH في 340 نانومتر (A1).
    4. إضافة 500 ميليلتر من الكاشف 3 (60 ملم α-كيتوجلوتاراتي في المخزن المؤقت لدرجة الحموضة 8) واحتضان العينة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وقراءة امتصاص NADH في 340 نانومتر (A2).
    5. حساب تركيز الأمونيا باستخدام:
      جالنشادر (غرام/لتر) = 0.083 x [(0.839 x A1-A2)عينة-(0.839 x A1-A2)ماء مقطر]
    6. تحقق من أن يتم الحصول على التركيز الصحيح مع الحل القياسية.
  2. تصميم الكروماتوغرافي تركيزات الأحماض الأمينية المتبقية
    ملاحظة: تحديد تركيزات الأحماض الأمينية في supernatants يتحقق باستخدام نظام تحليل الأحماض الأمينية مخصصة تقوم على التبادل الأيوني اللوني مع وظيفة العمود derivatization ن-المركبات مع نينهيدرين، الذي يسمح بها كشف اللونية.
    1. إعداد حل مرجع بإضافة 200 ميليلتر من خليط تجاري من الأحماض الأمينية محايدة والحمضية و 200 ميليلتر من خليط تجاري من الأحماض الأمينية الأساسية 200 ميليلتر من الجلوتامين 2.5 ملم إلى 400 ميليلتر من 200 ملم الليثيوم سترات عازلة، درجة الحموضة 2.2. هذا الحل إشارة محددة كيميائيا يعامل كعينة.
    2. إضافة 200 ميليلتر من حل حمض سولفوساليسيليك 25% (w/v) الذي يحتوي على 2.5 مم نورليوسيني (الداخلية القياسية) إلى 800 ميليلتر من عينة لإزالة الجزيئات ذات الأوزان الجزيئية العالية. احتضانها ح 1 في 4 درجات مئوية، وأجهزة الطرد المركزي (3,000 x ز، 10 دقيقة، 4 درجة مئوية) وعامل التصفية عن طريق غشاء النيتروسليلوز حجم المسام 0.22 ميكرومتر (نظام الحقن).
    3. في برنامج مبرمج، انقر فوق الزر "تشغيل" لبدء اللوني السائل التحليلات (LC) مع محلل مزودة بعمود تبادل الأيونات الموجبة (نموذج الليثيوم). الوت الأحماض الأمينية مع المخازن المؤقتة الليثيوم المتعاقبة لإنشاء تدرج الأس الهيدروجيني وتدرج في تركيز أيون مكافحة في تركيبة مع تدرج درجة الحرارة (الجدول 2).
    4. تحديد كمية مركبات النيتروجين بعد derivatization نينهيدرين بجهاز كشف سبيكتروفوتوميتريك في 570 نانومتر (الأرجواني التلون: تفاعل بين مجموعة نينهيدرين وأمين من الأحماض الأمينية) و 440 نانومتر (الأصفر تلوين: تفاعل بين مجموعة نينهيدرين وايمين برولين).
    5. إجراء معايرة داخلية نقطة واحدة استخدام حل مرجع ونورليوسيني كمعيار داخلية لحساب تركيزات الأحماض الأمينية في العينات باستخدام البرنامج الخاص بالشركة المصنعة.

3-التحديد الكمي لقائمة الأحماض الأمينية

  1. قياس الوزن الجاف خلية
    1. تصفية 10 مل ثقافة من خلال عامل تصفية النيتروسليلوز (المسام حجم 0.45 ميكرومتر) موزون مسبقاً في كأس ألومنيوم، واستخدام جهاز الشفط. تغسل مرتين مع 50 مل ماء المقطر.
    2. وضع عامل التصفية في كأس الألمنيوم والجافة في فرن حرارة عند 105 درجة مئوية ح 48 (حتى يتم ملاحظة أي تغيير زيادة في الوزن) قبل ريويغينج عامل التصفية في الكأس. حساب فرق الوزن.
    3. حساب متوسط قياسات مستقلة على الأقل 3 لدقة تحديد الوزن الجاف خلية ثقافة الخميرة.
  2. التحديد الكمي لمحتوى البروتين من الخلايا
    ملاحظة: يتم إجراء التحديد الكمي للجزء من البروتين الخلايا على الأقل في ثلاث نسخ باستخدام الكريات غير مسمى الخلية التي تم الحصول عليها كما هو موضح في القسم 1-3-2.
    1. استخراج البروتينات بإضافة 1 مل من محلول [دمس] (50% v/v) إلى الكريات المجمدة واحتضان عند 105 درجة مئوية ح 1 في فرن حرارة جافة.
    2. التحديد الكمي لمحتوى البروتين في المقتطفات [دمس] باستخدام مقايسة اللونية البيوكيميائية يرتكز على الحد من البروتينات Cu++ إلى أيونات Cu+ التي هي كذلك عجلت بحمض بيسينتشونينيك في مجمع زرقاء (مقايسة اتفاق التعاون الأساسي).
  3. تحديد المساهمات النسبية للأحماض الأمينية في البروتينات
    ملاحظة: يتم تحديد ملف التعريف من قائمة الأحماض الأمينية على الأقل في ثلاث نسخ من خلية غير مسمى الكريات (1.3.2.).
    1. إعداد مقتطف المؤكسد بتعليق بيليه الخلية في 200 ميليلتر من حمض بيرفورميك (حمض الفورميك 90%، وفوق أكسيد الهيدروجين 10%). احتضانها ح 4 في 4 درجات مئوية ويتوقف رد الفعل بإضافة كبريتات الصوديوم ملغ 33.6.
      ملاحظة: الخطوة أكسدة مطلوب تحويل سيستين والميثيونين حمض الميثيونين [سولفون] وسيستيك، مما سوف يمكن تحديدها كمياً المزيد من التبادل الأيوني اللوني. ومع ذلك، بعض الأحماض الأمينية (تيروزين، فينيلالاناين، الحامض الأميني، وارجينين) هي التشويه والتحريف أثناء علاج الأكسدة. ونتيجة لذلك، يتم إعداد اثنين من البروتينات (مع ودون الأكسدة).
    2. إضافة 800 ميليلتر من 6N HCl إلى حبيبات الخلية أو تتأكسد استخراج واحتضان العينة في أنبوب زجاج مختومة بأحكام ح 16 عند 110 درجة مئوية في فرن وحرارة جافة. إضافة 200 ميليلتر من نورليوسيني 2.5 ملم وإزالة HCl مع تيار نيتروجين. أغسل (ريسوسبيندينج استخراج المجففة وثم إزالة السائل مع تيار نيتروجين) مرتين مع 800 ميليلتر من الماء المقطر ثم مع 800 ميليلتر من الإيثانول. يستغرق في 800 ميليلتر من 200 ملم الليثيوم خلات العازلة، الأس الهيدروجيني 2.2.
      ملاحظة: ينبغي إيلاء الاهتمام لفترة الحضانة للتحلل المائي بعض الأحماض الأمينية ليست مستقرة تحت الظروف الحمضية. ويقدر الكسر التربتوفان في البروتين من البيانات الموجودة في الأدبيات16، الأحماض الأمينية هذا هو التشويه والتحريف تماما أثناء التحلل HCl.
    3. إعداد معيار هيدروليساتي لمعايرة الداخلية نقطة واحدة. إضافة 160 ميليلتر للتوصل إلى حل تجاري لتحلل الأحماض الأمينية إلى 840 ميليلتر 200 ملم الليثيوم خلات المخزن المؤقت، الأس الهيدروجيني 2.2، يحتوي على 625 [سولفون] الميثيونين ميكرومتر وحمض سيستيك ميكرومتر 625 625 مكم نورليوسيني.
    4. تحديد تركيزات النسبية من الأحماض الأمينية في البروتينات باستخدام الأسلوب الكروماتوغرافي الموصوفة في القسم 2-2.
  4. العمليات الحسابية
    1. حساب نسبة وزن كل من الأحماض الأمينية في البروتينات بتقسيم مبلغ محسوب لكل حمض أميني (مغ/لتر) بمبلغ إجمالي قدرة الأحماض الأمينية التي تم قياسها في استخراج البروتين (مجموع في مغ/لتر).
    2. تتضاعف هذه النسبة المئوية بتركيز البروتينات في الثقافة (مغ/لتر)، و أي، والمنتج بين محتوى البروتين من الكتلة الأحيائية والوزن الجاف، لتقييم تركيز كل حمض أميني قائمة في الثقافة (مغ/لتر).

4-قياس تخصيب النظائر المشعة من قائمة الأحماض الأمينية

ملاحظة: لقياس تخصيب النظائر المشعة من قائمة الأحماض الأمينية، استخدام الكريات خلية مسماة. وتستخدم ثلاثة عوامل مختلفة لخطوة derivatization كمياً في إثراء النظائر المشعة من الأحماض الأمينية. يتم قياس كثافة الكتلة أيونات لتقدير أنماط التوسيم من الأحماض الأمينية. الإشارة من كل أيون الكتلة يتوافق مع وفرة إيسوتوبوميرس الشامل (م0 = بدون تسمية، m+ 1 = 1 ذرة المسمى،...) جزء من الأحماض الأمينية. ويرد مثال على تشروماتوجرام التي تم الحصول عليها بعد إجراء دمادمف في الشكل 2.

  1. التحلل المائي الكتلة الأحيائية
    1. يتحلل الكريات الخلية (الموافق 1-2 مغ من الكتلة الأحيائية الجافة) بإضافة 1.2 مل من 6 M HCl وتفرخ العينة ح 16 عند 105 درجة مئوية في أنابيب زجاجية مغلقة بأحكام في فرن حرارة جافة.
    2. إضافة 1.2 مل من الماء المقطر وأجهزة الطرد المركزي في 3,000 س ز لمدة 5 دقائق لإزالة الحطام الخلوية. توزيع المادة طافية في ستة 400 ميليلتر الكسور في أنابيب زجاجية مفتوحة. الجاف الكسور في فرن حرارة عند 105 درجة مئوية حتى تصل إلى اتساق شراب (ح 4-5).
  2. Derivatization اثيلتشلوروفورماتي (ECF)
    1. حل هيدروليساتي المجفف في 200 ميليلتر من عيار 20 ملم HCl؛ ثم أضف ميليلتر 133 بيريدين: الإيثانول (1:4). إضافة 50 ميليلتر من ECF ديريفاتيزي الأحماض الأمينية والانتظار حتى لقد تم الإفراج عن جميع CO2 . نقل الخليط الطرد المركزي أنابيب تحتوي على 500 ميليلتر من الميثان لاستخراج المركبات ديريفاتيزيد.
    2. دوامة الأنابيب 10 s والطرد المركزي لهم لمدة 4 دقائق في 10,000 س ز؛ جمع المرحلة العضوية أقل مع بيبيت باستور ونقل إلى GC قارورة تحتوي على إدراج الزجاج مخروطية الشكل حيث أن العينات قد حقنت مباشرة الصك GC/MS.
  3. (ن، ن)-ديميثيلفورماميدي ثنائي ميثيل أسيتال (دمفدما) derivatization.
    1. حل هيدروليساتي المجفف في 50 ميليلتر من الميثانول و 200 ميليلتر من الاسيتو الانيتريل. إضافة 300 ميليلتر من دمفدما. دوامة الأنبوب ونقل العينات إلى GC أوتوسامبلير زجاجة تحتوي على إدراج الزجاج مخروطية الشكل.
  4. ن، س-مكررا (تريميثيلسيليل) تريفلورواسيتاميدي (بستفا) derivatization
    1. تعليق هيدروليساتي في 200 ميليلتر من الاسيتو الانيتريل. إضافة 200 ميليلتر من بستفا ومغلقة بأحكام إغلاق أنبوب زجاج واحتضانها ح 4 في 135 درجة مئوية قبل نقل النص المقتبس مباشرة إلى قارورة GC.
  5. تحليل GC-MS
    1. تحليل العينات مع كروماتوجرافيا الغاز مجهزة حاقن أوتوسامبلير وهو بالإضافة مطياف كتلة.
      1. استخدام البرمجيات الخاصة بأداة للتحكم في الصك وتحليل في تشروماتوجرامس. في قائمة "سلسلة"، انقر فوق "نموذج سجل الجدول" لإنشاء قائمة نماذج، وانقر فوق الزر "تشغيل" لبدء الحقن.
        ملاحظة: كروماتوجرافيا الغاز مزودة بعمود شعري السليكا أبولار 30 م × 0.25 مم مع سماكة فيلم ميكرومترات 0.15. ضبط درجة حرارة الرباعي مطياف كتلة عند 150 درجة مئوية وعقد خط نقل على 250 درجة مئوية لكل التحليلات. وتستخدم ثلاثة برامج تحليلية، كل واحدة محددة لكل عامل derivatization،.
      2. ECF المشتقات المالية: استخدام الهيليوم كمرحلة المتنقلة مع تدفق 1.2 مل/دقيقة اضبط درجة حرارة المدخل في 230 درجة مئوية، وأن المصدر عند 250 درجة مئوية. برنامج أوتوسامبلير لحقن 1 ميليلتر من العينات بتقسيم نسبة 3:1. تشغيل هذه التحليلات، تدريجيا على زيادة درجة حرارة الفرن كما يلي: 130 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ التدرج من 15 درجة مئوية/دقيقة إلى 260 درجة مئوية؛ الحفاظ على درجة حرارة 260 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
      3. مشتقات دمفدما: استخدام الهيليوم كمرحلة المتنقلة مع تدفق مستمر من 1.2 مل/دقيقة اضبط درجة حرارة المدخل في 230 درجة مئوية، وأن المصدر عند 250 درجة مئوية. برنامج أوتوسامبلير لحقن 1 ميليلتر من العينات بتقسيم نسبة 3:1. تشغيل هذه التحليلات، تدريجيا على زيادة درجة حرارة الفرن كما يلي: 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ التدرج في الدقيقة 20 درجة مئوية إلى 130 درجة مئوية؛ التدرج الثانية من 4 درجة مئوية/دقيقة إلى 260 درجة مئوية؛ الحفاظ على درجة حرارة 260 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      4. مشتقات بستفا: استخدام الهيليوم كمرحلة المتنقلة مع تدفق مستمر من 1.2 مل/دقيقة اضبط درجة حرارة المدخل في 275 درجة مئوية، وأن المصدر في 300 درجة مئوية. تشغيل التحليلات (الحقن: 1 ميليلتر)، تدريجيا زيادة درجة حرارة الفرن كما يلي: 110 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ التدرج الأولى من 2 درجة مئوية/دقيقة إلى 154 درجة مئوية؛ التدرج الثانية من 5 درجة مئوية/دقيقة إلى 300 درجة مئوية؛ الحفاظ على درجة حرارة 300 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      5. الكشف الداخلي: لوضع كل من derivatization، حقن عينة (1 ميليلتر) في وضع المسح الضوئي مع الإلكترون الإيجابي أثر التأين في 70 eV والإحاطة بوقت الاحتفاظ بكل من الأحماض الأمينية.
      6. استخدم هذه القيم لتحديد الإطارات الزمنية في جميع أنحاء في chromatogram والايونات مختلفة مختارة، ومميزة لكل من الأحماض الأمينية والمدرجة في الجدول 3؛ ينبغي أن تكون هذه القيم لكل من الأحماض الأمينية. تضمين هذه المعلومات في برنامج الكشف عن سيم وتشغيل التحليلات في وضع سيم مع الإلكترون الإيجابي أثر التأين في 70 eV.
    2. جمع نتائج التحليلات؛ هي لكل من الأحماض الأمينية، سجل مجموعة من الشدة التي تتوافق مع إلى ما إيسوتوبوميرس أسلحة مختلفة. معالجة البيانات باستخدام ديديكاتيدسوفتواري17 لتصحيح لوضع العلامات الطبيعية وحساب تخصيب النظائر المشعة من قائمة الأحماض الأمينية (ويعرف الكسر مسماة من الأحماض الأمينية فيما يتعلق بالمبلغ الإجمالي للبروتين عينات).
      ملاحظة: في إثراء النظائر لجزيء (أي)، كنسبة مئوية، يتم حساب قسمة مجموع كثافات تصحيحها من إيسوتوبوميرس الشامل مع وضع العلامات (م1، م2،...mن) على مجموع المصوبة كثافة من جميع إيسوتوبوميرس أسلحة (م0، م1، م2... من):
      أولاً هاء = (م1 + م2 +... + من)/(م0 + م1+ م2 +... + من)

5-التقدير الكمي والنظائر إثراء المتطايرة

  1. استخراج المركبات المتطايرة المسمى
    1. إضافة 10 ميليلتر من الديوتيريوم المعايير الداخلية إلى 5 مل من المادة طافية (تركيز مركبات الديوتيريوم النهائي: 100 ميكروغرام/لتر) في أنبوب زجاج 15 مل. إضافة 1 مل الميثان وأحكام إغلاق الأنابيب ويهز لهم على منصة هزاز لأدنى 20 جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3,000 س ز وجمع في مرحلة انخفاض العضوية في أنبوب زجاج 15 مل. كرر استخراج الميثان.
    2. الجاف لاستخراج العضوية أكثر من 500 مغ كبريتات الصوديوم اللامائية وجمع الطور السائل مع بيبيت باستور. التركيز الاستخراج بمعامل أربع تحت التمويه النيتروجين ونقلها إلى قنينة أوتوسامبلير GC.
  2. تقدير المركبات المتطايرة GC-MS
    1. تزويد كروماتوجرافيا الغاز مع عمود شعري والسليكا فوسيد 30 م × 0.25 مم 0.25 ميكرو فيلم سمك وتطبيق تدفق هليوم مستمر من 1.0 مل/دقيقة عقد محقن وخط نقل في 250 درجة مئوية.
    2. حقن 2 ميليلتر من عينة بنسبة 10:1 تقسيم وفصل الجزيئات المتطايرة المستخرجة باستخدام التشكيل الجانبي التالي لدرجة حرارة الفرن: اضغط بدرجة الحرارة لمدة 3 دقائق عند 40 درجة مئوية، وزيادتها من خلال 4 درجة مئوية/دقيقة يصل إلى 220 درجة مئوية، وعقد بعد ذلك الفرن على 220 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    3. الكشف عن المركبات باستخدام مطياف كتلة مع درجة حرارة المصدر بها تعيين في 230 درجة مئوية ودرجة الحرارة الرباعي مطياف كتلة تعيين عند 150 درجة مئوية. تسجيل الأطياف الشامل في الوضع المحدد أيون الرصد (SIM) مع الإلكترون الإيجابي أثر التأين في 70 eV واستخدام كتل أيون المحددة للمركبات المتطايرة التي ترد في الجدول 4.
    4. استخدام معايرة 7-النقطة خارجية لقياس تركيزات الجزيئات المتطايرة من مبالغ كثافة الكتلة أيون المطابق. إعداد حلول الأسهم لكل مجمع (10 غرام/لتر) في الإيثانول 100%. ثم، إعداد الحلول القياسية لكل فئة من الجزيئات المتطايرة (استرات الإيثيل، والاسيتات والكحول والأحماض) عن طريق خلط الحلول الأسهم. وأخيراً، يؤدي إلى تمييع كميات مختلفة من الحلول القياسية في حل hydroalcoholic 12% يحتوي على حمض الطرطريك 5 غرام/لتر مع درجة الحموضة تعديلها إلى 3.3 لإعداد حلول المعايرة.
    5. في موازاة ذلك، تصحيح للعلامات الطبيعية من شدة كل مجموعة أيون وحساب إثراء النظائر للمركبات المتطايرة، الذي يعرف الكسر مسماة من الجزيئات، ويتم التعبير عنها كنسبة مئوية باستخدام برامج مخصصة 17.

6-العمليات الحسابية لإجراء تحليل متكامل لمجموعة البيانات

  1. جمع البيانات الأولية
    1. استخدام جداول البيانات المبينة في الجداول 5، 6، 7، و قم بإدخال قيم البيانات الخام التي تتوافق مع تركيز الأحماض الأمينية خارج الخلية، الخلية من الوزن الجاف، ومحتوى البروتين في الخلايا، وتركيز الجزيئات المتقلبة، والنظائر المشعة الإثراء من قائمة الأحماض الأمينية والجزيئات المتقلبة.
      ملاحظة: يتم التعبير عن البيانات الواردة في الجداول في مم. ويعبر أيضا عن جميع النتائج في مغ/لتر بضرب القيم في مم الوزن الجزيئي لكل جزيء أو مغ N/لتر بضرب ميليمولار تركيز الأحماض الأمينية قائمة الكتلة الذرية من النيتروجين (14 ش) وعدد من النيتروجين أتو مرض التصلب العصبي المتعدد التي يتم توفيرها من تقويض لهذا الجزيء.
    2. حساب النسبة المئوية الشامل لكل من الأحماض الأمينية في البروتينات بقسمة كميته في مغ/لتر في هيدروليساتي مبلغ إجمالي قدرة الأحماض الأمينية (بمجموع في مغ/لتر).
    3. حساب الوسائل والانحرافات المعيارية، والأخطاء المعيارية للوسط من البيانات التي تم الحصول عليها في التجارب المستقلة.
    4. حساب تركيز قائمة (مغ/لتر) لكل من الأحماض الأمينية بضرب النسبة المئوية لهذه الأحماض الأمينية في البروتينات (مغ أإ/ز البروتينات) بواسطة الكسر البروتين في الكتلة الأحيائية (ز البروتينات/ز دويتشه فيلة) ومحتوى الوزن الجاف (إنتاج الكتلة الأحيائية) في المتوسطة (ز DW/لتر).
  2. 15 تجارب التتبع النظائري N
    1. استخدام جداول البيانات التي ترد في الجدول 9، حساب الكسور المسماة وغير المسماة النيتروجين الموجودة في قائمة الأحماض الأمينية (معبراً عنها بملغ N/لتر) من تلك التركيزات الإجمالية (معبراً عنها بملغ N/لتر)، وعلى الفاسدون النظائر. لكل من الأحماض الأمينية، الكسر المسمى يتوافق مع المنتج بين تركيزه الكلي وتخصيب النظائر المشعة، والجزء غير مسمى هو الفرق بين المجموع المبالغ المسماة.
    2. ثم تحديد جزء صغير من مجموع النتروجين في البروتينات التي ترد في قائمة الأحماض الأمينية كمياً في هذه الدراسة بجمع المبلغ الإجمالي لعلاء، الغليسين، Val، آسيا والمحيط الهادئ، الفنيل ألانين، لوي، إيل، Thr، سر، برو، ليز، وله، وغلو والأرجنتين (في ملغ N/لتر)، وقسمة المجموع جبل النيتروجين الواردة في البروتينات بهذا المبلغ.
    3. حساب النيتروجين المقدمة من ارجينين، الجلوتامين أو الأمونيوم التي تم استردادها في قائمة الأحماض كمياً في هذه الدراسة بجمع الكسر المسمى (بملغ N/لتر) من قائمة الأحماض الأمينية التي تم تقديرها كمياً في الدراسة (علاء، الغليسين، فال، آسيا والمحيط الهادئ، Phe، لوي، إيل، Thr، سر، برو، ليز، له، وغلو، والأرجنتين) أثناء تجارب حضور 15ن المسمى ارجينين، الجلوتامين، أو الأمونيوم وقسمة المبلغ الإجمالي للنيتروجين في قائمة كمياً الأمينية هذا الكسر يسمى النيتروجين الأحماض.
    4. تقييم مساهمة الأحماض الأمينية الأكثر وفرة 3 إلى تجمع داخل الخلايا من النتروجين التي تستخدم تخليق حيثياته الحيوي عن طريق الجمع بين البيانات من 13ج و 15ن النظائر الراسم تجارب (جدول البيانات في الجدول 7).
    5. من إجمالي المبلغ (معبراً عنه بوحدات مم) من قائمة Val، لوي، وايل، أو Thr، خصم الجزء مستمدة من الإدماج المباشر للمركبات المستهلكة (13ج التجارب) والجزء الذي كان سينثيتيزيد نوفو دي استخدام النتروجين من 3 المصادر الرئيسية لتقييم الكسر الذي كان سينثيتيزيد نوفو دي استخدام النتروجين من الأحماض الأمينية الأخرى.
    6. ثم، حساب نسبة الكمية من الأحماض الأمينية دي نوفو سينثيتيزيد استخدام النتروجين تقدمها جلن، والأرجنتين، و NH4+ (مجموع المعرب عنها في مم) بمبلغ إجمالي قدرة قائمة الأحماض الأمينية (في مم) لقياس المساهمة ارجينين، الجلوتامين، والأمونيوم إلى تجمع النيتروجين داخل الخلايا.
  3. 13 تجارب التتبع النظائري ج
    1. حساب الكسور المسماة وغير المسماة الأحماض الأمينية قائمة من التركيزات في ملم والنظائر الفاسدون من قائمة الأحماض الأمينية التي تم الحصول عليها من خلال تجارب حضور 13ج المسمى اليورانيوم المنخفض التخصيب، فال، إيل أو Thr-(انظر 6.2.1، الجدول 10).
    2. حساب كسور المتطايرة من التركيزات في ملم والفاسدون النظائر للمركبات المتطايرة التي تم الحصول عليها من خلال تجارب حضور 13ج المسمى اليورانيوم المنخفض التخصيب، فال أو إيل Thr ( المسماة وغير المسماة الجدول 10).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويبين الشكل 3 رسم تخطيطي لسير العمل الذي تنفذه الخميرة من تعدد مصادر النيتروجين التي تم العثور عليها أثناء تخمير النبيذ للتحقيق في الإدارة.
للحصول على نقاط مختلفة لأخذ العينات والخصائص البيولوجية معلمات – النمو وأنماط استهلاك النيتروجين وملف التعريف من قائمة الأحماض الأمينية – تظهر إمكانية تكرار نتائج عالية بين تخمير (الشكل 4). هذا التناسق بالتحقق من صحة بأهمية النهج القائم على مجموعة البيانات التي تم إنشاؤها من خلال مجموعة من 14 تخمير مستقلة.

ويبين الشكل 5 نظرة شاملة لإعادة توزيع النيتروجين من المصادر المتوفرة في عصير العنب لجميع الأحماض الأمينية قائمة. ويدعم هذا التحليل أساسا النتائج التي تم الحصول عليها من التجارب التي أجريت في حضور 15المسمى ن المركبات. جنبا إلى جنب مع تحديد أرصدة الشامل والنظائر، قياس النظائر إثراء قائمة الأحماض الأمينية قدمت أول تقدير مساهمة ارجينين نشأ النتروجين، الجلوتامين والأمونيوم وغيرها مصادر لمجموعات أمين من كل من هذه المركبات. إعادة توزيع هامة من النيتروجين المسطر هنا يعكس الدور الكبير حيثياته التوليف من الأحماض الأمينية في استدامة نمو الخميرة.

وعلاوة على ذلك، تسمح هذه الدراسة، مقارنة كميات مركبات مسماة في البروتينات مع استهلاكها، جزء صغير الجزيئات المحتوية على ن المستهلكة التي أدرجت مباشرة في البروتينات عند دخول الخلايا إلى تقييم. قائمة الأحماض الأمينية تختلف تبعاً لمستوى الإدماج المباشر في الكتلة الحيوية؛ بعض من هم حصرا (آسيا والمحيط الهادئ، وغلو) أو أكثر من 80% دي نوفو سينثيتيزيد، بينما سوى كميات صغيرة من مركبات أخرى يتم إنشاؤها بواسطة التوليف حيثياته . وتشمل هذه المجموعة الأخيرة من المثير للاهتمام، يسين والحامض الأميني، وهي الأحماض الأمينية فقط تدرج فيه جميع المصادر المستهلكة مباشرة.

ويعرض الشكل 5B أيضا، لبعض الأحماض الأمينية، مقارنة بين كمية المستهلكة من الأحماض الأمينية التي يتم استردادها مباشرة في الكتلة الأحيائية، محسوبة من البيانات التي تم الحصول عليها في تجارب وسم ن 15وقياسها تجريبيا في 13 ج-وصف التجارب. إظهار الاختلافات الصغيرة بين هذه القيم والموثوقية ومتانة للنهج الذي تم تنفيذه في هذه الدراسة.

ويبين الشكل 6 مثال تقسيم الكمية (النسب) للتدفقات من خلال المسارات الأيضية التي تم الحصول عليها من خلال تنفيذ سير العمل ذكرت في هذه الورقة. هذه الخريطة ووجه الجمع بين المعلومات المستمدة من تجارب الراسم النظائر المشعة باستخدام ركائز المسمى ج ن-و 13 15وتوضح تقسيم الأحماض الأمينية الاليفاتيه المستهلكة في الشبكة الاستقلابية التي تشارك في فالين و لوسين الحيوي في الخميرة (للعمليات الحسابية، أرجع إلى الجدول 1 و الجدول 2). عن طريق قياس إنتاج وتخصيب النظائر المشعة من قائمة الأحماض الأمينية والمركبات المتطايرة، قمنا بتقييم كمية هذه المركبات التي تم سينثيتيزيد من العمود الفقري الكربون تستهلك يو ج13-فالين ويو-ج13- لوسين، الذي يتوافق مع الكسر مسماة من المركبات. وفي وقت لاحق، كنا قادرين على تحديد مساهمة CCM تكونها (الكسر غير مسمى من المركبات). أرصدة الكربون الشامل بإعداد باستخدام سير العمل والإجراءات العملية الحسابية التي يقترح هنا تظهر أن أكثر من 96 في المائة من فالين المستهلكة ولوسين يتم استردادها في منتجاتها التحويل، إلا وهي، لوسين قائمة وفالين والمتقلبة أعلى كحول. ويؤكد هذا الاستنتاج ملاءمة النهج المبلغ عنها للدراسات الكمية الأيض. ويقدم تحليل شامل ومتكامل من dataset رؤى جديدة في مصير الأحماض الأمينية المستهلكة. من المستغرب أن يتم كاتابوليزيد جزء كبير من فالين ولوسين رغم وجود اختلال كبير بين توافر هذه المركبات في الأجل المتوسط، ومضمونها في الكتلة الحيوية. ومع ذلك، جزء صغير من الخارجية مركبات ن إدراجها مباشرة في البروتينات يعتمد على طبيعة الأحماض الأمينية. نقطة أساسية أخرى تتعلق بأصل الأيضية قائمة الأحماض الأمينية والجزيئات المتقلبة. ويكشف تحليل لنمط العلامات ج 13لوسين قائمة وفالين أن هيكل عظمى الكربون من الأحماض الأمينية هذه تأتي بشكل رئيسي من السلائف التي تم سينثيتيزيد من خلال إليه التنسيق بين الدول. وتمشيا مع هذه الملاحظة، يوضح إدراج منخفضة من الملصقات في الكحول إيسوبوتانول وإيسواميل مشاركة محدودة للغاية لتقويض فالين ولوسين التي تم استهلاكها بالخميرة في تشكيل هذه الكحول أعلى.

Figure 1
رقم 1. نظام الروبوتية لرصد تخمير الفائق الآلي. (أ) منهاج الروبوتية. (أ) يتم وضع المخمرات في دعم أدلة على لوحات إثارة المغناطيسية (ب). ستارة خفيفة سلامة (ج) يحمي المستخدمين. ذراع روبوتية (د) يتحرك التخمير تباعا من موقعهم على واحد من 6 إثارة لوحات لتوازن دقة (ه) على الجهة اليسرى worktable، لقياس الوزن كل 4 ساعات. منهاج الروبوتية الموجود في غرفة التحكم في درجة الحرارة. (ب) التمثيل التخطيطي لهندسة البرمجيات. واجهة رسومية تمكن المستخدمين من تحديد إعدادات التجريبية. وتحال هذه المعلومات إلى التطبيق التحكم الذي يتحكم في الذراع الروبوتية ويسجل الوزن مختلفة في ملفات مختلفة data.xlm الخام (1 ملف في التخمير). البرنامج حساب ثم يقوم بتجميع الملفات xlm ويحسب لكل نقطة الوقت، مبلغ CO2 التي يتم إصدارها (معبراً عنها بغرام/لتر)، ويتناسب مع كمية السكريات التي استهلكت في هذه المرة، وأن معدل التخمير، الذي يتوافق مع معدل إنتاج2 أول أكسيد الكربون، في ز CO2/L/h (متناسبة مع معدل استهلاك السكر). البيانات المخزنة في قاعدة بيانات علائقية، وتصور باستخدام واجهة رسومية مكرسة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. تحليل GC-MS من قائمة الأحماض الأمينية: مثال من ألانين. (أ) Chromatogram تم الحصول عليها بعد derivatization من قائمة الأحماض الأمينية باستخدام دمفدما. (ب) الكتلة أطياف ألانين ديريفاتيزيد. اثنين من قمم الرئيسية التي تتوافق مع الشظايا مع/z0م = 99 و/z0م = 158. (ج) رد فعل Derivatization ألانين مع دمفدما. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. سير العمل للتحليل الكمي للتمثيل الغذائي للنيتروجين متعددة المصادر بالخميرة- وتشمل هذه العملية تخمير (ط) مجموعة من 28 (7 مصادر النيتروجين وتخمير مع أو بدون مركبات النيتروجين في مكرر)؛ (ثانيا) جزء تحليلي الذي ينطوي على إجراءات مختلفة لاستخراج و derivatization من الجزيئات وتحليلات [هبلك] أو مرض التصلب العصبي المتعدد-الآلية العالمية وتجهيز البيانات الخام (ثالثا) وتحليل متكامل لمجموعات البيانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. إمكانية تكرار نتائج بارامترات البيولوجية من مجموعة من تخمير المستقلة- (أ-ب) يعني القيم والانحرافات المعيارية للوزن الجاف ومحتوى البروتين التي تم الحصول عليها من تخمير المستقلة 14 التي نفذت باستخدام المركبات غير مسمى. (ج-د) يعني القيم والانحرافات المعيارية لقائمة والمستهلكة من الأحماض الأمينية التي قيست خلال 14 تخمير المستقلة القيام باستخدام المركبات غير مسمى. شركة إنتاج2 : 5 (أخضر) و 10 (أزرق)، 40 (الوردي) ز (الأرجواني) 90/ل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5. إعادة توزيع النيتروجين من مصادر النيتروجين الرئيسية الثلاثة لقائمة الأحماض الأمينية أثناء التخمير. (A) الأصل الأيضية للأحماض الأمينية قائمة: توجيه إدماج نظيره المستهلكة (الأزرق) وتوليف حيثياته استخدام النتروجين التي يوفرها المستهلكة ارجينين (برتقالي)، الجلوتامين (الأخضر)، والأمونيوم (الوردي) أو (الأحماض الأمينية الأخرى اللون الأرجواني). وأعرب كنسبة مئوية من المبلغ الإجمالي لكل قائمة من الأحماض الأمينية. (ب) مقارنة بين كمية المستهلكة من الأحماض الأمينية (الأزرق) والجزء من الأحماض الأمينية المستهلكة التي يتم استردادها مباشرة في البروتينات، محسوبة من البيانات التي تم الحصول عليها في 15ن الراسم تجارب (الأرجواني) أو تجريبيا قياس أثناء التخمير مع جزيئات المسمى ج 13(الوردي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الشكل 6. التحليل الكمي الأيض فالين ولوسين. تقسيم لوسين المستهلكة (الأخضر) وفالين (الأزرق) من خلال شبكة الأيضية عندما تنتج 40 غ/لتر من CO2 . الأشرطة تتناسب مع مقدار كل مجمع، ويتم التعبير عنها في ميكرومتر، بما في ذلك الكسر الذي كان سينثيتيزيد من الكربون المركزية الأيض (برتقالي). القيم في الخط العادية: المبلغ في ميكرومتر؛ القيم في الخط المائل: النسبة المئوية المستهلكة فالين (الأزرق) أو ليوسيني (الأخضر) التي تم كاتابوليزيد من خلال المسار. وترد في الجدول 1 و الجدول 2العمليات الحسابية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

المركبات المبلغ لكل لتر
الجلوكوز ج6ح12س6 240 غرام
حمض malic ج4ح6س5 ز 6
حمض الستريك ج6ح8س7 ز 6
بوتاسيوم فوسفات خ2ص4 ز 0.75
كبريتات البوتاسيوم K2SO4 ز 0.5
سلفات المغنزيوم MgSO4، 7 ح2س ز 0.25
كلوريد الكالسيوم CaCl2، 2 ح2س ز 0.155
كلوريد الصوديوم كلوريد الصوديوم ز 0.2
ميو-الإينوزيتول 20 ملغ
بانتوثينات الكالسيوم 1.5 ملغ
هيدروكلوريد الثيامين مغ 0.223
حمض النيكوتينيك 2 ملغ
البيريدوكسين 0.25 مغ
بيوتين 0.003
·4منسو ح2س 4 ملغ
زنسو4·7H2س 4 ملغ
CuSO4·5H2س 1 ملغ
كوكل2·6H2س 0.4 ملغ
بو ح33 1 ملغ
(NH4) 6 مو7س24 1 ملغ
ارجوستيرول مغ 3.75
حمض الأولييك ميليلتر 1.25
توين 80 125 ميليلتر
تيروزين 8.6 ملغ
التربتوفان ملغ 84.4
آيسولوسين 15.4 ملغ
اسبارتاتي مغ 20.9
غلوتامات مغ 56.7
ارجينين 176.2 ملغ
لوسين مغ 22.8
ثريونين 35.7 ملغ
جليكاين 8.6 ملغ
الجلوتامين مغ 237.8
ألانين مغ 68.4
فالين مغ 20.9
الميثيونين مغ 14.8
فينيلألانين 17.9 مغ
سيرين مغ 37.0
الحامض الأميني 15.4 ملغ
يسين 8.0 ملغ
سيستين 6.2 ملغ
برولين 288.3 ملغ
أمونيوم كلوريد NH4Cl 220 ملغ
تم تعديل درجة حموضة المتوسط إلى 3.3 مع هيدروكسيد الصوديوم 10 م.

الجدول 1. تكوين المتوسطة الاصطناعية المستخدمة في هذه الدراسة. يحاكي هذا المتوسط محددة كيميائيا تشكيلة عصير العنب.

شطف المخزن المؤقت درجة الحرارة
من 0 إلى 6 دقيقة سترات الليثيوم، 200 مم، الرقم الهيدروجيني 2.8 32 درجة مئوية
من 6 إلى 38 دقيقة سترات الليثيوم، 300 مم، الرقم الهيدروجيني 3 32 درجة مئوية
من 38 إلى 57 دقيقة سترات الليثيوم، 500 مم، الرقم الهيدروجيني 3.15 64.5 درجة مئوية
من 57 إلى 83 دقيقة سترات الليثيوم، 900 مم، 3.5 درجة الحموضة 75 درجة مئوية
من 83 إلى 120 دقيقة سترات الليثيوم، 1650 مم، الرقم الهيدروجيني 3.55 75 درجة مئوية
من 120 إلى 130 دقيقة هيدروكسيدي الليثيوم، 300 مم

الجدول 2. الشروط المستخدمة لفصل الأحماض الأمينية بالتبادل الأيوني اللوني. وتستخدم مخازن شطف مع زيادة تركيزات الملح تباعا في تركيبة مع تدرج درجة الحرارة لتمكين فصل الأحماض الأمينية.

الأحماض الأمينية كاشف ديريفاتيزينج RT (دقيقة) مجموعات أيون (m/z)
ألانين ECF 3.86 116، 117، 118، 119
دمفدماب 6.37 99، 100، 101، 102
دمفدماب 6.37 158، 159، 160، 161
جليكاين ECF 4.19 102، 103، 104
ECF 4.19 175، 176، 177
دمفدماب 6.61 85, 86, 87
دمفدماب 6.61 144، 145، 146
فالين ECF 4.97 144، 145، 146، 147، 148، 149
دمفدماب 7.37 127، 128، 129، 130، 131، 132
دمفدماب 7.37 143، 144، 145، 146، 147، 148
دمفدماب 7.37 186، 187، 188، 189، 190، 191
لوسين ECF 5.67 158، 159، 160، 161، 162، 163، 164
آيسولوسين ECF 5.85 158، 159، 160، 161، 162، 163، 165
ثريونين ECF 6.48 146، 147، 148، 149، 150
ECF 6.48 175، 176، 177، 178، 179
سيرين ECF 6.53 132، 133، 134، 135
ECF 6.53 175، 176، 177، 178
برولين ECF 6.83 142، 143، 144، 145، 146، 147
اسبارتاتي ECF 7.89 188، 189، 190، 191، 192
دمفدماب 11، 77 115، 116، 117، 118، 119
دمفدماب 11، 77 216، 217، 218، 219، 220
غلوتامات ECF 8.81 202، 203، 204، 205، 206، 207
دمفدماب 12.75 111، 112، 113، 114، 115، 116
دمفدماب 12.75 143، 144، 145، 146، 147، 148
دمفدماب 12.75 230، 231، 232، 233، 234، 235
فينيلألانين ECF 9.53 192، 193، 194، 195، 196، 197، 198، 199، 200، 201
دمفدماب 13.67 143، 144، 145، 146، 147، 148، 149، 150، 151، 152
يسين ECF 11.95 156، 157، 158، 159، 160، 161، 162
الحامض الأميني ECF 12.54 327، 328، 329، 330، 331، 332، 333
ارجينين بستفاج 18.8 174، 175، 176، 177، 178، 179
أ ECF، إيثيل تشلوروفورماتي؛ ب دمفدما، (ن، ن)-أسيتال والفثالات dimethylformamide؛ ج بستفا، (N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide).

الجدول 3. معلمات التحليلية المستخدمة لتحديد النظائر الفاسدون من الأحماض الأمينية استخدام المحدد أيون مراقبة الوضع (SIM). هذا الجدول يلخص العوامل الكيميائية المستخدمة ل derivatization، وقت الاحتفاظ بمركبات ديريفاتيزيد والمجموعة من الأيونات التي تم الحصول عليها في مرض التصلب العصبي المتعدد (الوضع أثر إلكترون) لكل من الأحماض الأمينية.

الأحماض الأمينية كاشف ديريفاتيزينج RT (دقيقة) مجموعات أيون (m/z)
ألانين ECF 3.86 116، 117، 118، 119
دمفدماب 6.37 99، 100، 101، 102
دمفدماب 6.37 158، 159، 160، 161
جليكاين ECF 4.19 102، 103، 104
ECF 4.19 175، 176، 177
دمفدماب 6.61 85, 86, 87
دمفدماب 6.61 144، 145، 146
فالين ECF 4.97 144، 145، 146، 147، 148، 149
دمفدماب 7.37 127، 128، 129، 130، 131، 132
دمفدماب 7.37 143، 144، 145، 146، 147، 148
دمفدماب 7.37 186، 187، 188، 189، 190، 191
لوسين ECF 5.67 158، 159، 160، 161، 162، 163، 164
آيسولوسين ECF 5.85 158، 159، 160، 161، 162، 163، 165
ثريونين ECF 6.48 146، 147، 148، 149، 150
ECF 6.48 175، 176، 177، 178، 179
سيرين ECF 6.53 132، 133، 134، 135
ECF 6.53 175، 176، 177، 178
برولين ECF 6.83 142، 143، 144، 145، 146، 147
اسبارتاتي ECF 7.89 188، 189، 190، 191، 192
دمفدماب 11، 77 115، 116، 117، 118، 119
دمفدماب 11، 77 216، 217، 218، 219، 220
غلوتامات ECF 8.81 202، 203، 204، 205، 206، 207
دمفدماب 12.75 111، 112، 113، 114، 115، 116
دمفدماب 12.75 143، 144، 145، 146، 147، 148
دمفدماب 12.75 230، 231، 232، 233، 234، 235
فينيلألانين ECF 9.53 192، 193، 194، 195، 196، 197، 198، 199، 200، 201
دمفدماب 13.67 143، 144، 145، 146، 147، 148، 149، 150، 151، 152
يسين ECF 11.95 156، 157، 158، 159، 160، 161، 162
الحامض الأميني ECF 12.54 327، 328، 329، 330، 331، 332، 333
ارجينين بستفاج 18.8 174، 175، 176، 177، 178، 179

الجدول 4. معلمات التحليلية المستخدمة لتحديد النظائر الفاسدون، والتقدير الكمي للمركبات المتطايرة باستخدام المحدد أيون مراقبة الوضع (SIM)- يلخص هذا الجدول الوقت الاستبقاء والمجموعة من الأيونات التي تم الحصول عليها في مرض التصلب العصبي المتعدد (الوضع أثر إلكترون) لكل مجمع متقلبة.

الجدول 5. تجهيز البيانات الأولية التي تم الحصول عليها من التحديد الكمي للأحماض الأمينية المتبقية Dataset يحتوي على بيانات من قياسات أحماض الأمينية الأولية والمتبقية. وتستخدم هذه القيم حساب كمية الأحماض الأمينية المستهلكة (بالطرح). يتم حساب الوسائل والانحرافات المعيارية لمزيد من العمليات الحسابية. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 6. تجهيز البيانات الأولية التي تم الحصول عليها من التحديد الكمي للأحماض الأمينية قائمة. هذا dataset يحتوي على بيانات عن تكوين الأحماض الأمينية البروتينات الكتلة الحيوية (A) وجزء صغير من البروتينات في الكتلة الحيوية (ب). يتم استخدام هذه القيم لتقييم النسبة المئوية الشامل لكل من الأحماض الأمينية في البروتينات (ج). يتم حساب الوسائل والانحرافات المعيارية لمزيد من العمليات الحسابية. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 7. قائمة الأحماض الأمينية. هذا جدول البيانات المستخدمة في حساب تركيز الأحماض الأمينية قائمة من البيانات الملخصة في الجدول 5 و الجدول 6(في مم). يتم حساب الوسائل والانحرافات المعيارية لمزيد من العمليات الحسابية. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 8. تجهيز البيانات الأولية التي تم الحصول عليها من التحديد الكمي للكحوليات أعلى. Dataset تتضمن بيانات من قياسات التركيزات مجمع المتقلبة (A) ويقوم بتحويل البيانات التي تم التعبير عنها بوحدات من مغ/لتر إلى ميكرومتر (ب). يتم حساب الوسائل والانحرافات المعيارية لمزيد من العمليات الحسابية. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 9. تجهيز البيانات الأولية التي تم الحصول عليها من تحديد النظائر الفاسدون من قائمة الأحماض الأمينية باستخدام 15ركائز المسمى ن.
يتم حساب الوسائل والانحرافات المعيارية لمزيد من العمليات الحسابية. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 10. تجهيز البيانات الأولية التي تم الحصول عليها من تحديد النظائر الفاسدون من قائمة الأحماض الأمينية والمركبات المتطايرة باستخدام 13ركازات المسمى ج.
يتم حساب الوسائل والانحرافات المعيارية لمزيد من العمليات الحسابية. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

التحديد الكمي لتقسيم المركبات عن طريق شبكات الأيضية باستخدام تجارب التتبع النظائري نهج واعدة لفهم عملية الأيض الميكروبي. هذه المنهجية، بينما طبقت بنجاح مع واحد أو اثنين من ركائز المسمى، لا يمكن حاليا تنفيذ دراسة أيض مصادر مختلفة باستخدام نظائر عنصري مسماة متعددة (أي، ركائز اثنين أو أكثر). وفي الواقع، تمكين التقنيات التحليلية المتاحة تحديد دقيق لوضع العلامات أنماط قائمة الأحماض الأمينية والجزيئات حصرا عند استخدام النظائر المشعة لعنصر واحد، وربما عندما وسم يشترك مع هذين العنصرين. ونتيجة لذلك، معالجة أوجه القصور هذه، وتقييم إدارة مصادر المغذيات متعددة من الكائنات المجهرية، اخترنا لتكرار مجموعة من الثقافات تحت نفس الظروف البيئية بينما وصفها ركيزة محدد مع 13ج أو 15 ن النظائر المشعة. ثم، كذلك مزيج من المعلومات المحددة التي يتم توفيرها من قبل كل 13ج أو تجربة الراسم 15ن يقدم رؤية موسعة كمية لإيض مصادر متعددة.

يعتمد تحقيق نهج المبلغ عنها في تنفيذ سلسلة استنساخه من الثقافات تحت الظروف القياسية وجمع عينات من أن خلايا في حالة فسيولوجية محددة هو نفسه بالنسبة لجميع الثقافات (الخلية نمو الاستهلاك من الركازة، إلخ). ويجب استيفاء هذه الشروط حيث أن البيانات التي تم الحصول عليها من تجارب مستقلة يمكن مختلطة وتحليلها معا. استيفاء هذه القيود يتطلب رصد دقيقة ومتكررة لنشاط الميكروبية التي أجريت، في أعمال تجريبية ذكرت هنا، باستخدام نظام الروبوت للرصد على الإنترنت لنشاط إنزيم الخميرة. ومع ذلك، يمكن استخدام الأساليب التقليدية لزراعة الكائنات الدقيقة والرصد، مثل تحديد نمو الخلايا عن طريق قياس الكثافة البصرية، لتطبيع إجراءات أخذ العينات.

شرط أساسي آخر للقيام بهذه المنهجية هو أن تكون لدينا رؤية واضحة للمسارات الأيضية التي تشارك في الشبكة للتحقيق. هذه المعرفة أمر ضروري لاختيار مجموعة ركائز المسماة التي هي الأكثر ملاءمة للتعامل مع هذه المسألة قيد الدراسة. مركبات مسماة، فضلا عن طبيعة ووضع العلامات (13ج، 15N، أو غيرها) داخل الجزيئات يجب أن يتم تحديد مؤهلات مناسبة من أجل أنا) استرداد كافة التسميات المقدمة من ركائز في المركبات المشتقة من تحليل الانتقاض، وهي كذلك في الإجراءات والثاني) الحصول على بيانات زائدة عن الحاجة التي توضح دقة المنهجية وصحة النتائج. ويشمل الإجراء الموضح هنا أيضا عدد هام من التحليلات التي يمكن أن تكون مضيعة للوقت ومكلفة في الموارد البشرية والمالية. وعلاوة على ذلك، بعض القيود التحليلية يمكن أن تحد من استخدام هذه المنهجية. أولاً، ينبغي ضمان أن المستخدمين كافة الأساليب التحليلية التي مطلوبة من أجل التحديد الكمي للمركبات المنتجة خلال الأيض الميكروبي وتتوفر بعزم على تخصيب النظائر. ثانيا، أن هذا النهج ينطبق فقط على تقييم أيض ركائز لكل تحويل المركبات يتم إنتاجها بكميات كافية كمياً بدقة.

في هذه الورقة، ونحن تطبيق سير العمل هذا لاستكشاف إدارة مصادر النيتروجين متعددة من الخميرة أثناء تخمير النبيذ. هذا التقرير يقدم رؤى جديدة في الأيض الخميرة، بما في ذلك تقويض كبيرة من الأحماض الأمينية الأكثر استهلاكاً، جنبا إلى جنب مع إدماجها المباشر منخفضة في البروتينات، ومساهمة رئيسية CCM لتوريد السلائف التي تستخدم تخليق الأحماض الأمينية قائمة حيثياته وتشكيل الجزيئات المتقلبة.

وبشكل أعم، يمكن استخدام النهج الموضح هنا للتحديد الكمي لتقسيم ركائز متعددة من خلال شبكة الأيضية لأي كائن حي مجهري. وسوف تسمح الباحثين للكشف عن مصير جميع مركبات تستهلك بعد دخول الخلايا ومعالجة تحديد منشأ الأيضية السلائف والمنتجات. هذه المعلومات يمكن أن تكون مفيدة لمقارنة النشاط الأيضي من السلالات التي لها خلفيات وراثية مختلفة أو تنمو تحت ظروف مختلفة، وبالتالي، لتصميم استراتيجيات رشيدة لتحسين عمليات التخمير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن نشكر موريت جان روش وديكين سيلفي وجان-ماري ساباليروليس للمساهمة في تصور نظام الروبوتية ساعد التخمير وبردال مارتين، نيكولا بوفييه وباسكال بريال لتقديم الدعم التقني لهم. التمويل لهذا المشروع كان قدمت دي وزارة التعليم الوطني، de la البحوث وتكنولوجي de la.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
D-Glucose PanReac 141341.0416
D-Fructose PanReac 142728.0416
DL-Malic acid Sigma Aldrich M0875
Citric acid monohydrate Sigma Aldrich C7129
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P5379
Potassium sulfate Sigma Aldrich P0772
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma Aldrich 230391
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C7902
Sodium chloride Sigma Aldrich S9625
Ammonium chloride Sigma Aldrich A4514
Sodium hydroxide Sigma Aldrich 71690
Manganese sulfate monohydrate Sigma Aldrich M7634
Zinc sulfate heptahydrate Sigma Aldrich Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate Sigma Aldrich C7631
Potassium iodine Sigma Aldrich P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate Sigma Aldrich C3169
Boric acid Sigma Aldrich B7660
Ammonium heptamolybdate Sigma Aldrich A7302
Myo-inositol Sigma Aldrich I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma Aldrich 21210
Thiamine, hydrochloride Sigma Aldrich T4625
Nicotinic acid Sigma Aldrich N4126
Pyridoxine Sigma Aldrich P5669
Biotine Sigma Aldrich B4501
Ergostérol Sigma Aldrich E6510
Tween 80 Sigma Aldrich P1754
Ethanol absolute VWR Chemicals 101074F
Iron (III) chloride hexahydrate Sigma Aldrich 236489
L-Aspartic acid Sigma Aldrich A9256
L-Glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L-Alanine Sigma Aldrich A7627
L-Arginine Sigma Aldrich A5006
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
L-Glutamine Sigma Aldrich G3126
Glycine Sigma Aldrich G7126
L-Histidine Sigma Aldrich H8000
L-Isoleucine Sigma Aldrich I2752
L-Leucine Sigma Aldrich L8000
L-Lysine Sigma Aldrich L5501
L-Methionine Sigma Aldrich M9625
L-Phenylalanine Sigma Aldrich P2126
L-Proline Sigma Aldrich P0380
L-Serine Sigma Aldrich S4500
L-Threonine Sigma Aldrich T8625
L-Tryptophane Sigma Aldrich T0254
L-Tyrosine Sigma Aldrich T3754
L-Valine Sigma Aldrich V0500
13C5-L-Valine Eurisotop CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine Eurisotop CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride Eurisotop NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine Eurisotop NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine Eurisotop NLM-396-PK
Ethyl acetate Sigma Aldrich 270989
Ethyl propanoate Sigma Aldrich 112305
Ethyl 2-methylpropanoate Sigma Aldrich 246085
Ethyl butanoate Sigma Aldrich E15701
Ethyl 2-methylbutanoate Sigma Aldrich 306886
Ethyl 3-methylbutanoate Sigma Aldrich 8.08541.0250
Ethyl hexanoate Sigma Aldrich 148962
Ethyl octanoate Sigma Aldrich W244910
Ethyl decanoate Sigma Aldrich W243205
Ethyl dodecanoate Sigma Aldrich W244112
Ethyl lactate Sigma Aldrich W244015
Diethyl succinate Sigma Aldrich W237701
2-methylpropyl acetate Sigma Aldrich W217514
2-methylbutyl acetate Sigma Aldrich W364401
3-methyl butyl acetate Sigma Aldrich 287725
2-phenylethyl acetate Sigma Aldrich 290580
2-methylpropanol Sigma Aldrich 294829
2-methylbutanol Sigma Aldrich 133051
3-methylbutanol Sigma Aldrich 309435
Hexanol Sigma Aldrich 128570
2-phenylethanol Sigma Aldrich 77861
Propanoic acid Sigma Aldrich 94425
Butanoic acid Sigma Aldrich 19215
2-methylpropanoic acid Sigma Aldrich 58360
2-methylbutanoic acid Sigma Aldrich 193070
3-methylbutanoic acid Sigma Aldrich W310212
Hexanoic acid Sigma Aldrich 153745
Octanoic acid Sigma Aldrich W279900
Decanoic acid Sigma Aldrich W236403
Dodecanoic acid Sigma Aldrich L556
Fermentor 1L Legallais AT1357 Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system Dominique Deutscher 029311
Fermenters (250 ml) Legallais AT1352 Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes Sarstedt 62.554.502
Fermentation locks Legallais AT1356 Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract Becton, Dickinson and Company 212750
BactoPeptone Becton, Dickinson and Company 211677
Incubator shaker Infors HT
Particle Counter Beckman Coulter 6605697 Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge Jouan GR412
Plate Butler Robotic system Lab Services BV PF0X-MA Automatic instrument
Plate Butler Software Lab Services BV Robot monitor software
RobView In-house developed calculation software
My SQL International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers Thermo Fisher Scientific 50088009 String Drive 60
BenchBlotter platform rocker Dutscher 60903
Ammonia enzymatic kit R-Biopharm AG 5390
Spectrophotometer cuvettes VWR 634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400 Secomam
Amino acids standards physiological - acidics and neutrals Sigma Aldrich A6407
Amino acids standards physiological - basics Sigma Aldrich A6282
Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent Biochrom BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid Sigma Aldrich S2130
Norleucine Sigma Aldrich N1398
Biochrom 30 AAA Biochrom
EZChrom Elite Biochrom Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium Biochrom BC80-6002-47 Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV Merck Millipore SLGVX13NL Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL VWR 514-4157 Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini Millipore XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm VWR 611-1380
Precision balance Mettler Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried Merck 1029310161 (max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven Legallais
Pierce BCA protein assay kit Interchim UP40840A
Formic acid Fluka 94318
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure Merck 1003171000 Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer Biochrom 80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids Sigma Aldrich AAS18
L-Methionine sulfone Sigma Aldrich M0876
L-Cysteic acid monohydrate Sigma Aldrich 30170
Pyrex glass culture tubes Sigma Aldrich Z653586
Pyridine Acros Organics 131780500 99% Extrapure
Ethyl chloroformate Sigma Aldrich 23131
Dichloromethane Sigma Aldrich 32222
Vials Sigma Aldrich 854165
Microinserts for 1.5ml vials Sigma Aldrich SU860066
GC/MS Agilent Technologies 5890 GC/5973 MS
Chemstation Agilent Technologies Instrument control and data analysis software
Methanol Sigma Aldrich 34860 Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998 ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal Sigma Aldrich 394963
BSTFA Sigma Aldrich 33024
DB-17MS column Agilent Technologies 122-4731 30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous Sigma Aldrich 238597
Technical nitrogen Air products 14629
Zebron ZB-WAX column Phenomenex 7HG-G007-11 30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP Air products 26699
Glass Pasteur pipettes VWR 612-1702

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts. Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).
  2. Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression. J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).
  3. Wiechert, W. 13C metabolic flux analysis. Metab Eng. 3, 195-206 (2001).
  4. Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints. Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).
  5. Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments. BMC Bioinformatics. 9, 266 (2008).
  6. Zamboni, N. 13C metabolic flux analysis in complex systems. Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).
  7. Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis. Biochimie. 91, 697-702 (2009).
  8. Quek, L. -E., Dietmair, S., Krömer, J. O., Nielsen, L. K. Metabolic flux analysis in mammalian cell culture. Metab Eng. 12, 161-171 (2010).
  9. Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value. J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).
  10. Magasanik, B., Kaiser, C. A. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 290, 1-18 (2002).
  11. Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190, 885-929 (2012).
  12. Cooper, T. G. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 39-99 (1982).
  13. Jones, E. W., Fink, G. R. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 182-299 (1982).
  14. Hazelwood, L. A., Daran, J. -M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism. Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).
  15. Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions. J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).
  16. Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network. Genome Res. 13, 244-253 (2003).
  17. Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments. Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).
سير العمل على أساس المزيج تجارب التتبع النظائري للتحقيق الأيض الميكروبي من عدة مصادر المغذيات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bloem, A., Rollero, S., Seguinot, P., Crépin, L., Perez, M., Picou, C., Camarasa, C. Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources. J. Vis. Exp. (131), e56393, doi:10.3791/56393 (2018).More

Bloem, A., Rollero, S., Seguinot, P., Crépin, L., Perez, M., Picou, C., Camarasa, C. Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources. J. Vis. Exp. (131), e56393, doi:10.3791/56393 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter