Flux de travail basé sur la combinaison de traceur isotopique des expériences pour étudier le métabolisme microbien de multiples Sources d’éléments nutritifs

Summary

Ce protocole décrit une procédure expérimentale pour quantitativement et complètement étudier le métabolisme de plusieurs sources d’éléments nutritifs. Ce flux de travail, basé sur une combinaison d’expériences de traceur isotopique et une méthode d’analyse, permet le sort des nutriments consommés et l’origine métabolique des molécules synthétisée par des microorganismes à déterminer.

Abstract

Études dans le domaine de la microbiologie s’appuient sur la mise en œuvre d’un large éventail de méthodes. En particulier, le développement de méthodes appropriées contribue substantiellement à fournir une connaissance approfondie du métabolisme des microorganismes qui poussent dans des milieux chimiquement définis contenant l’azote unique et sources de carbone. En revanche, la gestion par le métabolisme de plusieurs sources d’éléments nutritifs, malgré leur large présence dans des environnements naturels ou industriels, demeure pratiquement inexplorée. Cette situation est principalement due au manque de méthodologies appropriées, qui entrave les enquêtes.

Nous rapportons une stratégie expérimentale quantitativement et complètement explorer comment le métabolisme fonctionne lorsqu’un nutriment est fourni comme un mélange de molécules différentes, par exemple, une ressource complexe. Nous décrivons ici son application pour l’évaluation de la répartition des multiples sources d’azote à travers le réseau métabolique de la levure. Le flux de travail combine l’information obtenue au cours d’expériences de traceur isotopique à l’aide de sélectionné ¹³C – ou des substrats marqués au N ¹⁵. Tout d’abord, il se compose des fermentations parallèles et reproductibles dans le même milieu, qui comprend un mélange de molécules contenant du N ; Toutefois, une source d’azote sélectionné est étiquetée chaque fois. Une combinaison des méthodes analytiques (HPLC, GC-MS) est mis en place pour évaluer les modèles étiquetage des composés ciblés et de quantifier la consommation et la récupération des substrats dans les autres métabolites. Une analyse intégrée de l’ensemble de données complet donne un aperçu du sort des substrats consommés dans les cellules. Cette approche nécessite un protocole précis pour la collecte d’échantillons – facilité par un système assistée par robot de surveillance en ligne des fermentations – et la réalisation de nombreuses analyses fastidieuses. Malgré ces contraintes, elle a permis de comprendre, pour la première fois, la séparation des multiples sources d’azote dans tout le réseau métabolique de la levure. Nous avons élucidé la redistribution d’azote provenant de sources plus abondantes vers autres composés N et déterminé l’origine métabolique des molécules volatiles et acide aminé.

Introduction

Comprendre comment opère de métabolisme microbien est une question clé pour la conception de stratégies efficaces pour améliorer les procédés de fermentation et de moduler la production de composés par fermentation. Progrès de la génomique et de la génomique fonctionnelle dans ces deux dernières décennies a largement contribué à étendre la connaissance de la topologie des réseaux métaboliques de nombreux micro-organismes. Accès à ces informations a conduit à l’élaboration d’approches qui visent pour un aperçu complet de la fonction cellulaire¹. Ces méthodes reposent souvent sur une interprétation basée sur des modèles de paramètres mesurables. Ces données expérimentales comprennent, d’une part, le taux d’absorption et de la production métabolite et, d’autre part, des renseignements quantitatifs intracellulaires qui sont obtenus à partir de traceur isotopique expériences. Ces données fournissent des renseignements essentiels pour la déduction de l’activité in vivo des voies différentes dans un réseau métabolique défini^2,3,4. Actuellement, les techniques analytiques disponibles uniquement permettent la détection précise de l’étiquetage des modèles de molécules lors de l’utilisation d’un isotope de l’élément unique et, éventuellement, lors de l’étiquetage conjointement avec deux éléments isotopiques. En outre, dans la plupart des conditions de croissance, la source de carbone se compose uniquement d’un ou de deux composés. Par conséquent, les approches fondées sur les traceurs isotopiques-C ¹³de substrats carbonés ont été largement et avec succès appliquées pour développer une compréhension complète du carbone réseau métabolique opérations^{5,6,7 ,},⁸.

En revanche, dans de nombreux environnements naturels et industriels, la ressource d’azote disponible qui prend en charge la croissance microbienne est souvent composée d’une large gamme de molécules. Par exemple, au cours de la fermentation de la bière ou vin, azote est fournie comme un mélange de 18 acides aminés et d’ammonium à concentrations variables⁹. Cet éventail de composés azotés qui sont accessibles pour l’anabolisme rend ces conditions de milieux complexes considérablement différentes de celles utilisées pour les études physiologiques, comme ces derniers sont réalisés à l’aide d’une unique source d’azote, généralement d’ammonium.

Dans l’ensemble, intériorisé azote composés peuvent être directement incorporés dans les protéines ou catabolisés. La structure du réseau du métabolisme de l’azote dans beaucoup de micro-organismes, y compris la levure Saccharomyces cerevisiae, est très complexe selon la diversité des substrats. Schématiquement, ce système repose sur la combinaison du noyau central du métabolisme de l’azote qui catalyse l’interconversion de glutamine, glutamate et^10,α-cétoglutarate¹¹, avec les transaminases et DÉSAMINASES. Grâce à ce réseau, groupes amines d’ammonium ou d’autres acides aminés sont regroupés et acides α-cétoniques libérés. Ces intermédiaires sont également synthétisée par le carbone central du métabolisme (CCM)^12,13. Ce grand nombre de réactions ramifiées et intermédiaires, intervenant dans le catabolisme des sources d’azote exogène et l’anabolisme de l’acide aminé, remplit les exigences anaboliques des cellules. L’activité à travers ces différentes routes interconnectées se traduit également par l’excrétion des métabolites. En particulier, les acides α-cétoniques sont redirigés par la voie d’Ehrlich pour produire des alcools supérieurs et leur acétate ester dérivés¹⁴, qui contribuent de façon essentielle aux profils sensoriels des produits. Par la suite, le fonctionne du métabolisme de l’azote joue un rôle clé dans la production de biomasse et de la formation de molécules volatiles (arôme).

Les réactions, les enzymes et les gènes impliqués dans le métabolisme de l’azote sont largement décrits dans la littérature. Toutefois, la question de la répartition des multiples sources d’azote dans l’ensemble un réseau métabolique n’a pas encore été abordée. Il y a deux raisons principales qui expliquent ce manque d’information. Tout d’abord, compte tenu de la complexité importante du réseau du métabolisme d’azote, une grande quantité de données quantitatives est nécessaire pour une compréhension complète de son fonctionnement qui n’était pas disponible jusqu’ici. Deuxième, nombreuses contraintes expérimentales et les limitations des méthodes d’analyse ont empêché la mise en œuvre des approches qui ont déjà été utilisées pour l’élucidation de la fonction CCM.

Pour résoudre ces problèmes, nous avons choisi de développer une approche au niveau du système qui repose sur le rapprochement des données d’une série d’expériences de traceur isotopique. Le workflow comporte :
-Un ensemble de fermentations effectué dans les mêmes conditions environnementales, alors qu’une autre source de nutriments sélectionnée (substrat) est étiquetée chaque fois.
-Une combinaison des méthodes analytiques (HPLC, GC-MS) pour une détermination précise, à différentes étapes de la fermentation, de la concentration résiduelle de substrat marqué et la concentration et l’enrichissement isotopique de composés dérivés de le catabolisme de la molécule marquée, y compris les dérivés de la biomasse.
-Un calcul du solde pour chaque masse et isotopique consommé molécule marquée et une analyse intégrée de l’objet dataset afin d’obtenir une vision globale de la gestion de multiples sources d’éléments nutritifs par les microorganismes grâce à la détermination des ratios de flux .

Pour appliquer cette méthode, il faut au comportement reproductible du micro-organisme/souche entre les cultures. En outre, les échantillons provenant de cultures différentes doivent être prises pendant le déroulement de la fermentation bien définis même. Dans les travaux expérimentaux rapporté dans ce manuscrit, un système assistée par robot est utilisé pour le suivi en ligne des fermentations pour tenir compte de ces contraintes.

En outre, il est essentiel de choisir une série de substrats marqués (composé, nature et position de l’étiquette) qui est appropriée régler le problème scientifique de l’étude. Ici, arginine, glutamine et ¹⁵N-étiqueté d’ammonium ont été sélectionnés comme les trois sources principales d’azote trouvés dans du jus de raisin. Cela a permis d’évaluer le modèle de redistribution d’azote de composés consommés à l’acide aminé. L’étude visait aussi à enquêter sur le sort de l’épine dorsale de carbone des acides aminés consommés et leur contribution à la production de molécules volatiles. Pour atteindre cet objectif, uniformément ¹³C marqué leucine, isoleucine, thréonine et valine ont été inclus dans l’étude comme les acides aminés dérivés de grands intermédiaires de la voie de Ehrlich.

Dans l’ensemble, nous avons étudié quantitativement comment levure gère une ressource complexe d’azote en redistribuant les sources d’azote exogène pour satisfaire ses exigences anabolisants pendant toute la fermentation tout en éliminant en outre l’excès de précurseurs de carbone comme molécules volatiles. La procédure expérimentale présentée dans cet article peut être appliquée afin d’étudier les autres sources d’éléments nutritifs multiples utilisés par tout autre micro-organisme. Il semble être une approche appropriée pour l’analyse de l’impact du bagage génétique ou des conditions environnementales sur le comportement métabolique des micro-organismes.

Protocol

1. la fermentation et l’échantillonnage Préparation des supports et des fermenteursRemarque : Toutes les fermentations sont effectuées en parallèle, à l’aide de la même souche et dans le même chimiquement définies milieu synthétique (SM, composition fournie dans le tableau 1), qui comprend un mélange d’ammonium et d’acides aminés comme sources d’azote15. Pour chaque fermentation, un composé unique d’azote est fourni exclusiv…

Representative Results

La figure 3 présente un schéma du flux de travail qui a été mis en place pour enquêter sur la gestion par la levure de multiples sources d’azote qui se trouvent au cours de la fermentation du vin.Pour les différents points d’échantillonnage, les caractéristiques des paramètres biologiques – la croissance, les habitudes de consommation d’azote et le profil d’acides aminés acide – spectacle une reproductibilité élevée parmi les ferm…

Discussion

Quantification de la séparation de composés par l’intermédiaire de réseaux métaboliques à l’aide d’expériences de traceur isotopique est une approche prometteuse pour comprendre le fonctionnement du métabolisme microbien. Cette méthode, alors qu’il est appliqué avec succès avec un ou deux substrats marqués, ne peut être appliquée actuellement pour étudier le métabolisme de diverses sources à l’aide de plusieurs isotopes élémentaires étiquetées (c.-à-d., plus de deux substrats). En…

Materials

D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	230391
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9625
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A4514
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	71690
Manganese sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	M7634
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma Aldrich	C7631
Potassium iodine	Sigma Aldrich	P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C3169
Boric acid	Sigma Aldrich	B7660
Ammonium heptamolybdate	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inositol	Sigma Aldrich	I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma Aldrich	21210
Thiamine, hydrochloride	Sigma Aldrich	T4625
Nicotinic acid	Sigma Aldrich	N4126
Pyridoxine	Sigma Aldrich	P5669
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Ergostérol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Ethanol absolute	VWR Chemicals	101074F
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	236489
L-Aspartic acid	Sigma Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanine	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G3126
Glycine	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidine	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Aldrich	L8000
L-Lysine	Sigma Aldrich	L5501
L-Methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Sigma Aldrich	P2126
L-Proline	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptophane	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrosine	Sigma Aldrich	T3754
L-Valine	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valine	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine	Eurisotop	NLM-396-PK
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	270989
Ethyl propanoate	Sigma Aldrich	112305
Ethyl 2-methylpropanoate	Sigma Aldrich	246085
Ethyl butanoate	Sigma Aldrich	E15701
Ethyl 2-methylbutanoate	Sigma Aldrich	306886
Ethyl 3-methylbutanoate	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Ethyl hexanoate	Sigma Aldrich	148962
Ethyl octanoate	Sigma Aldrich	W244910
Ethyl decanoate	Sigma Aldrich	W243205
Ethyl dodecanoate	Sigma Aldrich	W244112
Ethyl lactate	Sigma Aldrich	W244015
Diethyl succinate	Sigma Aldrich	W237701
2-methylpropyl acetate	Sigma Aldrich	W217514
2-methylbutyl acetate	Sigma Aldrich	W364401
3-methyl butyl acetate	Sigma Aldrich	287725
2-phenylethyl acetate	Sigma Aldrich	290580
2-methylpropanol	Sigma Aldrich	294829
2-methylbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-methylbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-phenylethanol	Sigma Aldrich	77861
Propanoic acid	Sigma Aldrich	94425
Butanoic acid	Sigma Aldrich	19215
2-methylpropanoic acid	Sigma Aldrich	58360
2-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	193070
3-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	W310212
Hexanoic acid	Sigma Aldrich	153745
Octanoic acid	Sigma Aldrich	W279900
Decanoic acid	Sigma Aldrich	W236403
Dodecanoic acid	Sigma Aldrich	L556
Fermentor 1L	Legallais	AT1357	Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system	Dominique Deutscher	029311
Fermenters (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes	Sarstedt	62.554.502
Fermentation locks	Legallais	AT1356	Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Incubator shaker	Infors HT
Particle Counter	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
Plate Butler Robotic system	Lab Services BV	PF0X-MA	Automatic instrument
Plate Butler Software	Lab Services BV		Robot monitor software
RobView			In-house developed calculation software
My SQL			International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter platform rocker	Dutscher	60903
Ammonia enzymatic kit	R-Biopharm AG	5390
Spectrophotometer cuvettes	VWR	634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400	Secomam
Amino acids standards physiological – acidics and neutrals	Sigma Aldrich	A6407
Amino acids standards physiological – basics	Sigma Aldrich	A6282
Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent	Biochrom	BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid	Sigma Aldrich	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm	VWR	611-1380
Precision balance	Mettler		Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried	Merck	1029310161	(max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven	Legallais
Pierce BCA protein assay kit	Interchim	UP40840A
Formic acid	Fluka	94318
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure	Merck	1003171000	Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer	Biochrom	80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids	Sigma Aldrich	AAS18
L-Methionine sulfone	Sigma Aldrich	M0876
L-Cysteic acid monohydrate	Sigma Aldrich	30170
Pyrex glass culture tubes	Sigma Aldrich	Z653586
Pyridine	Acros Organics	131780500	99% Extrapure
Ethyl chloroformate	Sigma Aldrich	23131
Dichloromethane	Sigma Aldrich	32222
Vials	Sigma Aldrich	854165
Microinserts for 1.5ml vials	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Instrument control and data analysis software
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal	Sigma Aldrich	394963
BSTFA	Sigma Aldrich	33024
DB-17MS column	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous	Sigma Aldrich	238597
Technical nitrogen	Air products	14629
Zebron ZB-WAX column	Phenomenex	7HG-G007-11	30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP	Air products	26699
Glass Pasteur pipettes	VWR	612-1702