Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Arbejdsproces baseret på en kombination af isotopiske Tracer eksperimenter til at undersøge mikrobiel metabolisme af flere næringsstoffer kilder

doi: 10.3791/56393 Published: January 22, 2018

Summary

Denne protokol beskriver en eksperimentel procedure kvantitativt og grundigt undersøge metabolismen af flere næringsstoffer kilder. Denne arbejdsproces, baseret på en kombination af isotopiske tracer eksperimenter og en analytisk procedure, tillader skæbnen af forbrugt næringsstoffer og metaboliske oprindelsen af molekyler synthetized af mikroorganismer skal fastlægges.

Abstract

Undersøgelser inden for Mikrobiologi stole på gennemførelsen af en bred vifte af metoder. Især bidrager udviklingen af hensigtsmæssige metoder væsentligt til at yde omfattende viden om metabolismen af mikroorganismer vokser i kemisk definerede medier indeholdende unikke kvælstof og kulstof kilder. Derimod forbliver forvaltning gennem metabolisme af flere næringsstoffer kilder, trods deres brede tilstedeværelse i naturlige eller industrielle miljøer, stort set uudforskede. Denne situation skyldes hovedsagelig manglen på hensigtsmæssige metoder, som hindrer undersøgelser.

Vi rapporterer en eksperimentel strategi at kvantitativt og grundigt undersøge hvordan stofskifte fungerer når et næringsstof er givet som en blanding af forskellige molekyler, dvs, en kompleks ressource. Her, beskriver vi sin ansøgning om vurdering af partitionering af flere kvælstof kilder gennem gær metaboliske netværk. Arbejdsprocessen kombinerer oplysninger indhentet under stabile isotop tracer eksperimenter ved hjælp af udvalgte 13C- eller 15N-mærket substrater. Den første består af parallelle og reproducerbare fermenteringer i det samme medium, som omfatter en blanding af N-holdige molekyler; imidlertid er valgte kvælstof kilde mærket hver gang. En kombination af analytiske procedurer (HPLC, GC-MS) er gennemført til at vurdere de mærkning mønstre af målrettede forbindelser og kvantificere forbrug og inddrivelse af substrater i andre metabolitter. En integreret analyse af det komplette datasæt indeholder en oversigt over skæbnen af forbrugt substrater i celler. Denne tilgang kræver en nøjagtig protokol for indsamling af prøver – lettet af en robot-assisteret system til online overvågning af fermenteringer – og opfyldelse af talrige tidskrævende analyser. Trods disse begrænsninger, er det tilladt forståelse, for første gang, en opdeling af flere kvælstof kilder hele gær metaboliske netværk. Vi belyst omfordeling af kvælstof fra mere rigelige kilder mod andre N-forbindelser og bestemmes de metaboliske oprindelsen af flygtige molekyler og proteinogeniske aminosyrer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Forståelse er hvordan mikrobiel metabolisme fungerer et nøglespørgsmål for udformningen af effektive strategier til at forbedre gæring processer og modulere produktion af Fermentativ forbindelser. Fremskridt inden for genomforskning og funktionel genomforskning i disse sidste to årtier i høj grad bidraget til at udvide kendskabet til topologien for metaboliske netværk i mange mikroorganismer. Adgang til disse oplysninger førte til udviklingen af strategier, der sigter til et samlet overblik over cellefunktion1. Disse metoder er ofte afhængige en modelbaseret fortolkning af målelige parametre. Disse eksperimentelle data omfatter på den ene side metabolit optagelsen og produktion priser, og på den anden side kvantitative intracellulære oplysninger, der er fremstillet af isotop tracer eksperimenter. Disse data giver væsentlige oplysninger for fradrag i vivo aktivitet af forskellige veje i en defineret metaboliske netværk2,3,4. I øjeblikket, de tilgængelige analytiske teknikker kun giver nøjagtig påvisning af mærkning mønstre af molekyler, når ved hjælp af et enkelt element isotop og eventuelt når Co mærkning med to isotopiske elementer. Desuden under de fleste vækstbetingelser består carbon kilde kun af én eller to-forbindelser. Derfor blev strategier baseret på 13C-isotopiske røbestoffer fra carbon substrater bredt og med succes anvendt til at udvikle en fuldstændig forståelse af kulstof metaboliske network operations5,6,7 ,8.

Derimod i mange naturlige og industrielle miljøer, er den tilgængelige kvælstof ressource, der understøtter mikrobiel vækst ofte sammensat af en lang række molekyler. For eksempel undergæring vin eller øl er kvælstof fastsat som en blanding af 18 aminosyrer og ammonium på varierende koncentrationer9. Denne vifte af N-forbindelser, der er tilgængelige for anabolisme gør disse komplekse medier betingelser meget forskellige fra dem, der almindeligvis anvendes til fysiologiske studier, som sidstnævnte er opnået ved hjælp af en unik kilde til kvælstof, typisk ammonium.

Samlet set internaliseret kvælstof forbindelser kan være direkte indarbejdet i proteiner eller kataboliseres. Netværksstruktur kvælstof metabolisme i mange mikroorganismer, herunder gær Saccharomyces cerevisiae, er meget kompliceret i overensstemmelse med mangfoldigheden af substrater. Skematisk, er dette system baseret på en kombination af den centrale kerne af kvælstof stofskifte, som katalyserer omdannelse af glutamin, glutamat, og α-ketoglutarat10,11, med transaminaser og deaminases. Gennem dette netværk, amine grupper fra ammonium eller andre aminosyrer er samlet og α-keto syrer frigivet. Disse mellemprodukter er også synthetized gennem central carbon stofskifte (CCM)12,13. Dette store antal forgrenede reaktioner og mellemprodukter, involveret i både katabolisme af eksogene kvælstof kilder og anabolisme proteinogeniske aminosyrer, opfylder de anabolske krav for cellerne. Aktivitet gennem disse forskellige indbyrdes forbundne veje medfører også udskillelsen af metabolitter. Især kan α-keto syrer blive omdirigeret gennem Ehrlich sti til at producere højere alkoholer og deres acetat ester derivater14, som er væsentlige bidragydere til sensoriske profiler af produkter. Efterfølgende, spiller hvordan kvælstof stofskifte fungerer en central rolle i produktion af biomasse og dannelsen af flygtige molekyler (aroma).

Reaktioner, enzymer og gener involveret i kvælstof stofskifte er udførligt beskrevet i litteraturen. Men spørgsmålet om fordelingen af flere kvælstof kilder hele en metabolisk netværk har endnu ikke blevet behandlet. Der er to hovedårsager til at forklarer denne manglende oplysninger. Først, i betragtning af kvælstof stofskifte netværk vigtigt kompleksitet, en stor mængde kvantitative data er nødvendige for en fuldstændig forståelse af dens drift, der var tilgængelige indtil nu. Andet, mange eksperimentelle begrænsninger og begrænsninger af analysemetoder forhindrede gennemførelse af tiltag, der tidligere blev brugt til belysning af CCM funktion.

For at overvinde disse problemer, valgte vi at udvikle en system-niveau tilgang, der bygger på forsoning af data fra en række isotopiske tracer eksperimenter. Arbejdsgangen indeholder:
-Et sæt af fermenteringer foretaget under samme miljøforhold, mens en anden valgte næringsstof kilde (substrat) er mærket hver gang.
-En kombination af analytiske procedurer (HPLC, GC-MS) for en nøjagtig bestemmelse, på forskellige stadier af gæring af restkoncentrationen af mærket substrat og koncentrationen og isotopiske berigelse af forbindelser, der er afledt fra katabolisme af det mærkede molekyle, herunder afledte biomasse.
-En beregning af den masse og isotopiske balance for hver forbrugt mærket molekyle og en yderligere integreret analyse af datasæt til at opnå en global oversigt over forvaltningen af flere næringsstoffer kilder af mikroorganismer gennem bestemmelse af flux nøgletal .

Hvis du vil anvende denne metode, skal være opmærksom reproducerbare funktionsmåden for stamme/mikroorganisme mellem kulturer. Derudover skal prøver fra forskellige kulturer tages under den samme veldefinerede gæring fremskridt. I det eksperimentelle arbejde rapporteret i dette manuskript, bruges en robot-assisteret system til online overvågning af fermenteringer at tage højde for disse begrænsninger.

Derudover er det vigtigt at vælge et sæt af mærket substrater (sammensatte, art og placering af mærkning), der er passende på videnskabelige problemet af undersøgelsen. Her, blev 15N-mærket ammonium, Glutamin og arginin udvalgt som de tre store kvælstof kilder fundet i druesaft. Dette gav mulighed for vurdering af mønstret af kvælstof omfordeling fra forbrugte forbindelser til proteinogeniske aminosyrer. Vi har også til formål at undersøge skæbnen af kulstof rygraden i de forbrugte aminosyrer og deres bidrag til produktionen af flygtige molekyler. For at opfylde denne målsætning, ensartet 13C-mærket leucin, blev isoleucin, threonin og valin inkluderet i undersøgelsen som aminosyrer, der er afledt af store mellemprodukter af Ehrlich sti.

Alt i alt udforsket vi kvantitativt hvordan gær administrerer en kompleks kvælstof ressource ved at omfordele eksogene kvælstof kilder for at opfylde dens anabolske krav i hele gæringen mens du derudover fjerner overskydende af kulstof prækursorer som flygtige molekyler. Forsøgsmetoden rapporteret i dette papir kan anvendes til at undersøge andre flere næringsstoffer kilder bruges af nogen andre mikroorganisme. Det synes at være en passende tilgang til analyse af virkningen af genetiske baggrund eller miljømæssige forhold på den metaboliske opførsel af mikroorganismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. gæring og prøveudtagning

  1. Forberedelse af medier og gæringsanlæg
    Bemærk: Alle fermenteringer er gennemført i parallel, ved hjælp af samme stamme og i samme kemisk defineret syntetiske medium (SM, sammensætning fremgår af tabel 1), som omfatter en blanding af ammonium og aminosyrer som kvælstof kilder15. Hver gæring, er en enkelt kvælstof sammensatte til rådighed udelukkende i en ensartet mærket 13C eller 15N form (100%), mens de andre fortsat uden etiket. For hver mærket kvælstof, der bruges i sæt af forsøg (her: 15NH4, U -15N4-Arg, U -15N2-Localisation, U -13C6-Leu, U -13C5-Val, U -13C6-Ile, U -13C4-Thr), to Overgæring er forberedt. For hver betingelse udføres dublerede gæringen, ved hjælp af kun umærkede molekyler (7 control forgæring).
    1. For hvert N-kilde til undersøges, udarbejde 500 mL af SM medium, der indeholder alle de kvælstof kilder der er anført i tabel 1, med undtagelse af sammensatte anvendes i 100% mærket form.
      Bemærk: Det mærkede molekyle er tilføjet i de næste skridt.
    2. Pasteurisere hvert medium i en 1 L målekolbe (10 min, 100 ° C) indeholdende en magnetisk omrøring bar. Vejer den passende mængde af mærket molekyle at nå den endelige koncentration, der er rapporteret i tabel 1 og opløse den i mediet.
    3. Sterilisere medium ved hjælp af en engangs vakuum filtreringssystem (celluloseacetat membran, 0,22 µm). Ved hjælp af en steril måleglas, opdele medium mellem to steriliseret gæringsanlæg (250 mL), der indeholder en magnetisk omrøring bar og er udstyret med gæring låse for at undgå optagelse af ilt, men giver mulighed for frigivelse af CO2.
    4. Varme gæring kolber til 28 ° C ved at placere dem i inkubation room for 1 nat (temperatur på 28 ° C).
  2. Podning og overvågning af fermenteringer
    1. Vokse S. cerevisiae stamme i sterile rør indeholdende 10 mL af YPD medium ved 28 ° C under omrystning (150 rpm) for 12 timer. Derefter afpipetteres 1 mL af YPD preculture og overføre det til 10 mL af SM medium (i 15 mL sterilt rør). Inkuber kultur i 12 timer ved 28 ° C under omrystning (150 rpm).
    2. Under laminar flow, indsamle en alikvot preculture og kvantificere den celle befolkning ved hjælp af en elektronisk partikel tæller, der er udstyret med en 100 µm blænde. Centrifugeres preculture (2.000 x g, 15 min, 4 ° C) og suspendere pellet i et passende volumen af sterilt vand til at opnå en endelig koncentration på 2,5 x 108 celler/mL. Podes hver fermenteringstanken med 1 mL af cellesuspension.
      Bemærk: Den robot system bruges til at overvåge status i gæring er beskrevet i figur 1.
    3. Klargør gæring platform ved at installere gæringsanlæg i støtte guider, der er korrekt placeret på 21-position omrøring plader og indstiller den omrøring hastighed på 270 rpm. For at starte online overvågning af hver gæring, starte programmet robot-kontrol så klik på knappen "start analyse" og vælge gæring volumen skal gennemføres (300 mL).
    4. Den viste grænseflade tillader angivelse af antallet og placeringen af gæringsanlæg på platformen. For at sikre, at dette sker, skal du højreklikke på lokationen slot og vælg "enable" til at aktivere overvågning af fermenteringstanken beliggende på denne holdning.
    5. Initialisere beregningssoftware, permanent kører på systemet, før du starter vægttab erhvervelse. Klik på knappen "Antalsfeltet" og validere med "ok". Klik på knappen"Start" af robot-kontrol ansøgning til start vægt erhvervelser.
  3. Prøveudtagningsprocedure
    Bemærk: For hver fermenteringstanken, udtages når CO2 produktion (værdi vist on-line på den computer, der kører software til beregning af det) når det krævede sætpunktet: 5, 10, 40 og 90 g/L i denne undersøgelse.
    1. Prøveudtagning procedure for kulturer med mærket forbindelser.
      1. Der centrifugeres to 6 mL prøver (2.000 x g, 5 min, 4 ° C). Opspare og opmagasinere de frosne supernatanter i to delprøver på-80 ° C. Vask piller to gange med 5 mL destilleret vand og opbevares ved-80 ° C til måling af isotopiske enrichments.
    2. Prøveudtagning procedure for kulturer uden mærket forbindelser
      1. Høste 10 mL af kultur, som vil blive anvendt til bestemmelse af toerstofindholdet. Sammenpresse cellerne fra to 10 mL prøver ved centrifugering (2.000 x g, 5 min, 4 ° C). Vask piller to gange med 10 mL destilleret vand og gemme dem på-80 ° C til bestemmelse af protein og amino syre indhold.

2. kvantificering af forbrugt kvælstof kilder

  1. Enzymatisk bestemmelse af resterende ammoniak koncentrationen
    Bemærk: Bestemmelse af ammoniak koncentrationen i supernatanter er foretaget ved hjælp af en kommerciel enzym-baserede kit; Alle reagenser leveres af producenten.
    1. Forberede en standard ammoniakopløsning (61.4 mg/L) ved at opløse 25 mg af netop vejes (NH4)24 i en 100 mL målekolbe.
    2. For at opfylde fabrikantens anvisninger, udføre en 1:2 fortynding af prøverne, der blev truffet før gæringen og på 5 g/L CO2 udgivet. Juster pH-værdien af prøverne til ca 8 ved at tilføje 1 M KOH. Tage til efterretning af den tilsatte mængde og højde i fortyndingsfaktoren.
    3. I 4 mL spektrofotometrets kuvetter, mix 100 µL af prøven (fortyndet hvis nødvendigt), destilleret vand eller standard ammoniakopløsning med 2 mL af reagenset 1 (0,75 mM ADP og 30 U/mL glutamat dehydrogenase i pH 7,8 buffer) og 500 µL af reagens 2 (1,3 mM NADH). Inkuber i 15 min. ved stuetemperatur og læse NADH absorbans ved 340 nm (A1).
    4. Tilsættes 500 µL af reagens 3 (60 mM α-ketoglutarat i pH 8 buffer), inkuberes prøven i 20 min. ved stuetemperatur og læse NADH absorbans ved 340 nm (A2).
    5. Beregne ammoniak koncentrationen ved hjælp af:
      Cammoniak (g/L) = 0.083 x [(0.839 x A1-A2)prøve- (0.839 x A1-A2)destilleret vand]
    6. Kontroller, at den korrekte koncentration opnås med standardopløsning.
  2. Kromatografiske bestemmelse af resterende aminosyre koncentrationer
    Bemærk: Bestemmelse af aminosyre koncentrationer i analysere opnås ved hjælp af en dedikeret aminosyre analysesystem, der er baseret på ion-udveksling kromatografi med post kolonne forædling af N-forbindelser med ninhydrin, som giver deres kolorimetrisk detektion.
    1. Forbered en reference løsning ved at tilføje 200 µL af en kommerciel blanding af neutral og sure aminosyrer, 200 µL af en kommerciel blanding af grundlæggende aminosyrer og 200 µL af 2,5 mM glutamin til 400 µL af 200 mM lithium citratbuffer, pH 2.2. Denne kemisk definerede reference løsning er behandlet som en prøve.
    2. Tilføje 200 µL af 25% (w/v) sulfosalicylic syre, der indeholder 2,5 mM norleucine (intern standard) til 800 µL af prøven at fjerne molekyler med høj Molekylær vægt. Inkuber i 1 time ved 4 ° C, centrifuge (3.000 x g, 10 min, 4 ° C) og filtreres gennem et 0,22 µm pore-størrelse nitrocellulose membran (sprøjte system).
    3. I programmør softwaren, klik på knappen "Run" til at begynde den væskekromatografi (LC) analyser med analyzer udstyret med en kationbytterkolonnen (lithium form). Elueres aminosyrer med successive lithium buffere til at oprette både en pH gradient og en gradient i Counter ion koncentration i kombination med en temperaturgradient (tabel 2).
    4. Kvantificere kvaelstofforbindelser efter ninhydrin forædling af en spektrofotometrisk detektor ved 570 nm (lilla farve: reaktion mellem gruppen af aminosyrer ninhydrin og Amin) og 440 nm (gul farve: reaktion mellem ninhydrin og imine gruppe af prolin).
    5. Udføre en single-point intern kalibrering ved hjælp af reference løsning og norleucine som en intern standard til at beregne koncentrationerne af aminosyrer i prøverne ved hjælp af producentens software.

3. kvantificering af proteinogeniske aminosyrer

  1. Måling af tør celle vægt
    1. Filtrer 10 mL af kultur gennem en nitrocellulose filter (pore størrelse 0,45 µm), der er pre vejes i en aluminium cup, ved hjælp af en vakuumanordning. Vaskes to gange med 50 mL destilleret vand.
    2. Placer filteret i aluminium cup og tørre i en varme ovn ved 105 ° C for 48 h (indtil ingen yderligere ændringer i vægt er observeret) før indsigelsens filter i koppen. Beregn vægtforskel.
    3. Beregne gennemsnittet af mindst 3 uafhængige målinger til præcist bestemme tør celle vægten af gær kultur.
  2. Kvantificering af proteinindhold i celler
    Bemærk: Kvantificering af proteinfraktion celler udføres mindst i tre eksemplarer med umærkede celle pellets, der var opnået som beskrevet i afsnit 1.3.2.
    1. Uddrag proteiner ved tilsætning af 1 mL af DMSO løsning (50% v/v) til frosne pellets og inkuberes ved 105 ° C i 1 time i en tør varme ovn.
    2. Kvantificering af proteinindhold i DMSO ekstrakter ved hjælp af biokemiske kolorimetriske analysen, der er baseret på en reduktion af proteiner af Cu++ ind i Cu+ -ioner, der er yderligere fremskyndet af bicinchoninic syre i en blå kompleks (BCA assay).
  3. Bestemmelse af aminosyrer i proteiner relative bidrag
    Bemærk: Profil af proteinogeniske aminosyrer bestemmes mindst tre eksemplarer fra umærkede celle pellets (1.3.2.).
    1. Forberede et oxideret uddrag ved at suspendere den celle pellet i 200 µL af performic syre (90% myresyre, 10% hydrogenperoxid). Inkuber i 4 h ved 4 ° C og reaktionen standses ved tilsætning af 33,6 mg natrium sulfat.
      Bemærk: Oxidation skridt er forpligtet til at konvertere cystein og methionin til methionin sulfon og cysteinsyre syre, som yderligere vil kvantificeres ved ionbytning kromatografi. Men, nogle aminosyrer (tyrosin, phenylalanin, histidin og arginin) er denatureret under oxidation behandling. Derfor er to hydrolysater (med og uden oxidation) forberedt.
    2. Tilføje 800 µL 6N HCL til celle pellets eller oxideret ekstrakt og inkuberes prøven i et hermetisk lukket glasrør i 16 timer ved 110 ° C i en tør varme ovn. Tilføje 200 µL af 2,5 mM norleucine og fjerne HCl med kvælstof. Vask (resuspending de tørrede ekstrakt og derefter fjerne væsken med en nitrogen stream) to gange med 800 µL destilleret vand og derefter med 800 µL af ethanol. Tage i 800 µL af 200 mM lithium acetat buffer, pH 2.2.
      Bemærk: Opmærksomhed bør betales at inkubationstiden for hydrolyse, som nogle aminosyrer ikke er stabil sure betingelser. Tryptophan-fraktionen i protein er anslået fra data findes i litteraturen16, som denne aminosyre er fuldstændig denatureret under HCl hydrolyse.
    3. Forberede et hydrolysat standard for single-point intern kalibrering. Tilføje 160 µL af en kommerciel løsning af hydrolyseret aminosyrer til 840 µL af 200 mM lithium acetat buffer, pH 2.2, der indeholder 625 µM methionin sulfon, 625 µM cysteinsyre syre og 625 µM norleucine.
    4. Bestemme de relative koncentrationer af aminosyrer i proteiner kromatografiske metoden beskrevet i afsnit 2.2.
  4. Beregninger
    1. Beregn vægt procentdel af hver aminosyre i proteiner ved at dividere den målte mængde af hver aminosyre (mg/L) af det samlede beløb af aminosyre, der blev målt i protein ekstrakt (sum i mg/L).
    2. Formere denne procentdel af koncentrationen af proteiner i kultur (mg/L), dvs, produkt mellem proteinindholdet i biomassen og tørvægt at vurdere koncentrationen af hver proteinogeniske aminosyre i kultur (mg/L).

4. måling af isotopiske berigelse af proteinogeniske aminosyrer

Bemærk: Til måling af isotopiske berigelse af proteinogeniske aminosyrer, bruge mærket celle pellets. Tre forskellige agenter bruges til forædling skridt for at kvantificere den isotopiske berigelse af aminosyrer. Intensiteter af klynge ioner er målt til at anslå de mærkning mønstre af aminosyrerne. Signalet fra hver klynge ion svarer til overflod med den masse isotopomers (m0 = uden mærkning, m+ 1 = 1 mærket atom,...) af en aminosyre fragment. Et eksempel på et kromatogram, der er fremstillet efter DMADMF proceduren er fastsat i figur 2.

  1. Biomasse hydrolyse
    1. Hydrolysere celle pellets (svarende til 1-2 mg tørret biomasse) ved at tilføje 1,2 mL 6 M HCl og inkubere stikprøve for 16 timer ved 105 ° C i tæt lukket glasrør i en tør varme ovn.
    2. Tilføje 1,2 mL destilleret vand, og der centrifugeres ved 3.000 x g i 5 min at fjerne celleaffald. Distribuere supernatanten i seks 400 µL fraktioner i åben glasrør. Tørre fraktioner i en varme ovn ved 105 ° C, indtil de når sammenhængen i sukkerlage (4-5 h).
  2. Ethylchloroformate (ECF) forædling
    1. Opløses de tørrede hydrolysat i 200 µL af 20 mM HCl; derefter tilføje 133 µL pyridin: ethanol (1:4). Tilsæt 50 µL af ECF til derivatize af aminosyrer og vente, indtil alle CO2 er blevet frigivet. Overfør blandingen for at centrifugeres rør, der indeholder 500 µL af dichlormethan til at udtrække de derivatized forbindelser.
    2. Vortex rør til 10 s og centrifugeres dem i 4 min på 10.000 x g; indsamle de lavere organiske fase med Pasteur pipette og overførsel til GC hætteglas, som indeholder konisk glas indsatse, således at prøverne kan injiceres direkte i GC/MS-instrument.
  3. (N, N)-dimethylformamid dimethyl acetal (DMFDMA) forædling.
    1. Opløses de tørrede hydrolysat i 50 µL af methanol og 200 µL af acetonitril. Tilsæt 300 µL af DMFDMA. Vortex røret og overførsel prøver at GC autosampler hætteglas der indeholder konisk glas indsatse.
  4. N, O-Bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA) forædling
    1. Suspendere hydrolysat i 200 µL af acetonitril. Tilføje 200 µL af BSTFA, hermetisk lukker glasrør og Inkuber i 4 h på 135 ° C før du overfører ekstraktet direkte til GC hætteglas.
  5. GC-MS analyse
    1. Analysere prøver med en gaskromatograf, der er udstyret med en autosampler injektor og er koblet til et massespektrometer.
      1. Bruge instrument-specifik software til at styre instrumentet og analysere kromatogrammer. I menuen "Sekvens", "Log eksempeltabellen" for at oprette listen prøve, og klik på "Kør" knappen for at starte injektionerne.
        Bemærk: Gaskromatografen er udstyret med en 30 m x 0,25 mm apolar silica kapillarkolonne med 0,15 μm filmtykkelse. Indstille massespektrometer Quadrupol temperatur på 150 ° C og holde overflytningslinjen ved 250 ° C for alle analyser. Tre analytiske programmer, hver en specifik hver forædling agent, der bruges.
      2. ECF derivater: Brug helium som den mobile fase med en strøm af 1,2 mL/min. Indstil temperaturen af fjorden ved 230 ° C og af kilden ved 250 ° C. Programmere autosampler til Injicér 1 µL af prøver med en split forholdet 3:1. Køre analyser, gradvist stigende ovntemperatur som følger: 130 ° C i 3 min. forløb 15 ° C/min. til 260 ° C; vedligeholde temperatur ved 260 ° C i 20 min.
      3. DMFDMA derivater: Brug helium som den mobile fase med en konstant strøm af 1,2 mL/min. Indstil temperaturen af fjorden ved 230 ° C og af kilden ved 250 ° C. Programmere autosampler til Injicér 1 µL af prøver med en split forholdet 3:1. Køre analyser, gradvist stigende ovntemperatur som følger: 60 ° C i 1 min; hældning på 20 ° C/min. til 130 ° C; andet forløb på 4 ° C/min. til 260 ° C; vedligeholde temperatur ved 260 ° C i 10 min.
      4. BSTFA derivater: Brug helium som den mobile fase med en konstant strøm af 1,2 mL/min. Indstil temperaturen af fjorden på 275 ° C og af kilden ved 300 ° C. Køre analyser (injektion: 1 µL), gradvist øge temperaturen som følger: 110 ° C i 1 min; første gradient på 2 ° C/min. til 154 ° C; andet forløb på 5 ° C/min. til 300 ° C; vedligeholde temperatur ved 300 ° C i 10 min.
      5. Detection procedure: For hver transportform forædling, indsprøjtes en prøve (1 µL) i scanningstilstand med positive elektron indvirkning ionisering på 70 eV og notere for retentionstid for hver aminosyre.
      6. Brug disse værdier til at definere tidsvinduer hele kromatogrammet og for de forskellige udvalgte ioner, som er karakteristisk for hver aminosyre og er opført i tabel 3. disse værdier skal medtages for hver aminosyre. Medtage disse oplysninger i scanningsprogrammet i SIM og køre analyserne i SIM-tilstand med positive elektron indvirkning ionisering på 70 eV.
    2. Indsamle resultaterne af analyser; nemlig, for hver aminosyre, optage en klynge af intensiteter, der svarer til sin anden masse isotopomers. Behandle data, der anvender dedicatedsoftware17 til at korrigere for naturlige mærkning og beregne den isotopiske berigelse af proteinogeniske aminosyrer (defineret som den mærket brøkdel af en aminosyre med hensyn til det samlede beløb i proteinet prøver).
      Bemærk: Den isotopiske berigelse af et molekyle (dvs.), udtrykt som en procentdel, beregnes dividere summen af de korrigerede intensiteter af den massive isotopomers med mærkning (m1, m2,.. .mn) af summen af den korrigerede intensiteter af alle mass isotopomers (m0, m1, m2,... mn):
      I. E. = (m1 + m2 +... + mn) / (m0 + m1+ m2 +... + mn)

5. kvantificering og isotopiske berigelse af flygtige forbindelser

  1. Udvinding af mærket flygtige forbindelser
    1. Tilsæt 10 µL af deutereret interne standarder til 5 mL af supernatanten (endelig koncentration af deutereret forbindelser: 100 µg/L) i en 15 mL glasrør. Tilsættes 1 mL dichlormethan, stramt lukke rør og ryste dem på en vuggende platform for 20 min. der centrifugeres i 5 min på 3.000 x g og indsamle den organiske lavere fase i en 15 mL glasrør. Gentag dichlormethan udvinding.
    2. Tør den økologiske ekstrakt over 500 mg af vandfri natriumsulfat og indsamle den flydende fase med en Pasteur pipette. Koncentrere ekstraktet med en faktor på fire under kvælstof flux og overføre det til en GC autosampler hætteglas.
  2. GC-MS kvantificering af flygtige forbindelser
    1. Udstyre gaskromatograf med 30 m x 0,25 mm smeltet silica kapillarkolonne med 0,25 μm filmtykkelse og anvende en konstant helium flow 1,0 mL/min. Hold injektoren og Overflytningslinje ved 250 ° C.
    2. Injicér 2 µL af prøven med split forholdet 10:1 og adskille de udpakkede flygtige molekyler ved hjælp af følgende ovn temperatur profil: holde temperaturen i 3 min. ved 40 ° C, øge det ved 4 ° C/min. op til 220 ° C og derefter holde ovnen ved 220 ° C i 20 min.
    3. Opdage forbindelser ved hjælp af et massespektrometer med sin kilde temperatur ved 230 ° C og dens massespektrometer Quadrupol temperatur på 150 ° C. Optage de massespektre valgt Ion overvågning (SIM) tilstand med positive elektron indvirkning ionisering på 70 eV og ved hjælp af ion klynger specifikke til de flygtige forbindelser, der er rapporteret i tabel 4.
    4. Brug en ekstern 7-punkts kalibrering til at kvantificere koncentrationerne af flygtige molekyler fra summer af intensiteten af den tilsvarende ion klynge. Forberede stamopløsninger af hvert stof (10 g/L) i 100% ethanol. Derefter laves standard løsninger for hver klasse af flygtige molekyler (ethyl estere, acetater, alkoholer og syrer) ved blanding af stamopløsninger. Endelig, fortyndes forskellige mængder af de standard løsninger i en 12% hydroalkoholisk løsning indeholdende 5 g/L vinsyre med pH-værdien justeres til 3.3 at forberede standardopløsningerne.
    5. Parallelt, korrigere for den naturlige mærkning af intensiteterne for hver ion klynge og beregne isotopiske berigelse af flygtige forbindelser, som er defineret som den mærket brøkdel af molekyler og er udtrykt i procent ved hjælp af dedikerede software 17.

6. beregninger for en integreret analyse for datasættet

  1. Samling af de rå data
    1. Ved hjælp af de regneark, der er vist i tabel 5, 6, 7 og 8, Angiv de rå dataværdier, der svarer til koncentrationen af ekstracellulære aminosyrer, celle tørvægt, proteinindholdet af celler, koncentration af flygtige molekyler, og isotopiske berigelse af proteinogeniske aminosyrer og flygtige molekyler.
      Bemærk: Data vises i tabeller udtrykkes i mM. Alle resultater er også udtrykt i mg/L ved at multiplicere værdierne i mM af molekylevægt af hvert molekyle eller i mg N/L ved at multiplicere millimolar koncentrationen af en proteinogeniske aminosyre med atomvægt af kvælstof (14 u) og af antallet af kvælstof ato MS, der er leveret af katabolisme af dette molekyle.
    2. Masse procentdelen af hver aminosyre i proteiner beregnes ved at dividere beløbet i mg/L i hydrolysat af det samlede beløb af aminosyrer (deres sum i mg/L).
    3. Beregne midler, standardafvigelser og standard fejl af middelværdien fra de data, der blev opnået i de uafhængige forsøg.
    4. Beregne proteinogeniske koncentration (mg/L) for hver aminosyre ved at multiplicere procentdelen af denne aminosyre i proteiner (mg aa/g proteiner) af proteinfraktion i biomasse (g protein/g DW) og toerstofindholdet (biomasseproduktion) i den medium (g DW/L).
  2. 15 N isotopiske tracer eksperimenter
    1. Ved hjælp af de regneark, der er præsenteret i tabel 9, beregne de mærkede og umærkede brøkdele af kvælstof, der er til stede i proteinogeniske aminosyrer (udtrykt i mg N/L) fra deres samlede koncentrationer (udtrykt i mg N/L) og deres isotopisk enrichments. For hver aminosyre, de mærket brøkdel svarer til produktet mellem dens samlede koncentration og berigningen isotopiske og den umærkede del er forskellen mellem det samlede beløb og de beløb, der er mærket.
    2. Derefter, bestemme brøkdel af det totale kvælstofindhold i proteiner, der er indeholdt i proteinogeniske aminosyrer kvantificeret i denne undersøgelse ved summering det samlede beløb af Ala, Gly, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, hans, Glu og Arg (i mg N/L) og dividere samlet en Mount af kvælstof indeholdt i proteiner af dette beløb.
    3. Beregne kvælstof leveres af arginin, Glutamin eller ammonium, der blev inddrevet i proteinogeniske syrer kvantificeret i denne undersøgelse ved at addere de mærket brøkdel (i mg N/L) af proteinogeniske aminosyrer, der var kvantificeret i undersøgelsen (Ala, Gly, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, hans, Glu og Arg) under eksperimenter 15N-mærket arginin, glutamin, eller ammonium og dividere denne mærket kvælstof brøkdel af den samlede mængde kvælstof i den kvantitative proteinogeniske aminosyrer syrer.
    4. Vurdere bidraget fra de 3 mest rigelige aminosyrer til den intracellulære pulje af nitrogen bruges til de novo biosyntesen ved at kombinere data fra 13C og 15N isotop tracer eksperimenter (regneark i tabel 7).
    5. Fra det samlede beløb (udtrykt i mM) af proteinogeniske Val, Leu, Ile eller Thr, fradrage den del, der er afledt direkte inkorporering af forbrugt forbindelser (13C eksperimenter) og den del, der var de novo synthetized ved hjælp af kvælstof fra 3 større kilder for at vurdere den fraktion, der var de novo synthetized ved hjælp af kvælstof fra de andre aminosyrer.
    6. Derefter beregne forholdet mellem mængden af aminosyre de novo synthetized ved hjælp af kvælstof fra Localisation, Arg og NH4+ (sum udtrykt i mM) til det samlede beløb af proteinogeniske aminosyrer (i mM) til at kvantificere bidrag arginin, Glutamin og ammonium til intracellulære kvælstof pool.
  3. 13 C isotopiske tracer eksperimenter
    1. Beregne de mærkede og umærkede brøkdele af proteinogeniske aminosyrer fra koncentrationer udtrykt i mM og isotopiske enrichments af proteinogeniske aminosyrer, der blev indhentet under eksperimenter i overværelse af 13C-mærket Leu, Val, Ile eller Thr. (Se 6.2.1, tabel 10).
    2. Beregne de mærkede og umærkede brøkdele af flygtige forbindelser fra koncentrationer udtrykt i mM og isotopiske enrichments af flygtige forbindelser, der blev indhentet under eksperimenter i overværelse af 13C-mærket Leu, Val, Ile eller Thr ( Tabel 10).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 3 præsenterer et skematisk diagram over den arbejdsgang, som blev gennemført for at undersøge ledelse af gær af flere kvælstof kilder, der er fundet under vin gæring.
For forskellige punkter for prøveudtagning, biologiske parametre – vækst egenskaber, kvælstof forbrugsmønstre og profil af proteinogeniske aminosyrer – viser en høj reproducerbarhed blandt fermenteringer (figur 4). Denne sammenhæng validerer relevansen af den tilgang baseret på en kombination af data, der blev genereret under et sæt af 14 uafhængige forgæring.

Figur 5 viser en omfattende oversigt over omfordeling af kvælstof fra de kilder, der er tilgængelige i druesaft til alle proteinogeniske aminosyrer. Denne analyse understøttes primært af de resultater, der blev indhentet fra forsøg udført i overværelse af 15N-mærket forbindelser. Kombineret med bestemmelse af massen og isotopiske saldi, leveret måling af den isotopiske berigelse af proteinogeniske aminosyrer den første kvantificering af kvælstof-stammer arginin, glutamin, ammonium og andre bidrag kilder til amine grupper af hver af disse forbindelser. Den vigtige omfordeling af kvælstof, der er understreget her afspejler den betydelige rolle, de novo syntesen af aminosyrer i opretholde gær vækst.

Desuden, denne undersøgelse, sammenligne beløbene af mærket forbindelser i proteiner med deres forbrug, tillader brøkdel af forbrugt N-holdige molekyler, der er direkte indarbejdet i proteiner, når de indtaster celler skal vurderes. Proteinogene aminosyrer er differentieret efter deres grad af direkte iblanding i biomasse; nogle af dem er udelukkende (Asp, Glu) eller mere end 80% de novo synthetized, mens kun små mængder af andre forbindelser, der genereres af de novo syntesen. Interessant, omfatter denne sidste gruppe Lysin og histidin, som er de eneste aminosyrer, hvor alle de forbrugte kilder er direkte indarbejdet.

Figur 5B også præsenterer, for nogle aminosyrer, en sammenligning mellem mængden af forbrugt aminosyre, der er direkte inddrives i biomasse, beregnet ud fra data opnået i 15N-mærkning eksperimenter og måles eksperimentelt i 13 C-mærkning eksperimenter. De små forskelle mellem disse værdier viser pålidelighed og robusthed af den fremgangsmåde, der blev implementeret i denne undersøgelse.

Figur 6 viser et eksempel på kvantitativ opdeling (nøgletal) af strømme gennem metaboliske reaktionsveje, der blev opnået ved at gennemføre arbejdsprocessen rapporteret i dette papir. Dette kort blev udarbejdet ved at kombinere oplysninger fra isotopiske tracer eksperimenter ved hjælp af 15N- og 13C-mærket substrater og beskriver partitionering af de forbrugte alifatiske aminosyrer i den metaboliske netværk, der er involveret i valin og leucin biosyntese i gær (for beregninger, der henvises til tabel 1 og tabel 2). Ved måling af produktion og isotopiske berigelse af både proteinogeniske aminosyrer og flygtige forbindelser, vurderes vi mængden af disse forbindelser, der var synthetized fra kulstof rygbenet forbrugt U-C13- valin og U-C13- leucin, som svarer til den mærket brøkdel af forbindelser. Vi har efterfølgende kunnet bestemme CCM bidrag til deres dannelse (den umærkede brøkdel af forbindelser). Carbon masse saldi oprettet ved hjælp af arbejdsprocessen og beregningsmetoden, der er foreslået her viser, at mere end 96% af den forbrugte valin og leucin inddrives i deres konvertering produkter, nemlig, proteinogeniske leucin og valin og flygtige højere alkoholer. Dette resultat bekræfter egnetheden af de rapporterede tilgang til kvantitative undersøgelser af metabolisme. En integreret og omfattende analyse af datasættet tilbyder nye indsigter i skæbnen af forbrugt aminosyrer. Overraskende, en betydelig brøkdel af valin og leucin er kataboliseres trods en betydelig ubalance mellem tilgængeligheden af disse forbindelser i mediet og deres indhold i biomasse. Brøkdel af eksogene N-forbindelser direkte indarbejdet i proteiner afhænger imidlertid af arten af aminosyren. Et andet centralt punkt vedrører proteinogeniske aminosyrer og flygtige molekyler metaboliske oprindelse. En analyse af 13C-mærkning mønster af proteinogeniske leucin og valin afslører, at kulstof skelettet af disse aminosyrer hovedsageligt kommer fra prækursorer, der var synthetized gennem CCM. I overensstemmelse med denne observation viser lav indarbejdelse af mærkning i isobutanol og isoamyl alkohol meget begrænsede inddragelse af katabolisme af valin og leucin, der er forbrugt af gær i dannelsen af disse højere alkoholer.

Figure 1
Figur 1. Automatiseret robot system til overvågning af høj overførselshastighed fermenteringer. (A) robot platform. Gæringsanlæg (en) er placeret i støtte guider på magnetisk omrøring plader (b). En sikkerhed lysgardin (c) beskytter brugerne. En robot arm (d) flytter gæringsanlæg successivt fra deres placering på en af de 6 omrøring plader til en præcision balance (e) i venstre side af arbejdsbord, til at måle vægten hver 4 timer. Den robot platform er placeret i en temperatur-kontrolleret rum. (B) skematisk fremstilling af softwarearkitektur. En grafisk brugerflade gør det muligt for brugere at definere indstillingerne for eksperimenterende. Disse oplysninger overføres til programmet kontrol, der kontrollerer robotarmen og registrerer de forskellige vægt i forskellige rå data.xlm filer (1 fil/gæring). Software til beregning af derefter indsamler xlm-filer og beregnes for hvert tidspunkt, mængden CO2 der frigives (udtrykt i g/L), som er proportional med mængden af sukker, der har forbrugt på dette tidspunkt, og gæring sats, der svarer til satsen af CO2 produktion, i g CO2/L/h (proportional sats af sukkerforbrug). Data er gemt i en relationsdatabase og visualiseres ved hjælp af en hengiven grafisk brugerflade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. GC-MS analyse af proteinogeniske aminosyrer: eksempel på alanin. (A) kromatogrammet fremstillet efter forædling af proteinogeniske aminosyrer ved hjælp af DMFDMA. (B) masse spektre af derivatized alanin. To vigtigste toppe, der svarer til fragmenter med m0/z = 99 og m0/z = 158. (C) forædling reaktion af alanin med DMFDMA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Arbejdsgang for den kvantitative analyse af metabolismen af flere kvælstof kilder af gær. Denne proces omfatter (i) et sæt af 28 fermenteringer (7 kvælstof kilder og forgæring med eller uden kvaelstofforbindelser i to eksemplarer); (ii) en analytisk del, der indebærer forskellige procedurer for udvinding og forædling af molekyler og HPLC eller GM-MS analyser og (iii) behandling af raw-data og en integreret analyse af DataSet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Reproducerbarhed af biologiske parametre fra en række uafhængige fermenteringer. (A-B) Betyde værdier og standardafvigelser tørvægt og proteinindhold, der blev indhentet fra de 14 uafhængige fermenteringer udført ved hjælp af umærket forbindelser. (C-D) Middelværdier og standardafvigelser proteinogeniske og forbrugt aminosyrer, der blev målt under 14 uafhængige fermenteringer udføres ved hjælp af umærket forbindelser. CO2 produktion: 5 (grøn), 10 (blå), 40 (pink) og 90 (lilla) g/L. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Omfordeling af kvælstof fra de tre store kvælstof kilder til proteinogeniske aminosyrer under gæringen. (A) metaboliske oprindelsen af proteinogeniske aminosyrer: direkte iblanding af forbrugt modstykke (blå) og de novo syntese ved hjælp af nitrogen, som forbruges arginin (orange), Glutamin (grøn), ammoniumsulfat (pink) eller andre aminosyrer ( lilla). Udtrykt som en procentdel af det samlede beløb for hver proteinogeniske aminosyre. (B) sammenligning mellem mængden af forbrugt aminosyre (blå) og del af den forbrugte aminosyre, der er direkte inddrevet i proteiner, beregnet ud fra de data, der blev fremstillet i 15N tracer eksperimenter (lilla) eller eksperimentelt målt under gæringen med 13C-mærket molekyler (pink). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Kvantitativ analyse af valin og leucin stofskifte. Partitionering af forbrugt leucin (grøn) og valin (blå) gennem metaboliske netværket når 40 g/L CO2 er produceret. Barer er proportional med mængden af hvert stof og udtrykkes i µM, herunder den fraktion, der var synthetized fra central carbon stofskifte (orange). Værdier i den almindelige skrifttype: beløb i µM; værdier i den kursiv skrifttype: procentdel af forbrugt valin (blå) eller leucin (grøn) der var kataboliseres gennem vej. Beregningerne er fastsat i tabel 1 og tabel 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Forbindelser Beløb pr. liter
Glukose C6H12O6 240 g
Æblesyre C4H6O5 6 g
Citronsyre C6H8O7 6 g
Kalium fosfat KH2PO4 0,75 g
Kalium sulfat K2SO4 0,5 g
Magnesium-sulfat MgSO4, 7 H2O 0,25 g
Calcium chloride CaCl2, 2 H2O 0,155 g
Natriumchlorid NaCl 0,2 g
MYO-inositol 20 mg
Kalciumpantothenat 1,5 mg
Thiamin-hydrochlorid 0.223 mg
Nikotinsyre 2 mg
Pyridoxin 0,25 mg
Biotin 0,003
MnSO4· H2O 4 mg
ZnSO4·7H2O 4 mg
CuSO4·5H2O 1 mg
CoCl2·6H2O 0,4 mg
H3BO3 1 mg
(NH4) 6 Mo7O24 1 mg
Ergosterol 3,75 mg
Oliesyre 1,25 ΜL
Tween 80 125 ΜL
Tyrosin 8.6 mg
Tryptofan 84.4 mg
Isoleucin 15,4 mg
Aspartat 20,9 mg
Glutamat 56.7 mg
Arginin 176.2 mg
Leucin 22,8 mg
Threonin 35.7 mg
Glycin 8.6 mg
Glutamin 237.8 mg
Alanin 68.4 mg
Valin 20,9 mg
Methionin 14.8 mg
Phenylalanin 17,9 mg
Serin 37.0 mg
Histidin 15,4 mg
Lysin 8,0 mg
Cystein 6.2 mg
Prolin 288.3 mg
Ammoniak chlorid NH4Cl 220 mg
PH af mediet blev justeret til 3.3 med NaOH 10 M.

Tabel 1. Sammensætning af syntetiske metode der anvendes i denne undersøgelse. Denne kemisk definerede medium efterligner sammensætningen af druesaft.

Eluering buffer Temperatur
Fra 0 til 6 min Lithium citrat, 200 mM, pH 2.8 32 ° C
Fra 6 til 38 min Lithium citrat, 300 mM, pH 3 32 ° C
Fra 38 til 57 min Lithium citrat, 500 mM, pH 3,15 64,5 ° C
Fra 57 til 83 min Lithium citrat, 900 mM, pH 3,5 75 ° C
Fra 83 til 120 min Lithium citrat, 1650 mM, pH 3,55 75 ° C
Fra 120 til 130 min Lithium hydroxyde, 300 mM

Tabel 2. Betingelser for udskillelse af aminosyrer ved ionbytning kromatografi. Eluering buffere med øget salt koncentrationerne anvendes successivt i kombination med en temperaturgradient aktivere adskillelse af aminosyrer.

Aminosyrer Afledende reagenser RT (min) Ion klynger (m/z)
Alanin ECFen 3,86 116, 117, 118, 119
DMFDMAb 6,37 99, 100, 101, 102
DMFDMAb 6,37 158, 159, 160, 161
Glycin ECFen 4.19 102, 103, 104
ECFen 4.19 175, 176, 177
DMFDMAb 6,61 85, 86, 87
DMFDMAb 6,61 144, 145, 146
Valin ECFen 4,97 144, 145, 146, 147, 148, 149
DMFDMAb 7.37 127, 128, 129, 130, 131, 132
DMFDMAb 7.37 143, 144, 145, 146, 147, 148
DMFDMAb 7.37 186, 187, 188, 189, 190, 191
Leucin ECFen 5.67 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164
Isoleucin ECFen 5,85 158, 159, 160, 161, 162, 163, 165
Threonin ECFen 6.48 146, 147, 148, 149, 150
ECFen 6.48 175, 176, 177, 178, 179
Serin ECFen 6,53 132, 133, 134, 135
ECFen 6,53 175, 176, 177, 178
Prolin ECFen 6.83 142, 143, 144, 145, 146, 147
Aspartat ECFen 7.89 188, 189, 190, 191, 192
DMFDMAb 11,77 115, 116, 117, 118, 119
DMFDMAb 11,77 216, 217, 218, 219, 220
Glutamat ECFen 8.81 202, 203, 204, 205, 206, 207
DMFDMAb 12,75 111, 112, 113, 114, 115, 116
DMFDMAb 12,75 143, 144, 145, 146, 147, 148
DMFDMAb 12,75 230, 231, 232, 233, 234, 235
Phenylalanin ECFen 9.53 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201
DMFDMAb 13.67 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152
Lysin ECFen 11.95 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162
Histidin ECFen 12,54 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333
Arginin BSTFAc 18,8 174, 175, 176, 177, 178, 179
en ECF, ethyl chloroformate; b DMFDMA, (N, N)-dimethylformamid dibutylphthalat acetal; c BSTFA, (N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide).

Tabel 3. Analytiske parametre, der anvendes til bestemmelse af isotopiske enrichments af aminosyrer ved hjælp af udvalgte ion overvågning (SIM) tilstand. Denne tabel opsummerer de kemiske agenser, der anvendes til forædling, retentionstiden for derivatized forbindelser og klynge af ioner fremstillet i MS (mode elektron virkninger) for hver aminosyre.

Aminosyrer Afledende reagenser RT (min) Ion klynger (m/z)
Alanin ECFen 3,86 116, 117, 118, 119
DMFDMAb 6,37 99, 100, 101, 102
DMFDMAb 6,37 158, 159, 160, 161
Glycin ECFen 4.19 102, 103, 104
ECFen 4.19 175, 176, 177
DMFDMAb 6,61 85, 86, 87
DMFDMAb 6,61 144, 145, 146
Valin ECFen 4,97 144, 145, 146, 147, 148, 149
DMFDMAb 7.37 127, 128, 129, 130, 131, 132
DMFDMAb 7.37 143, 144, 145, 146, 147, 148
DMFDMAb 7.37 186, 187, 188, 189, 190, 191
Leucin ECFen 5.67 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164
Isoleucin ECFen 5,85 158, 159, 160, 161, 162, 163, 165
Threonin ECFen 6.48 146, 147, 148, 149, 150
ECFen 6.48 175, 176, 177, 178, 179
Serin ECFen 6,53 132, 133, 134, 135
ECFen 6,53 175, 176, 177, 178
Prolin ECFen 6.83 142, 143, 144, 145, 146, 147
Aspartat ECFen 7.89 188, 189, 190, 191, 192
DMFDMAb 11,77 115, 116, 117, 118, 119
DMFDMAb 11,77 216, 217, 218, 219, 220
Glutamat ECFen 8.81 202, 203, 204, 205, 206, 207
DMFDMAb 12,75 111, 112, 113, 114, 115, 116
DMFDMAb 12,75 143, 144, 145, 146, 147, 148
DMFDMAb 12,75 230, 231, 232, 233, 234, 235
Phenylalanin ECFen 9.53 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201
DMFDMAb 13.67 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152
Lysin ECFen 11.95 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162
Histidin ECFen 12,54 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333
Arginin BSTFAc 18,8 174, 175, 176, 177, 178, 179

Tabel 4. Analytiske parametre, der anvendes til bestemmelse af isotopiske enrichments og kvantificering af flygtige forbindelser ved hjælp af udvalgte ion overvågning (SIM) tilstand. Denne tabel opsummerer for retentionstid og klyngen af ioner fremstillet i MS (mode elektron indvirkning) for hver flygtige forbindelser.

Tabel 5. Forarbejdning af rå data fra kvantificering af resterende aminosyrer datasæt indeholder data fra målinger af oprindelige og resterende aminosyrer. Disse værdier bruges til at beregne mængden af forbrugt aminosyre (ved subtraktion). Betyder, og standardafvigelser er beregnet for yderligere beregninger. Venligst klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 6. Forarbejdning af rå data fra kvantificering af proteinogeniske aminosyrer. Dette datasæt indeholder data om sammensætning i aminosyrer biomasse hydrolysater (A) og fraktion af proteiner i biomasse (B). Disse værdier bruges til at vurdere den masse procentdel af hver aminosyre i proteiner (C). Betyder, og standardafvigelser er beregnet for yderligere beregninger. Venligst klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 7. Proteinogene aminosyrer. Dette regneark bruges til at beregne koncentrationen (i mM) af proteinogeniske aminosyrer fra data opsummeres i tabel 5 og tabel 6. Betyder, og standardafvigelser er beregnet for yderligere beregninger. Venligst klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 8. Forarbejdning af rå data fra kvantificering af højere alkoholer. Datasæt indeholder data fra målinger af flygtige sammensatte koncentrationer (A) og omdanner data udtrykt i mg/L til µM (B). Betyder, og standardafvigelser er beregnet for yderligere beregninger. Venligst klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 9. Forarbejdning af rå data fra bestemmelse af isotopiske enrichments af proteinogeniske aminosyrer ved hjælp af 15N-mærket substrater.
Betyder, og standardafvigelser er beregnet for yderligere beregninger. Venligst klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 10. Forarbejdning af rå data fra bestemmelse af isotopiske enrichments proteinogeniske aminosyrer og flygtige forbindelser ved hjælp af 13C-mærket substrater.
Betyder, og standardafvigelser er beregnet for yderligere beregninger. Venligst klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kvantificering af partitionering af forbindelser gennem metaboliske netværk ved hjælp af isotopiske tracer eksperimenter er en lovende tilgang for at forstå driften af mikrobiel metabolisme. Denne metode, kan ikke mens anvendt med succes med én eller to mærket underlag, i øjeblikket være gennemført for at undersøge metaboliseringen af forskellige kilder ved hjælp af flere mærket elementært isotoper (dvs., mere end to substrater). Faktisk, de tilgængelige analytiske teknikker aktiverer den nøjagtige bestemmelse af de mærkning mønstre af proteinogeniske aminosyrer og molekyler udelukkende ved brug af isotoper af et enkelt element og eventuelt når Co mærkning med to elementer. Derfor, for at løse disse begrænsninger og vurdere forvaltning af flere næringsstoffer kilder af mikroorganismer, valgte vi at gentage en række kulturer under samme miljøforhold mens mærkning valgte substrat med 13C eller 15 N isotoper. Derefter, yderligere kombination af de specifikke oplysninger, der er leveret af hver 13C eller 15N tracer eksperiment tilbyder en kvantitativ udvidet visning af metabolismen af flere kilder.

Opnåelsen af de rapporterede tilgang bygger på gennemførelsen af en reproducerbar række kulturer under standardbetingelser og om indsamling af prøver fra en population af celler i en defineret fysiologiske tilstand, der er den samme for alle kulturer (celle vækst, forbrug af substrat, osv.). Disse betingelser skal være opfyldt, således at data indhentet fra uafhængige eksperimenter kan blandes og analyseret sammen. Opfylder disse begrænsninger kræver præcis og hyppig overvågning af den mikrobielle aktivitet, der blev gennemført, i det eksperimentelle arbejde rapporteret her, ved hjælp af en robot-assisteret system til online overvågning af gær gæring aktivitet. Dog kan mere konventionelle metoder mikroorganisme dyrknings-og overvågning, såsom bestemmelse af cellevækst ved at måle den optiske tæthed, bruges til at normalisere prøveudtagningsproceduren.

En anden forudsætning for at gennemføre denne metode er at have en klar vision om de metabolske processer, der er involveret i netværket til at blive undersøgt. Denne viden er afgørende for at vælge sæt af mærket substrater, der er den mest hensigtsmæssige til at behandle spørgsmålet undersøges. De mærkede forbindelser samt art og placering af mærkning (13C, 15N eller andre) inden for molekylerne der skal vælges passende i orden at jeg) inddrive alle etiketterne leveres af substrater i de forbindelser, der er afledt fra deres katabolisme og er yderligere analyseres i proceduren og ii) opnå redundante data, der viser nøjagtigheden af metoden, og gyldigheden af resultaterne. Proceduren beskrevet her omfatter også et betydeligt antal analyser, som kan være tidskrævende og dyrt i menneskelige og finansielle ressourcer. Desuden, nogle analytiske begrænsninger kan begrænse anvendelsen af denne metode. Først skal bør brugere sikre, at alle de analysemetoder, der er nødvendige for kvantificering af forbindelser, der produceres i løbet af mikrobiel metabolisme og til bestemmelse af deres isotopiske berigelse er tilgængelige. For det andet gælder denne fremgangsmåde kun for vurdering af metabolismen af substrater for hvilke alle konvertering forbindelser er produceret i tilstrækkelige mængder til kvantificeres præcist.

I dette papir anvendte vi denne arbejdsproces for at udforske forvaltningen af flere kvælstof kilder ved gær under vin gæring. Denne betænkning tilbudt nye indsigter på gær stofskifte, herunder de betydelige katabolisme mest forbruges aminosyrer, kombineret med deres lave direkte iblanding i proteiner, og den store bidrag af CCM til at levere prækursorer, der anvendes yderligere til både de novo -syntesen af proteinogeniske aminosyrer og dannelsen af flygtige molekyler.

Mere generelt, den fremgangsmåde, der er beskrevet her kan bruges til kvantificering af partitionering af flere substrater gennem den metaboliske netværk af enhver mikroorganisme. Det vil gøre det muligt for forskere at belyse skæbnen for alle forbrugte forbindelser efter de træder cellerne og adresse identifikation af metaboliske oprindelsen af prækursorer og produkter. Disse oplysninger kan være nyttige til at sammenligne den metaboliske aktivitet af stammer, der har forskellige genetiske baggrunde eller vokse under forskellige forhold og dermed til at designe rationel strategier til at forbedre gæring processer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takke Jean Roch Mouret, Sylvie Dequin og Jean-Marie Sabalyrolles for at bidrage til udformningen af ordningen for robot-assisteret gæring og Martine Pradal, Nicolas Bouvier og Pascale Brial for deres tekniske support. Finansieringen af dette projekt blev leveret af Ministère de l'Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
D-Glucose PanReac 141341.0416
D-Fructose PanReac 142728.0416
DL-Malic acid Sigma Aldrich M0875
Citric acid monohydrate Sigma Aldrich C7129
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P5379
Potassium sulfate Sigma Aldrich P0772
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma Aldrich 230391
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C7902
Sodium chloride Sigma Aldrich S9625
Ammonium chloride Sigma Aldrich A4514
Sodium hydroxide Sigma Aldrich 71690
Manganese sulfate monohydrate Sigma Aldrich M7634
Zinc sulfate heptahydrate Sigma Aldrich Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate Sigma Aldrich C7631
Potassium iodine Sigma Aldrich P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate Sigma Aldrich C3169
Boric acid Sigma Aldrich B7660
Ammonium heptamolybdate Sigma Aldrich A7302
Myo-inositol Sigma Aldrich I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma Aldrich 21210
Thiamine, hydrochloride Sigma Aldrich T4625
Nicotinic acid Sigma Aldrich N4126
Pyridoxine Sigma Aldrich P5669
Biotine Sigma Aldrich B4501
Ergostérol Sigma Aldrich E6510
Tween 80 Sigma Aldrich P1754
Ethanol absolute VWR Chemicals 101074F
Iron (III) chloride hexahydrate Sigma Aldrich 236489
L-Aspartic acid Sigma Aldrich A9256
L-Glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L-Alanine Sigma Aldrich A7627
L-Arginine Sigma Aldrich A5006
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
L-Glutamine Sigma Aldrich G3126
Glycine Sigma Aldrich G7126
L-Histidine Sigma Aldrich H8000
L-Isoleucine Sigma Aldrich I2752
L-Leucine Sigma Aldrich L8000
L-Lysine Sigma Aldrich L5501
L-Methionine Sigma Aldrich M9625
L-Phenylalanine Sigma Aldrich P2126
L-Proline Sigma Aldrich P0380
L-Serine Sigma Aldrich S4500
L-Threonine Sigma Aldrich T8625
L-Tryptophane Sigma Aldrich T0254
L-Tyrosine Sigma Aldrich T3754
L-Valine Sigma Aldrich V0500
13C5-L-Valine Eurisotop CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine Eurisotop CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride Eurisotop NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine Eurisotop NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine Eurisotop NLM-396-PK
Ethyl acetate Sigma Aldrich 270989
Ethyl propanoate Sigma Aldrich 112305
Ethyl 2-methylpropanoate Sigma Aldrich 246085
Ethyl butanoate Sigma Aldrich E15701
Ethyl 2-methylbutanoate Sigma Aldrich 306886
Ethyl 3-methylbutanoate Sigma Aldrich 8.08541.0250
Ethyl hexanoate Sigma Aldrich 148962
Ethyl octanoate Sigma Aldrich W244910
Ethyl decanoate Sigma Aldrich W243205
Ethyl dodecanoate Sigma Aldrich W244112
Ethyl lactate Sigma Aldrich W244015
Diethyl succinate Sigma Aldrich W237701
2-methylpropyl acetate Sigma Aldrich W217514
2-methylbutyl acetate Sigma Aldrich W364401
3-methyl butyl acetate Sigma Aldrich 287725
2-phenylethyl acetate Sigma Aldrich 290580
2-methylpropanol Sigma Aldrich 294829
2-methylbutanol Sigma Aldrich 133051
3-methylbutanol Sigma Aldrich 309435
Hexanol Sigma Aldrich 128570
2-phenylethanol Sigma Aldrich 77861
Propanoic acid Sigma Aldrich 94425
Butanoic acid Sigma Aldrich 19215
2-methylpropanoic acid Sigma Aldrich 58360
2-methylbutanoic acid Sigma Aldrich 193070
3-methylbutanoic acid Sigma Aldrich W310212
Hexanoic acid Sigma Aldrich 153745
Octanoic acid Sigma Aldrich W279900
Decanoic acid Sigma Aldrich W236403
Dodecanoic acid Sigma Aldrich L556
Fermentor 1L Legallais AT1357 Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system Dominique Deutscher 029311
Fermenters (250 ml) Legallais AT1352 Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes Sarstedt 62.554.502
Fermentation locks Legallais AT1356 Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract Becton, Dickinson and Company 212750
BactoPeptone Becton, Dickinson and Company 211677
Incubator shaker Infors HT
Particle Counter Beckman Coulter 6605697 Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge Jouan GR412
Plate Butler Robotic system Lab Services BV PF0X-MA Automatic instrument
Plate Butler Software Lab Services BV Robot monitor software
RobView In-house developed calculation software
My SQL International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers Thermo Fisher Scientific 50088009 String Drive 60
BenchBlotter platform rocker Dutscher 60903
Ammonia enzymatic kit R-Biopharm AG 5390
Spectrophotometer cuvettes VWR 634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400 Secomam
Amino acids standards physiological - acidics and neutrals Sigma Aldrich A6407
Amino acids standards physiological - basics Sigma Aldrich A6282
Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent Biochrom BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid Sigma Aldrich S2130
Norleucine Sigma Aldrich N1398
Biochrom 30 AAA Biochrom
EZChrom Elite Biochrom Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium Biochrom BC80-6002-47 Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV Merck Millipore SLGVX13NL Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL VWR 514-4157 Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini Millipore XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm VWR 611-1380
Precision balance Mettler Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried Merck 1029310161 (max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven Legallais
Pierce BCA protein assay kit Interchim UP40840A
Formic acid Fluka 94318
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure Merck 1003171000 Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer Biochrom 80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids Sigma Aldrich AAS18
L-Methionine sulfone Sigma Aldrich M0876
L-Cysteic acid monohydrate Sigma Aldrich 30170
Pyrex glass culture tubes Sigma Aldrich Z653586
Pyridine Acros Organics 131780500 99% Extrapure
Ethyl chloroformate Sigma Aldrich 23131
Dichloromethane Sigma Aldrich 32222
Vials Sigma Aldrich 854165
Microinserts for 1.5ml vials Sigma Aldrich SU860066
GC/MS Agilent Technologies 5890 GC/5973 MS
Chemstation Agilent Technologies Instrument control and data analysis software
Methanol Sigma Aldrich 34860 Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998 ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal Sigma Aldrich 394963
BSTFA Sigma Aldrich 33024
DB-17MS column Agilent Technologies 122-4731 30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous Sigma Aldrich 238597
Technical nitrogen Air products 14629
Zebron ZB-WAX column Phenomenex 7HG-G007-11 30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP Air products 26699
Glass Pasteur pipettes VWR 612-1702

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts. Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).
  2. Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression. J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).
  3. Wiechert, W. 13C metabolic flux analysis. Metab Eng. 3, 195-206 (2001).
  4. Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints. Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).
  5. Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments. BMC Bioinformatics. 9, 266 (2008).
  6. Zamboni, N. 13C metabolic flux analysis in complex systems. Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).
  7. Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis. Biochimie. 91, 697-702 (2009).
  8. Quek, L. -E., Dietmair, S., Krömer, J. O., Nielsen, L. K. Metabolic flux analysis in mammalian cell culture. Metab Eng. 12, 161-171 (2010).
  9. Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value. J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).
  10. Magasanik, B., Kaiser, C. A. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 290, 1-18 (2002).
  11. Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190, 885-929 (2012).
  12. Cooper, T. G. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 39-99 (1982).
  13. Jones, E. W., Fink, G. R. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 182-299 (1982).
  14. Hazelwood, L. A., Daran, J. -M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism. Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).
  15. Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions. J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).
  16. Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network. Genome Res. 13, 244-253 (2003).
  17. Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments. Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).
Arbejdsproces baseret på en kombination af isotopiske Tracer eksperimenter til at undersøge mikrobiel metabolisme af flere næringsstoffer kilder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bloem, A., Rollero, S., Seguinot, P., Crépin, L., Perez, M., Picou, C., Camarasa, C. Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources. J. Vis. Exp. (131), e56393, doi:10.3791/56393 (2018).More

Bloem, A., Rollero, S., Seguinot, P., Crépin, L., Perez, M., Picou, C., Camarasa, C. Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources. J. Vis. Exp. (131), e56393, doi:10.3791/56393 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter