Summary

Flux de travail basé sur la combinaison de traceur isotopique des expériences pour étudier le métabolisme microbien de multiples Sources d’éléments nutritifs

Published: January 22, 2018
doi:

Summary

Ce protocole décrit une procédure expérimentale pour quantitativement et complètement étudier le métabolisme de plusieurs sources d’éléments nutritifs. Ce flux de travail, basé sur une combinaison d’expériences de traceur isotopique et une méthode d’analyse, permet le sort des nutriments consommés et l’origine métabolique des molécules synthétisée par des microorganismes à déterminer.

Abstract

Études dans le domaine de la microbiologie s’appuient sur la mise en œuvre d’un large éventail de méthodes. En particulier, le développement de méthodes appropriées contribue substantiellement à fournir une connaissance approfondie du métabolisme des microorganismes qui poussent dans des milieux chimiquement définis contenant l’azote unique et sources de carbone. En revanche, la gestion par le métabolisme de plusieurs sources d’éléments nutritifs, malgré leur large présence dans des environnements naturels ou industriels, demeure pratiquement inexplorée. Cette situation est principalement due au manque de méthodologies appropriées, qui entrave les enquêtes.

Nous rapportons une stratégie expérimentale quantitativement et complètement explorer comment le métabolisme fonctionne lorsqu’un nutriment est fourni comme un mélange de molécules différentes, par exemple, une ressource complexe. Nous décrivons ici son application pour l’évaluation de la répartition des multiples sources d’azote à travers le réseau métabolique de la levure. Le flux de travail combine l’information obtenue au cours d’expériences de traceur isotopique à l’aide de sélectionné 13C – ou des substrats marqués au N 15. Tout d’abord, il se compose des fermentations parallèles et reproductibles dans le même milieu, qui comprend un mélange de molécules contenant du N ; Toutefois, une source d’azote sélectionné est étiquetée chaque fois. Une combinaison des méthodes analytiques (HPLC, GC-MS) est mis en place pour évaluer les modèles étiquetage des composés ciblés et de quantifier la consommation et la récupération des substrats dans les autres métabolites. Une analyse intégrée de l’ensemble de données complet donne un aperçu du sort des substrats consommés dans les cellules. Cette approche nécessite un protocole précis pour la collecte d’échantillons – facilité par un système assistée par robot de surveillance en ligne des fermentations – et la réalisation de nombreuses analyses fastidieuses. Malgré ces contraintes, elle a permis de comprendre, pour la première fois, la séparation des multiples sources d’azote dans tout le réseau métabolique de la levure. Nous avons élucidé la redistribution d’azote provenant de sources plus abondantes vers autres composés N et déterminé l’origine métabolique des molécules volatiles et acide aminé.

Introduction

Comprendre comment opère de métabolisme microbien est une question clé pour la conception de stratégies efficaces pour améliorer les procédés de fermentation et de moduler la production de composés par fermentation. Progrès de la génomique et de la génomique fonctionnelle dans ces deux dernières décennies a largement contribué à étendre la connaissance de la topologie des réseaux métaboliques de nombreux micro-organismes. Accès à ces informations a conduit à l’élaboration d’approches qui visent pour un aperçu complet de la fonction cellulaire1. Ces méthodes reposent souvent sur une interprétation basée sur des modèles de paramètres mesurables. Ces données expérimentales comprennent, d’une part, le taux d’absorption et de la production métabolite et, d’autre part, des renseignements quantitatifs intracellulaires qui sont obtenus à partir de traceur isotopique expériences. Ces données fournissent des renseignements essentiels pour la déduction de l’activité in vivo des voies différentes dans un réseau métabolique défini2,3,4. Actuellement, les techniques analytiques disponibles uniquement permettent la détection précise de l’étiquetage des modèles de molécules lors de l’utilisation d’un isotope de l’élément unique et, éventuellement, lors de l’étiquetage conjointement avec deux éléments isotopiques. En outre, dans la plupart des conditions de croissance, la source de carbone se compose uniquement d’un ou de deux composés. Par conséquent, les approches fondées sur les traceurs isotopiques-C 13de substrats carbonés ont été largement et avec succès appliquées pour développer une compréhension complète du carbone réseau métabolique opérations5,6,7 ,,8.

En revanche, dans de nombreux environnements naturels et industriels, la ressource d’azote disponible qui prend en charge la croissance microbienne est souvent composée d’une large gamme de molécules. Par exemple, au cours de la fermentation de la bière ou vin, azote est fournie comme un mélange de 18 acides aminés et d’ammonium à concentrations variables9. Cet éventail de composés azotés qui sont accessibles pour l’anabolisme rend ces conditions de milieux complexes considérablement différentes de celles utilisées pour les études physiologiques, comme ces derniers sont réalisés à l’aide d’une unique source d’azote, généralement d’ammonium.

Dans l’ensemble, intériorisé azote composés peuvent être directement incorporés dans les protéines ou catabolisés. La structure du réseau du métabolisme de l’azote dans beaucoup de micro-organismes, y compris la levure Saccharomyces cerevisiae, est très complexe selon la diversité des substrats. Schématiquement, ce système repose sur la combinaison du noyau central du métabolisme de l’azote qui catalyse l’interconversion de glutamine, glutamate et10,α-cétoglutarate11, avec les transaminases et DÉSAMINASES. Grâce à ce réseau, groupes amines d’ammonium ou d’autres acides aminés sont regroupés et acides α-cétoniques libérés. Ces intermédiaires sont également synthétisée par le carbone central du métabolisme (CCM)12,13. Ce grand nombre de réactions ramifiées et intermédiaires, intervenant dans le catabolisme des sources d’azote exogène et l’anabolisme de l’acide aminé, remplit les exigences anaboliques des cellules. L’activité à travers ces différentes routes interconnectées se traduit également par l’excrétion des métabolites. En particulier, les acides α-cétoniques sont redirigés par la voie d’Ehrlich pour produire des alcools supérieurs et leur acétate ester dérivés14, qui contribuent de façon essentielle aux profils sensoriels des produits. Par la suite, le fonctionne du métabolisme de l’azote joue un rôle clé dans la production de biomasse et de la formation de molécules volatiles (arôme).

Les réactions, les enzymes et les gènes impliqués dans le métabolisme de l’azote sont largement décrits dans la littérature. Toutefois, la question de la répartition des multiples sources d’azote dans l’ensemble un réseau métabolique n’a pas encore été abordée. Il y a deux raisons principales qui expliquent ce manque d’information. Tout d’abord, compte tenu de la complexité importante du réseau du métabolisme d’azote, une grande quantité de données quantitatives est nécessaire pour une compréhension complète de son fonctionnement qui n’était pas disponible jusqu’ici. Deuxième, nombreuses contraintes expérimentales et les limitations des méthodes d’analyse ont empêché la mise en œuvre des approches qui ont déjà été utilisées pour l’élucidation de la fonction CCM.

Pour résoudre ces problèmes, nous avons choisi de développer une approche au niveau du système qui repose sur le rapprochement des données d’une série d’expériences de traceur isotopique. Le workflow comporte :
-Un ensemble de fermentations effectué dans les mêmes conditions environnementales, alors qu’une autre source de nutriments sélectionnée (substrat) est étiquetée chaque fois.
-Une combinaison des méthodes analytiques (HPLC, GC-MS) pour une détermination précise, à différentes étapes de la fermentation, de la concentration résiduelle de substrat marqué et la concentration et l’enrichissement isotopique de composés dérivés de le catabolisme de la molécule marquée, y compris les dérivés de la biomasse.
-Un calcul du solde pour chaque masse et isotopique consommé molécule marquée et une analyse intégrée de l’objet dataset afin d’obtenir une vision globale de la gestion de multiples sources d’éléments nutritifs par les microorganismes grâce à la détermination des ratios de flux .

Pour appliquer cette méthode, il faut au comportement reproductible du micro-organisme/souche entre les cultures. En outre, les échantillons provenant de cultures différentes doivent être prises pendant le déroulement de la fermentation bien définis même. Dans les travaux expérimentaux rapporté dans ce manuscrit, un système assistée par robot est utilisé pour le suivi en ligne des fermentations pour tenir compte de ces contraintes.

En outre, il est essentiel de choisir une série de substrats marqués (composé, nature et position de l’étiquette) qui est appropriée régler le problème scientifique de l’étude. Ici, arginine, glutamine et 15N-étiqueté d’ammonium ont été sélectionnés comme les trois sources principales d’azote trouvés dans du jus de raisin. Cela a permis d’évaluer le modèle de redistribution d’azote de composés consommés à l’acide aminé. L’étude visait aussi à enquêter sur le sort de l’épine dorsale de carbone des acides aminés consommés et leur contribution à la production de molécules volatiles. Pour atteindre cet objectif, uniformément 13C marqué leucine, isoleucine, thréonine et valine ont été inclus dans l’étude comme les acides aminés dérivés de grands intermédiaires de la voie de Ehrlich.

Dans l’ensemble, nous avons étudié quantitativement comment levure gère une ressource complexe d’azote en redistribuant les sources d’azote exogène pour satisfaire ses exigences anabolisants pendant toute la fermentation tout en éliminant en outre l’excès de précurseurs de carbone comme molécules volatiles. La procédure expérimentale présentée dans cet article peut être appliquée afin d’étudier les autres sources d’éléments nutritifs multiples utilisés par tout autre micro-organisme. Il semble être une approche appropriée pour l’analyse de l’impact du bagage génétique ou des conditions environnementales sur le comportement métabolique des micro-organismes.

Protocol

1. la fermentation et l’échantillonnage Préparation des supports et des fermenteursRemarque : Toutes les fermentations sont effectuées en parallèle, à l’aide de la même souche et dans le même chimiquement définies milieu synthétique (SM, composition fournie dans le tableau 1), qui comprend un mélange d’ammonium et d’acides aminés comme sources d’azote15. Pour chaque fermentation, un composé unique d’azote est fourni exclusiv…

Representative Results

La figure 3 présente un schéma du flux de travail qui a été mis en place pour enquêter sur la gestion par la levure de multiples sources d’azote qui se trouvent au cours de la fermentation du vin.Pour les différents points d’échantillonnage, les caractéristiques des paramètres biologiques – la croissance, les habitudes de consommation d’azote et le profil d’acides aminés acide – spectacle une reproductibilité élevée parmi les ferm…

Discussion

Quantification de la séparation de composés par l’intermédiaire de réseaux métaboliques à l’aide d’expériences de traceur isotopique est une approche prometteuse pour comprendre le fonctionnement du métabolisme microbien. Cette méthode, alors qu’il est appliqué avec succès avec un ou deux substrats marqués, ne peut être appliquée actuellement pour étudier le métabolisme de diverses sources à l’aide de plusieurs isotopes élémentaires étiquetées (c.-à-d., plus de deux substrats). En…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin et Jean-Marie Sabalyrolles pour leur contribution à la conception du système robotique assistée par fermentation et Martine Pradal, Nicolas Bouvier et Pascale Brial pour leur soutien technique. Le financement de ce projet a été fourni par le Ministère de l’Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie.

Materials

D-Glucose PanReac 141341.0416
D-Fructose PanReac 142728.0416
DL-Malic acid Sigma Aldrich M0875
Citric acid monohydrate Sigma Aldrich C7129
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P5379
Potassium sulfate Sigma Aldrich P0772
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma Aldrich 230391
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C7902
Sodium chloride Sigma Aldrich S9625
Ammonium chloride Sigma Aldrich A4514
Sodium hydroxide Sigma Aldrich 71690
Manganese sulfate monohydrate Sigma Aldrich M7634
Zinc sulfate heptahydrate Sigma Aldrich Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate Sigma Aldrich C7631
Potassium iodine Sigma Aldrich P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate Sigma Aldrich C3169
Boric acid Sigma Aldrich B7660
Ammonium heptamolybdate Sigma Aldrich A7302
Myo-inositol Sigma Aldrich I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma Aldrich 21210
Thiamine, hydrochloride Sigma Aldrich T4625
Nicotinic acid Sigma Aldrich N4126
Pyridoxine Sigma Aldrich P5669
Biotine Sigma Aldrich B4501
Ergostérol Sigma Aldrich E6510
Tween 80 Sigma Aldrich P1754
Ethanol absolute VWR Chemicals 101074F
Iron (III) chloride hexahydrate Sigma Aldrich 236489
L-Aspartic acid Sigma Aldrich A9256
L-Glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L-Alanine Sigma Aldrich A7627
L-Arginine Sigma Aldrich A5006
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
L-Glutamine Sigma Aldrich G3126
Glycine Sigma Aldrich G7126
L-Histidine Sigma Aldrich H8000
L-Isoleucine Sigma Aldrich I2752
L-Leucine Sigma Aldrich L8000
L-Lysine Sigma Aldrich L5501
L-Methionine Sigma Aldrich M9625
L-Phenylalanine Sigma Aldrich P2126
L-Proline Sigma Aldrich P0380
L-Serine Sigma Aldrich S4500
L-Threonine Sigma Aldrich T8625
L-Tryptophane Sigma Aldrich T0254
L-Tyrosine Sigma Aldrich T3754
L-Valine Sigma Aldrich V0500
13C5-L-Valine Eurisotop CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine Eurisotop CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride Eurisotop NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine Eurisotop NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine Eurisotop NLM-396-PK
Ethyl acetate Sigma Aldrich 270989
Ethyl propanoate Sigma Aldrich 112305
Ethyl 2-methylpropanoate Sigma Aldrich 246085
Ethyl butanoate Sigma Aldrich E15701
Ethyl 2-methylbutanoate Sigma Aldrich 306886
Ethyl 3-methylbutanoate Sigma Aldrich 8.08541.0250
Ethyl hexanoate Sigma Aldrich 148962
Ethyl octanoate Sigma Aldrich W244910
Ethyl decanoate Sigma Aldrich W243205
Ethyl dodecanoate Sigma Aldrich W244112
Ethyl lactate Sigma Aldrich W244015
Diethyl succinate Sigma Aldrich W237701
2-methylpropyl acetate Sigma Aldrich W217514
2-methylbutyl acetate Sigma Aldrich W364401
3-methyl butyl acetate Sigma Aldrich 287725
2-phenylethyl acetate Sigma Aldrich 290580
2-methylpropanol Sigma Aldrich 294829
2-methylbutanol Sigma Aldrich 133051
3-methylbutanol Sigma Aldrich 309435
Hexanol Sigma Aldrich 128570
2-phenylethanol Sigma Aldrich 77861
Propanoic acid Sigma Aldrich 94425
Butanoic acid Sigma Aldrich 19215
2-methylpropanoic acid Sigma Aldrich 58360
2-methylbutanoic acid Sigma Aldrich 193070
3-methylbutanoic acid Sigma Aldrich W310212
Hexanoic acid Sigma Aldrich 153745
Octanoic acid Sigma Aldrich W279900
Decanoic acid Sigma Aldrich W236403
Dodecanoic acid Sigma Aldrich L556
Fermentor 1L Legallais AT1357 Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system Dominique Deutscher 029311
Fermenters (250 ml) Legallais AT1352 Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes Sarstedt 62.554.502
Fermentation locks Legallais AT1356 Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract Becton, Dickinson and Company 212750
BactoPeptone Becton, Dickinson and Company 211677
Incubator shaker Infors HT
Particle Counter Beckman Coulter 6605697 Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge Jouan GR412
Plate Butler Robotic system Lab Services BV PF0X-MA Automatic instrument
Plate Butler Software Lab Services BV Robot monitor software
RobView In-house developed calculation software
My SQL International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers Thermo Fisher Scientific 50088009 String Drive 60
BenchBlotter platform rocker Dutscher 60903
Ammonia enzymatic kit R-Biopharm AG 5390
Spectrophotometer cuvettes VWR 634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400 Secomam
Amino acids standards physiological – acidics and neutrals Sigma Aldrich A6407
Amino acids standards physiological – basics Sigma Aldrich A6282
Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent Biochrom BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid Sigma Aldrich S2130
Norleucine Sigma Aldrich N1398
Biochrom 30 AAA Biochrom
EZChrom Elite Biochrom Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium Biochrom BC80-6002-47 Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV Merck Millipore SLGVX13NL Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL VWR 514-4157 Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini Millipore XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm VWR 611-1380
Precision balance Mettler Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried Merck 1029310161 (max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven Legallais
Pierce BCA protein assay kit Interchim UP40840A
Formic acid Fluka 94318
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure Merck 1003171000 Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer Biochrom 80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids Sigma Aldrich AAS18
L-Methionine sulfone Sigma Aldrich M0876
L-Cysteic acid monohydrate Sigma Aldrich 30170
Pyrex glass culture tubes Sigma Aldrich Z653586
Pyridine Acros Organics 131780500 99% Extrapure
Ethyl chloroformate Sigma Aldrich 23131
Dichloromethane Sigma Aldrich 32222
Vials Sigma Aldrich 854165
Microinserts for 1.5ml vials Sigma Aldrich SU860066
GC/MS Agilent Technologies 5890 GC/5973 MS
Chemstation Agilent Technologies Instrument control and data analysis software
Methanol Sigma Aldrich 34860 Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998 ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal Sigma Aldrich 394963
BSTFA Sigma Aldrich 33024
DB-17MS column Agilent Technologies 122-4731 30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous Sigma Aldrich 238597
Technical nitrogen Air products 14629
Zebron ZB-WAX column Phenomenex 7HG-G007-11 30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP Air products 26699
Glass Pasteur pipettes VWR 612-1702

References

  1. Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts. Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).
  2. Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression. J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).
  3. Wiechert, W. 13C metabolic flux analysis. Metab Eng. 3, 195-206 (2001).
  4. Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints. Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).
  5. Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments. BMC Bioinformatics. 9, 266 (2008).
  6. Zamboni, N. 13C metabolic flux analysis in complex systems. Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).
  7. Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis. Biochimie. 91, 697-702 (2009).
  8. Quek, L. -. E., Dietmair, S., Krömer, J. O., Nielsen, L. K. Metabolic flux analysis in mammalian cell culture. Metab Eng. 12, 161-171 (2010).
  9. Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value. J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).
  10. Magasanik, B., Kaiser, C. A. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 290, 1-18 (2002).
  11. Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190, 885-929 (2012).
  12. Cooper, T. G., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 39-99 (1982).
  13. Jones, E. W., Fink, G. R., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 182-299 (1982).
  14. Hazelwood, L. A., Daran, J. -. M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism. Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).
  15. Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions. J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).
  16. Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network. Genome Res. 13, 244-253 (2003).
  17. Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments. Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).

Play Video

Cite This Article
Bloem, A., Rollero, S., Seguinot, P., Crépin, L., Perez, M., Picou, C., Camarasa, C. Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources. J. Vis. Exp. (131), e56393, doi:10.3791/56393 (2018).

View Video