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Bioengineering

Flux de travail basé sur la combinaison de traceur isotopique des expériences pour étudier le métabolisme microbien de multiples Sources d’éléments nutritifs

doi: 10.3791/56393 Published: January 22, 2018

Summary

Ce protocole décrit une procédure expérimentale pour quantitativement et complètement étudier le métabolisme de plusieurs sources d’éléments nutritifs. Ce flux de travail, basé sur une combinaison d’expériences de traceur isotopique et une méthode d’analyse, permet le sort des nutriments consommés et l’origine métabolique des molécules synthétisée par des microorganismes à déterminer.

Abstract

Études dans le domaine de la microbiologie s’appuient sur la mise en œuvre d’un large éventail de méthodes. En particulier, le développement de méthodes appropriées contribue substantiellement à fournir une connaissance approfondie du métabolisme des microorganismes qui poussent dans des milieux chimiquement définis contenant l’azote unique et sources de carbone. En revanche, la gestion par le métabolisme de plusieurs sources d’éléments nutritifs, malgré leur large présence dans des environnements naturels ou industriels, demeure pratiquement inexplorée. Cette situation est principalement due au manque de méthodologies appropriées, qui entrave les enquêtes.

Nous rapportons une stratégie expérimentale quantitativement et complètement explorer comment le métabolisme fonctionne lorsqu’un nutriment est fourni comme un mélange de molécules différentes, par exemple, une ressource complexe. Nous décrivons ici son application pour l’évaluation de la répartition des multiples sources d’azote à travers le réseau métabolique de la levure. Le flux de travail combine l’information obtenue au cours d’expériences de traceur isotopique à l’aide de sélectionné 13C - ou des substrats marqués au N 15. Tout d’abord, il se compose des fermentations parallèles et reproductibles dans le même milieu, qui comprend un mélange de molécules contenant du N ; Toutefois, une source d’azote sélectionné est étiquetée chaque fois. Une combinaison des méthodes analytiques (HPLC, GC-MS) est mis en place pour évaluer les modèles étiquetage des composés ciblés et de quantifier la consommation et la récupération des substrats dans les autres métabolites. Une analyse intégrée de l’ensemble de données complet donne un aperçu du sort des substrats consommés dans les cellules. Cette approche nécessite un protocole précis pour la collecte d’échantillons – facilité par un système assistée par robot de surveillance en ligne des fermentations – et la réalisation de nombreuses analyses fastidieuses. Malgré ces contraintes, elle a permis de comprendre, pour la première fois, la séparation des multiples sources d’azote dans tout le réseau métabolique de la levure. Nous avons élucidé la redistribution d’azote provenant de sources plus abondantes vers autres composés N et déterminé l’origine métabolique des molécules volatiles et acide aminé.

Introduction

Comprendre comment opère de métabolisme microbien est une question clé pour la conception de stratégies efficaces pour améliorer les procédés de fermentation et de moduler la production de composés par fermentation. Progrès de la génomique et de la génomique fonctionnelle dans ces deux dernières décennies a largement contribué à étendre la connaissance de la topologie des réseaux métaboliques de nombreux micro-organismes. Accès à ces informations a conduit à l’élaboration d’approches qui visent pour un aperçu complet de la fonction cellulaire1. Ces méthodes reposent souvent sur une interprétation basée sur des modèles de paramètres mesurables. Ces données expérimentales comprennent, d’une part, le taux d’absorption et de la production métabolite et, d’autre part, des renseignements quantitatifs intracellulaires qui sont obtenus à partir de traceur isotopique expériences. Ces données fournissent des renseignements essentiels pour la déduction de l’activité in vivo des voies différentes dans un réseau métabolique défini2,3,4. Actuellement, les techniques analytiques disponibles uniquement permettent la détection précise de l’étiquetage des modèles de molécules lors de l’utilisation d’un isotope de l’élément unique et, éventuellement, lors de l’étiquetage conjointement avec deux éléments isotopiques. En outre, dans la plupart des conditions de croissance, la source de carbone se compose uniquement d’un ou de deux composés. Par conséquent, les approches fondées sur les traceurs isotopiques-C 13de substrats carbonés ont été largement et avec succès appliquées pour développer une compréhension complète du carbone réseau métabolique opérations5,6,7 ,,8.

En revanche, dans de nombreux environnements naturels et industriels, la ressource d’azote disponible qui prend en charge la croissance microbienne est souvent composée d’une large gamme de molécules. Par exemple, au cours de la fermentation de la bière ou vin, azote est fournie comme un mélange de 18 acides aminés et d’ammonium à concentrations variables9. Cet éventail de composés azotés qui sont accessibles pour l’anabolisme rend ces conditions de milieux complexes considérablement différentes de celles utilisées pour les études physiologiques, comme ces derniers sont réalisés à l’aide d’une unique source d’azote, généralement d’ammonium.

Dans l’ensemble, intériorisé azote composés peuvent être directement incorporés dans les protéines ou catabolisés. La structure du réseau du métabolisme de l’azote dans beaucoup de micro-organismes, y compris la levure Saccharomyces cerevisiae, est très complexe selon la diversité des substrats. Schématiquement, ce système repose sur la combinaison du noyau central du métabolisme de l’azote qui catalyse l’interconversion de glutamine, glutamate et10,α-cétoglutarate11, avec les transaminases et DÉSAMINASES. Grâce à ce réseau, groupes amines d’ammonium ou d’autres acides aminés sont regroupés et acides α-cétoniques libérés. Ces intermédiaires sont également synthétisée par le carbone central du métabolisme (CCM)12,13. Ce grand nombre de réactions ramifiées et intermédiaires, intervenant dans le catabolisme des sources d’azote exogène et l’anabolisme de l’acide aminé, remplit les exigences anaboliques des cellules. L’activité à travers ces différentes routes interconnectées se traduit également par l’excrétion des métabolites. En particulier, les acides α-cétoniques sont redirigés par la voie d’Ehrlich pour produire des alcools supérieurs et leur acétate ester dérivés14, qui contribuent de façon essentielle aux profils sensoriels des produits. Par la suite, le fonctionne du métabolisme de l’azote joue un rôle clé dans la production de biomasse et de la formation de molécules volatiles (arôme).

Les réactions, les enzymes et les gènes impliqués dans le métabolisme de l’azote sont largement décrits dans la littérature. Toutefois, la question de la répartition des multiples sources d’azote dans l’ensemble un réseau métabolique n’a pas encore été abordée. Il y a deux raisons principales qui expliquent ce manque d’information. Tout d’abord, compte tenu de la complexité importante du réseau du métabolisme d’azote, une grande quantité de données quantitatives est nécessaire pour une compréhension complète de son fonctionnement qui n’était pas disponible jusqu’ici. Deuxième, nombreuses contraintes expérimentales et les limitations des méthodes d’analyse ont empêché la mise en œuvre des approches qui ont déjà été utilisées pour l’élucidation de la fonction CCM.

Pour résoudre ces problèmes, nous avons choisi de développer une approche au niveau du système qui repose sur le rapprochement des données d’une série d’expériences de traceur isotopique. Le workflow comporte :
-Un ensemble de fermentations effectué dans les mêmes conditions environnementales, alors qu’une autre source de nutriments sélectionnée (substrat) est étiquetée chaque fois.
-Une combinaison des méthodes analytiques (HPLC, GC-MS) pour une détermination précise, à différentes étapes de la fermentation, de la concentration résiduelle de substrat marqué et la concentration et l’enrichissement isotopique de composés dérivés de le catabolisme de la molécule marquée, y compris les dérivés de la biomasse.
-Un calcul du solde pour chaque masse et isotopique consommé molécule marquée et une analyse intégrée de l’objet dataset afin d’obtenir une vision globale de la gestion de multiples sources d’éléments nutritifs par les microorganismes grâce à la détermination des ratios de flux .

Pour appliquer cette méthode, il faut au comportement reproductible du micro-organisme/souche entre les cultures. En outre, les échantillons provenant de cultures différentes doivent être prises pendant le déroulement de la fermentation bien définis même. Dans les travaux expérimentaux rapporté dans ce manuscrit, un système assistée par robot est utilisé pour le suivi en ligne des fermentations pour tenir compte de ces contraintes.

En outre, il est essentiel de choisir une série de substrats marqués (composé, nature et position de l’étiquette) qui est appropriée régler le problème scientifique de l’étude. Ici, arginine, glutamine et 15N-étiqueté d’ammonium ont été sélectionnés comme les trois sources principales d’azote trouvés dans du jus de raisin. Cela a permis d’évaluer le modèle de redistribution d’azote de composés consommés à l’acide aminé. L’étude visait aussi à enquêter sur le sort de l’épine dorsale de carbone des acides aminés consommés et leur contribution à la production de molécules volatiles. Pour atteindre cet objectif, uniformément 13C marqué leucine, isoleucine, thréonine et valine ont été inclus dans l’étude comme les acides aminés dérivés de grands intermédiaires de la voie de Ehrlich.

Dans l’ensemble, nous avons étudié quantitativement comment levure gère une ressource complexe d’azote en redistribuant les sources d’azote exogène pour satisfaire ses exigences anabolisants pendant toute la fermentation tout en éliminant en outre l’excès de précurseurs de carbone comme molécules volatiles. La procédure expérimentale présentée dans cet article peut être appliquée afin d’étudier les autres sources d’éléments nutritifs multiples utilisés par tout autre micro-organisme. Il semble être une approche appropriée pour l’analyse de l’impact du bagage génétique ou des conditions environnementales sur le comportement métabolique des micro-organismes.

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Protocol

1. la fermentation et l’échantillonnage

  1. Préparation des supports et des fermenteurs
    Remarque : Toutes les fermentations sont effectuées en parallèle, à l’aide de la même souche et dans le même chimiquement définies milieu synthétique (SM, composition fournie dans le tableau 1), qui comprend un mélange d’ammonium et d’acides aminés comme sources d’azote15. Pour chaque fermentation, un composé unique d’azote est fourni exclusivement dans un uniforme marqué 13C ou formulaire 15N (100 %), tandis que les autres restent sans étiquette. Pour chaque source d’azote marqué qui est utilisé dans la série d’expériences (ici : 15NH4, U -15N4-Arg, U -15N2-Gln, U -13C6-Leu, U -13C5-Val, U -13C6-Ile, U -13C4-Thr), deux fermenteurs sont préparés. Pour chaque condition, double fermentation est effectuée en utilisant seulement des molécules non étiquetés (fermentations contrôle 7).
    1. Pour chaque source d’azote étudier, de préparer 500 mL de SM moyen qui contient toutes les sources d’azote répertoriés dans le tableau 1, à l’exception du composé qui serviront au 100 % étiquetés forme.
      Remarque : La molécule marquée est ajoutée dans les prochaines étapes.
    2. Pasteuriser chaque média dans un ballon jaugé de 1 L (10 min, 100 ° C) contenant une barre magnétique. Peser la quantité appropriée de la molécule marquée pour atteindre la concentration finale indiquée dans le tableau 1 et les dissoudre dans le milieu.
    3. Stériliser le milieu à l’aide d’un système de filtration sous vide jetables (membrane de l’acétate de cellulose, 0,22 µm). À l’aide d’une éprouvette graduée stérile, diviser le milieu entre deux préstérilisés fermenteurs (250 mL) qui contiennent une barre magnétique et sont équipées de serrures de fermentation pour éviter l’entrée d’oxygène mais de permettre la libération de CO2.
    4. Faire chauffer les fioles de fermentation à 28 ° C en les plaçant dans la salle d’incubation pour 1 nuit (température réglée à 28 ° C).
  2. L’inoculation et le suivi des fermentations
    1. Cultiver la souche de S. cerevisiae dans des tubes stériles contenant 10 mL de milieu YPD à 28 ° C sous agitation (150 tr/min) pendant 12 h. Puis, pipette de 1 mL de la DPJ préculture et transférez-la à 10 mL de milieu SM (dans des tubes stériles 15 mL). Incuber la culture pendant 12 h à 28 ° C sous agitation (150 tr/min).
    2. Sous flux laminaire, recueillir une préculture aliquote et quantifier la population de cellules à l’aide d’un compteur de particules électronique qui est muni d’une ouverture de µm 100. Centrifuger la préculture (2 000 x g, 15 min, 4 ° C) et suspendre le culot dans un volume approprié d’eau stérile pour obtenir une concentration finale de 2. 5 x 108 cellules/mL. Inoculer chaque fermenteur avec 1 mL de la suspension cellulaire.
      Remarque : Le système robotisé utilisé pour surveiller la progression de la fermentation est décrite à la Figure 1.
    3. Préparer la plateforme de fermentation en installant les fermenteurs dans les guides de prise en charge qui sont correctement placés sur les plaques en remuant 21 broches et fixer le taux d’agitation à 270 t/mn. Pour démarrer le contrôle en ligne de chaque fermentation, lancez l’application robot-contrôle, puis cliquez sur le bouton « start test » et sélectionnez le volume de fermentation à effectuer (300 mL).
    4. L’interface affichée permet l’indication du nombre et la position des fermenteurs sur la plate-forme. Afin d’assurer dans ce cas, faites un clic droit sur l’emplacement de la fente et choisir « activer » pour activer le suivi de la cuve de fermentation que se trouvant à cet emplacement.
    5. Initialiser le logiciel de calcul, en permanence en cours d’exécution sur le système, avant de commencer l’acquisition de poids. Cliquez sur le bouton « Initialiser », puis validez avec « OK ». Cliquez sur le bouton « Start » de la demande de robot-contrôle pour démarrer l’acquisition de poids.
  3. Procédure d’échantillonnage
    Remarque : Pour chaque cuve, échantillons sont prélevés lors de la production de2 CO (mis en ligne sur l’ordinateur exécutant le logiciel de calcul de valeur) atteint la consigne obligatoire : 5, 10, 40 et 90 g/L dans cette étude.
    1. Procédure pour les cultures avec des composés marqués d’échantillonnage.
      1. Centrifuger les deux échantillons de 6 mL (2 000 x g, 5 min, 4 ° C). Enregistrer et de stocker les surnageants surgelées en deux parties aliquotes à-80 ° C. Laver les granules deux fois avec 5 mL d’eau distillée et conserver à-80 ° C pour la mesure de l’enrichissement isotopique.
    2. Procédure pour les cultures sans composés marqués d’échantillonnage
      1. Récolte 10 mL de la culture, qui sera utilisée pour la détermination de la masse sèche. Les cellules provenant de deux échantillons de 10 mL de granule par centrifugation (2 000 x g, 5 min, 4 ° C). Laver les granules deux fois avec 10 mL d’eau distillée et les stocker à-80 ° C pour la détermination de la teneur en protéines et acides aminés.

2. quantification des Sources d’azote consommé

  1. Dosage enzymatique des concentrations résiduelles d’ammoniac
    NOTE : La détermination de la concentration d’ammoniac dans les surnageants s’effectue à l’aide d’une trousse commerciale axée sur l’enzyme ; tous les réactifs sont fournis par le fabricant.
    1. Préparer une solution d’ammoniaque standard (61,4 mg/L) en dissolvant 25 mg de précisément pesée (NH4)2donc4 dans une fiole jaugée de 100 mL.
    2. Afin de respecter les instructions du fabricant, effectuer une dilution de 1 / 2 des échantillons qui ont été prises avant la fermentation et à 5 g/L de CO2 sorti. Ajuster le pH des échantillons pour environ 8 en ajoutant 1 M KOH. Prendre note du volume ajouté et en tenir compte dans le facteur de dilution.
    3. Dans des cuvettes de spectrophotomètre de 4 mL, mélanger 100 µL de l’échantillon (diluer si nécessaire), l’eau distillée ou ammoniaque standard avec 2 mL de réactif 1 (0,75 mM ADP et glutamate déshydrogénase de 30 U/mL dans le tampon pH 7,8) et 500 µL de réactif 2 (NADH 1,3 mM). Incuber pendant 15 min à température ambiante et lire NADH absorbance à 340 nm (A1).
    4. Ajouter 500 µL de réactif 3 (60 mM α-cétoglutarate en tampon pH 8), incuber l’échantillon pendant 20 min à température ambiante, et lire l’absorbance du NADH à 340 nm (A2).
    5. Calculer à l’aide de la concentration de l’ammoniac :
      Cl’ammoniac (g/L) = 0,083 x [(0.839 x A1-A2)échantillon- (0,839 x A1-A2)de l’eau distillée]
    6. Vérifier que la concentration correcte est obtenue avec la solution étalon.
  2. À toute détermination chromatographique des concentrations résiduelles d’acides aminés
    Remarque : La détermination des concentrations d’acides aminés dans les surnageants est réalisée en utilisant un système d’analyse dédié d’acides aminés qui repose sur la chromatographie échangeuse d’ions avec dérivation de colonne post de N-composés avec la ninhydrine, ce qui permet leur détection colorimétrique.
    1. Préparer une solution de référence en ajoutant 200 µL d’un mélange commercial d’acides aminés neutres et acides, 200 µL d’un mélange commercial d’acides aminés basiques et 200 µL de 2,5 mM de glutamine à 400 µL de tampon de 200 mM au lithium citrate, pH 2.2. Cette solution de référence chimiquement défini est considérée comme un échantillon.
    2. Ajouter 200 µL de solution d’acide sulfosalicylique 25 % (p/v) contenant 2,5 mM norleucine (étalon interne) à 800 µL de l’échantillon pour éliminer les molécules de hauts poids moléculaire. Incuber pendant 1 h à 4 ° C, centrifugeuse (3 000 x g, 10 min, 4 ° C) et le filtre à travers une membrane de nitrocellulose de pores de 0,22 µm (système de seringue).
    3. Dans le logiciel de programmeur, cliquez sur le bouton « Exécuter » pour commencer la chromatographie liquide analyses (LC) avec l’analyseur équipé d’une colonne échangeuse de cations (forme de lithium). Éluer les acides aminés avec tampons successifs au lithium pour créer un gradient de pH et du gradient de concentration contre-ion en combinaison avec un gradient de température (tableau 2).
    4. Quantifier les composés d’azote après dérivatisation de ninhydrine par un détecteur spectrophotométrique à 570 nm (violet coloration : réaction entre le groupe de ninhydrine et amine des acides aminés) et 440 nm (jaune de coloration : réaction entre le groupe de ninhydrine et imine proline).
    5. Effectuer un calibrage interne de point unique à l’aide de la solution de référence et le norleucine comme étalon interne pour calculer les concentrations des acides aminés dans des échantillons à l’aide du logiciel du fabricant.

3. quantification de l’acide aminé

  1. Mesure du poids de la pile sèche
    1. Filtrer sur un filtre de nitrocellulose (pore taille 0,45 µm) qui est préalablement pesé dans une tasse en aluminium, en utilisant un dispositif à dépression 10 mL de la culture. Laver deux fois avec 50 mL d’eau distillée.
    2. Placez le filtre dans la coupe de l’aluminium et les sécher dans un four à chaleur à 105 ° C pendant 48 h (jusqu'à ce qu’aucun autre changement dans le poids n’est observée) avant la contre-expertise le filtre dans la coupe. Calculer la différence de poids.
    3. Calculer la moyenne d’au moins 3 mesures indépendantes pour déterminer avec exactitude le poids de la pile sèche de la culture de levure.
  2. Quantification de la teneur en protéines des cellules
    Remarque : La quantification de la fraction protéique des cellules s’effectue au moins en trois exemplaires à l’aide de pastilles de cellule non étiquetés qui ont été obtenues comme décrit dans la section 1.3.2.
    1. Extraire des protéines par l’addition de 1 mL de solution de DMSO (50 % v/v) à boulettes congelées et incuber à 105 ° C pendant 1 h dans un four à chaleur sèche.
    2. Quantifier la teneur en protéines dans les extraits de DMSO utilisant le test colorimétrique biochimique qui repose sur la réduction de protéines de Cu++ en ions Cu+ qui sont plus précipitées par l’acide bicinchoninic dans un complexe bleu (essai de BCA).
  3. Détermination de la contribution relative des acides aminés dans les protéines
    NOTE : Le profil d’acide aminé est déterminé au moins en triple exemplaire de pastilles de cellule sans étiquette (1.3.2.).
    1. Préparer un extrait oxydé en suspendant le culot cellulaire dans 200 µL d’acide performique (acide formique à 90 %, 10 % d’eau oxygénée). Incuber pendant 4 heures à 4 ° C et arrêter la réaction par l’addition de 33,6 mg de sulfate de sodium.
      Remarque : L’étape d’oxydation est nécessaire pour convertir les cystéine et méthionine méthionine sulfone et cystéique acide qui est davantage quantifié par chromatographie échangeuse d’ions. Cependant, certains acides aminés (tyrosine, phénylalanine, histidine et arginine) sont dénaturées pendant le traitement d’oxydation. Par conséquent, deux hydrolysats (avec ou sans oxydation) sont préparés.
    2. Ajouter 800 µL de HCl 6N à pastilles de cellule ou oxydé extrait et incuber l’échantillon dans un tube de verre hermétiquement fermés pendant 16 h à 110 ° C dans un four à chaleur sèche. Ajouter 200 µL de norleucine 2,5 mM et retirez le HCl dans un courant d’azote. Laver (resuspendant extrait sec et ensuite enlever le liquide avec un courant d’azote) deux fois avec 800 µL d’eau distillée, puis avec 800 µL d’éthanol. Devoir attendre jusqu'à 800 µL de tampon d’acétate de 200 mM au lithium, pH 2.2.
      NOTE : Convient pour le temps d’incubation pour l’hydrolyse que certains acides aminés ne sont pas stables dans des conditions acides. La fraction de tryptophane en protéines est estimée à partir de données trouvées dans la littérature16, que cet acide aminé est totalement dénaturé au cours de l’hydrolyse de HCl.
    3. Élaborer une norme de l’hydrolysat d’étalonnage interne monopoint. Ajouter 160 µL d’une solution commerciale d’hydrolyses acides aminés à 840 µL de tampon d’acétate de 200 mM au lithium, pH 2.2, qui contient 625 µM méthionine sulfone, 625 acide cystéique µM et 625 µM norleucine.
    4. Déterminer les concentrations relatives des acides aminés dans les protéines à l’aide de la méthode chromatographique décrite au paragraphe 2.2.
  4. Calculs
    1. Calculer le pourcentage en poids de chaque acide aminé dans les protéines en divisant la quantité de chaque acide aminé (mg/L) mesurée par le nombre total d’acide aminé qui a été mesuré dans l’extrait de protéine (somme en mg/L).
    2. Multiplier cette proportion par la concentration des protéines dans la culture (mg/L), c'est-à-dire, le produit entre la teneur en protéines de la biomasse et le poids sec, pour évaluer la concentration de chaque acide aminé acide dans la culture (mg/L).

4. mesure de l’enrichissement isotopique de l’acide aminé

Remarque : Pour la mesure de l’enrichissement isotopique de l’acide aminé, utiliser des granulés de cellules marquées. Trois agents différents sont utilisés pour l’étape de dérivatisation pour quantifier l’enrichissement isotopique des acides aminés. Les intensités des groupes d’ions sont mesurées pour estimer les modèles de marquage des acides aminés. Le signal de chaque ion de cluster correspond à l’abondance des isotopomères masse (m0 = sans étiquetage, m+ 1 = 1 atome étiquetée,...) d’un fragment d’acide aminé. Un exemple de chromatogramme obtenu après l’intervention DMADMF est fourni dans la Figure 2.

  1. Hydrolyse de la biomasse
    1. Hydrolysent les granules cellulaires (correspondant à 1-2 mg de biomasse séchée) en ajoutant 1,2 mL de HCl de 6 M et d’incubation de l’échantillon pendant 16 h à 105 ° C dans des tubes de verre hermétiquement fermés dans un four à chaleur sèche.
    2. Ajouter 1,2 mL d’eau distillée et centrifuger à 3 000 x g pendant 5 min éliminer les débris cellulaires. Distribuer le liquide surnageant dans les fractions de 6 400 µL dans des tubes de verre ouvert. Sécher les fractions dans un four à chaleur à 105 ° C jusqu'à atteindre la consistance de sirop (4-5 h).
  2. Dérivation Ethylchloroformate (ECF)
    1. Dissoudre l’hydrolysat séchée dans 200 µL de 20 mM HCl ; Ensuite, ajoutez 133 µL de pyridine : éthanol (1:4). Ajouter 50 µL de ECF derivatize les acides aminés et d’attendre que tous les CO2 a été libéré. Transférer le mélange pour centrifuger les tubes qui contiennent 500 µL de dichlorométhane pour extraire les composés dérivés.
    2. Vortex les tubes pendant 10 s et centrifugeuse eux pendant 4 min à 10 000 x g ; recueillir la phase organique inférieure avec une pipette Pasteur et le transfert à des flacons de GC qui contiennent des insertions de verre conique afin que les échantillons peuvent être injectés directement dans l’instrument de GC/MS.
  3. (N, N)-diméthylformamide dérivatisation de diméthyle acétal (DMFDMA).
    1. Dissoudre l’hydrolysat séchée dans 50 µL de méthanol et 200 µL d’acétonitrile. Ajouter 300 µL de DMFDMA. Vortex le tube et transfert les échantillons à GC autoéchantillonneur flacons qui contiennent des inserts de verre conique.
  4. N, dérivatisation trifluoroacétamide (BSTFA) O-Bis (triméthylsilyl)
    1. Suspendre l’hydrolysat dans 200 µL d’acétonitrile. Ajouter 200 µL de BSTFA, fermer hermétiquement le tube en verre et incuber pendant 4 h à 135 ° C avant de transférer l’extrait directement dans les flacons de GC.
  5. Analyse par CPG-SM
    1. Analyser des échantillons avec un chromatographe en phase gazeuse qui est équipé d’un injecteur automatique et est couplé à un spectromètre de masse.
      1. Logiciel spécifique à l’instrument permet de contrôler l’instrument et d’analyser les chromatogrammes. Dans le menu « Séquence », cliquez sur la « Table du journal échantillon » pour créer la liste et cliquez sur le bouton « Exécuter » pour démarrer les injections.
        Remarque : Le chromatographe en phase gazeuse est équipée d’une colonne capillaire en silice apolaire 30 m x 0,25 mm avec une épaisseur de film 0,15 μm. Réglez la température de spectromètre de masse quadripolaire 150 ° C et maintenir la ligne de transfert à 250 ° C pour toutes les analyses. Trois programmes analytiques, chaque un spécifique à chaque agent de dérivatisation, sont utilisés.
      2. Dérivés de l’ECF : Utilisation hélium comme phase mobile avec un débit de 1,2 mL/min. régler la température de l’entrée à 230 ° C et celle de la source à 250 ° C. Le programme de l’échantillonneur automatique à injecter 1 µL d’échantillons avec un rapport de 3:1 split. Exécuter les analyses, en augmentant graduellement la température du four comme suit : 130 ° C pendant 3 min ; pente de 15 ° C/min jusqu'à 260 ° C ; maintenir la température à 260 ° C pendant 20 min.
      3. Dérivés DMFDMA : Utilisation hélium comme phase mobile avec un débit constant de 1,2 mL/min. régler la température de l’entrée à 230 ° C et celle de la source à 250 ° C. Le programme de l’échantillonneur automatique à injecter 1 µL d’échantillons avec un rapport de 3:1 split. Exécuter les analyses, en augmentant graduellement la température du four comme suit : 60 ° C pendant 1 minute ; pente de 20 ° C/min à 130 ° C ; deuxième dégradé de 4 ° C/min jusqu'à 260 ° C ; maintenir la température à 260 ° C pendant 10 min.
      4. Dérivés BSTFA : Utilisation hélium comme phase mobile avec un débit constant de 1,2 mL/min. régler la température de l’entrée à 275 ° C et celle de la source à 300 ° C. Exécuter les analyses (injection : 1 µL), progressivement augmenter la température du four comme suit : 110 ° C pendant 1 min ; premier gradient de 2 ° C/min à 154 ° C ; deuxième pente de 5 ° C/min jusqu'à 300 ° C ; maintenir la température à 300 ° C pendant 10 min.
      5. Procédure de détection : Pour chaque mode de dérivation, injecter un échantillon (1 µL) en mode de balayage avec ionisation par impact de positif électronique à 70 eV et prendre note de la période de rétention de chaque acide aminé.
      6. Utilisez ces valeurs pour définir les fenêtres de temps tout au long du chromatogramme et pour les différents ions sélectionnées, qui sont caractéristiques de chaque acide aminé et répertoriés dans le tableau 3; ces valeurs doivent être inclus pour chaque acide aminé. Inclure cette information dans le programme de détection de SIM et exécuter les analyses en mode SIM avec ionisation par impact de positif électronique à 70 eV.
    2. Recueillir les résultats des analyses ; à savoir, pour chaque acide aminé, enregistrer un amas d’intensités qui correspondent à ses isotopomères de masse différents. Traiter les données à l’aide de la dedicatedsoftware17 à corriger pour l’étiquetage naturel et calculer l’enrichissement isotopique de l’acide aminé (définie comme la fraction marquée d’un acide aminé à l’égard de son montant total à la protéine échantillons).
      Remarque : L’enrichissement isotopique d’une molécule (c'est-À-dire), exprimée en pourcentage, est calculé divisant la somme des intensités corrigées des isotopomères massive avec étiquetage (m1, m2,.. .mn) par la somme de la corrigée intensités de tous les isotopomères massives (m0, m1, m2,...n) :
      I. E. = (m1 + m2 +... +n) / (m0 m1+ m2 +... +n)

5. quantification et l’enrichissement isotopique de composés volatils

  1. Extraction de composés volatiles étiquetées
    1. Ajouter 10 µL de normes internes deutérés à 5 mL du surnageant (concentration finale de composés deutérés : 100 µg/L) dans un tube de verre de 15 mL. Ajouter 1 mL de dichlorométhane, bien fermer les tubes et secouez-les sur une plate-forme bascule pendant 20 min. Centrifuger pendant 5 min à 3 000 x g et recueillir la phase organique inférieure dans un tube de verre de 15 mL. Répéter l’extraction de dichlorométhane.
    2. Sécher l’extrait organique plus 500 mg de sulfate de sodium anhydre et recueillir la phase liquide avec une pipette Pasteur. Concentrer l’extrait par un facteur de quatre sous flux d’azote et le transférer dans un flacon pour échantillonneur automatique de GC.
  2. GC-MS quantification de composés volatils
    1. Équiper le chromatographe en phase gazeuse avec colonne capillaire en silice fondue 30 m x 0,25 mm épaisseur 0,25 μm et appliquer un flux constant d’hélium de 1,0 mL/min. Maintenez l’injecteur et la ligne de transfert à 250 ° C.
    2. Injecter 2 µL de l’échantillon avec un rapport de 10:1 split et de séparer les molécules volatiles extraites en utilisant le profil de température de four suivant : maintenir la température pendant 3 min à 40 ° C, elle augmente de 4 ° C/min jusqu'à 220 ° C et puis maintenez le four à 220 ° C pendant 20 min.
    3. Détecter les composés à l’aide d’un spectromètre de masse avec sa température de source fixé à 230 ° C et sa température de spectromètre de masse quadripolaire à 150 ° C. Enregistrer les spectres de masse en mode sélectionné Ion Monitoring (SIM) avec ionisation par impact de positif électronique à 70 eV et en utilisant les grappes d’ion spécifiques aux composés volatils qui sont présentés au tableau 4.
    4. Utilisez un étalonnage externe de 7 points pour quantifier les concentrations de molécules volatiles, la somme des intensités de l’amas d’ion correspondant. Préparer les solutions de chaque composé (10 g/L) dans l’éthanol à 100 %. Ensuite, préparer des solutions étalons pour chaque classe de molécules volatiles (esters éthyliques, acétates, alcools et acides) en mélangeant des solutions mères. Enfin, diluer les différents montants des solutions étalons dans une solution hydroalcoolique de 12 % contenant 5 g/L d’acide tartrique avec le pH ajusté à 3.3 pour préparer des solutions d’étalonnage.
    5. En parallèle, corriger pour l’étiquetage naturelle des intensités de chaque groupe d’ions et calculer l’enrichissement isotopique de composés volatils, qui est définie comme la fraction marquée des molécules et est exprimée en pourcentage en utilisant le logiciel dédié 17.

6. les calculs pour une analyse intégrée de l’objet Dataset

  1. Collecte des données brutes
    1. En utilisant les feuilles de calcul indiqués dans les tableaux 5, 6, 7 et 8, entrez les valeurs de données brutes qui correspondent à la concentration extracellulaire des acides aminés, poids sec de cellule, la teneur en protéines des cellules, la concentration de molécules volatiles et isotopiques enrichissement de l’acide aminé et de molécules volatiles.
      NOTE : Les données présentées dans les tableaux sont exprimées en mM. Tous les résultats sont également exprimées en mg/L en multipliant les valeurs en mM par le poids moléculaire de chaque molécule ou en mg N/L en multipliant les concentrations millimolaires d’un acide aminé acide par la masse atomique de l’azote (14 u) et par le nombre d’azote ato MS qui sont fournis par le catabolisme de cette molécule.
    2. Calculer le pourcentage massique de chaque acide aminé dans les protéines en divisant son montant en mg/L dans l’hydrolysat par le nombre total d’acides aminés (leur somme en mg/L).
    3. Calculer les moyens, les écarts et les erreurs-types de la moyenne des données qui ont été obtenues dans les expériences indépendantes.
    4. Calculer la concentration d’acide (mg/L) pour chaque acide aminé en multipliant le pourcentage de cet acide aminé dans les protéines (protéines de aa/g mg) de la fraction protéique de la biomasse (g protéines/g PS) et la teneur en matières sèches (production de biomasse) dans le moyenne (g DW/L).
  2. 15 Expériences de traceur isotopique N
    1. En utilisant les feuilles de calcul qui sont présentées au tableau 9, calculer les fractions marquées et non marquées d’azote présents dans l’acide aminé (exprimée en mg N/L) de leurs concentrations totales (exprimées en mg N/L) et leur enrichissement isotopique. Pour chaque acide aminé, la fraction étiquetée correspond au produit entre sa concentration totale et l’enrichissement isotopique, et la partie sans étiquette est la différence entre le total et les montants marqués.
    2. Ensuite, déterminer la fraction de l’azote total dans les protéines contenues dans l’acide aminé quantifié dans cette étude en additionnant le montant total de Ala Gly, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, His, Glu et Arg (en mg N/L) et en divisant le total une Mont d’azote contenue dans les protéines de cette somme.
    3. Calculer l’azote fourni par arginine, glutamine ou d’ammonium a été récupéré par les acides protéinogéniques quantifiés dans cette étude en additionnant la fraction marquée (en mg N/L) de l’acide aminé qui ont été quantifiés dans l’étude (Ala, Gly, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, His, Glu et Arg) au cours d’expériences en présence de 15N-étiqueté arginine, glutamine, ou d’ammonium et divisant cette fraction d’azote marqué par la quantité totale d’azote dans l’engagements chiffré acide aminé acides.
    4. Évaluer la contribution des 3 acides aminés plus abondants dans le pool intracellulaire de l’azote utilisé pour la biosynthèse de novo en combinant les données provenant des 13C et 15N expériences de traceur isotopique (feuille de calcul dans le tableau 7).
    5. Sur le montant total (exprimé en mM) de protéinogéniques Val, Leu, Ile ou Thr, retenez la partie provenant de l’incorporation directe des composés consommés (13C expériences) et la partie qui a été synthétisé de novo de l’azote de la 3 principales sources afin d’évaluer la fraction qui a été synthétisé de novo à l’aide d’azote provenant d’autres acides aminés.
    6. Puis, calculer le rapport entre la quantité d’acides aminés synthétisée de novo de l’azote fourni par Gln Arg et NH4+ (somme exprimée en mM) à la quantité totale d’acide aminé (en mM) pour quantifier la contribution de arginine, glutamine et ammonium dans le pool intracellulaire d’azote.
  3. 13 C traceur isotopique expériences
    1. Calculer les fractions marquées et non marquées, de l’acide aminé de concentrations sont exprimées en mM et l’enrichissement isotopique de l’acide aminé qui ont été obtenus au cours d’expériences en présence de 13C-étiqueté Leu, Val, Ile ou Thr. (voir 6.2.1)., tableau 10).
    2. Calculer les fractions marquées et non marquées de composés volatils des concentrations exprimées en mM et l’enrichissement isotopique de composés volatils qui ont été obtenus au cours d’expériences en présence de 13C-étiqueté Leu, Val, Ile ou Thr ( Tableau 10).

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Representative Results

La figure 3 présente un schéma du flux de travail qui a été mis en place pour enquêter sur la gestion par la levure de multiples sources d’azote qui se trouvent au cours de la fermentation du vin.
Pour les différents points d’échantillonnage, les caractéristiques des paramètres biologiques – la croissance, les habitudes de consommation d’azote et le profil d’acides aminés acide – spectacle une reproductibilité élevée parmi les fermentations (Figure 4). Cette cohérence valide la pertinence de l’approche basée sur la combinaison des données générées au cours d’une série de 14 fermentations indépendantes.

La figure 5 montre un aperçu complet de la redistribution de l’azote provenant des sources qui sont disponibles dans le jus de raisin à tous l’acide aminé. Cette analyse est principalement étayée par les résultats obtenus à partir des expériences menées en présence de composés N-marqués de 15. Combiné à la détermination des soldes massives et isotopiques, la mesure de l’enrichissement isotopique de l’acide aminé fourni la première quantification de l’apport d’azote provenant d’arginine, glutamine, d’ammonium et d’autres sources pour les groupes amine de chacun de ces composés. La redistribution importante d’azote qui est souligné ici reflète le rôle important de la synthèse de novo des acides aminés dans le maintien de la croissance de levure.

En outre, cette étude, en comparant les quantités de composés marqués en protéines avec leur consommation, permet à la fraction des molécules consommées azotés qui sont directement incorporés dans les protéines lorsqu’ils entrent dans les cellules à mettre en recouvrement. Acide aminé sont différenciés selon leur niveau d’incorporation directe de la biomasse ; certains d'entre eux sont exclusivement (Asp, Glu) ou plus de 80 % de novo synthétisée, tandis que d’autres composés seulement de petites quantités sont générées par une synthèse de novo . Fait intéressant, ce dernier groupe comprend lysine et histidine, qui sont les acides aminés seules dans lequel toutes les sources utilisées sont directement incorporées.

Figure 5 b présente également, pour certains acides aminés, une comparaison entre la quantité d’acides aminés consommés qui sont récupérés directement dans la biomasse, calculée à partir des données obtenues lors d’expériences de marquage N 15et mesuré expérimentalement dans 13 Des expériences de marquage C. Les petites différences entre ces valeurs montrent la fiabilité et la robustesse de l’approche qui a été mis en place dans cette étude.

La figure 6 montre un exemple de quantitative partitionnement (ratios) des flux par le biais de voies métaboliques qui a été obtenu en mettant en œuvre le flux de travail rapporté dans cet article. Cette carte a été dessinée en combinant l’information de 15N - 13C marqué des substrats et des expériences traceur isotopique et décrit la séparation des acides aminés aliphatiques consommés dans le réseau métabolique qui est impliqué dans la valine et biosynthèse de leucine dans la levure (pour les calculs, voir tableau 1 et tableau 2). En mesurant la production et l’enrichissement isotopique de l’acide aminé et de composés volatils, nous avons évalué la quantité de ces composés qui ont été synthétisée des dorsales de carbone consommé U-C13- valine et U-C13- leucine, qui correspond à la fraction marquée des composés. Par la suite, nous avons été en mesure de déterminer la contribution de CCM à leur formation (la fraction non étiquetée des composés). Bilan massique de carbone mis en place en utilisant le flux de travail et la procédure de calcul qui est proposée ici montrent que plus de 96 % des consommés valine et leucine sont récupérés dans leurs produits de transformation, à savoir, protéinogéniques leucine et valine et volatile supérieur alcools. Cette constatation confirme la pertinence de l’approche signalé pour des études quantitatives du métabolisme. L’analyse intégrée et globale de l’objet dataset offre un éclairage nouveau dans le destin des aminoacides consommés. Étonnamment, une fraction substantielle de la valine et leucine sont catabolisées malgré un déséquilibre considérable entre la disponibilité de ces composés dans le milieu et leurs contenus dans la biomasse. Cependant, la fraction de N-composés exogènes directement incorporés dans les protéines dépend de la nature de l’acide aminé. Un autre point essentiel concerne l’origine métabolique de l’acide aminé et de molécules volatiles. L’analyse du modèle 13C-étiquetage du protéinogéniques leucine et la valine révèle que le squelette carboné de ces acides aminés provient principalement de précurseurs qui ont été synthétisée par le biais de la CCM. Conformément à cette observation, l’incorporation faible d’étiquetage dans l’isobutanol et isoamylique Alcool illustre la participation très limitée du catabolisme de la valine et leucine qui ont été consommés par les levures dans la formation de ces alcools supérieurs.

Figure 1
Figure 1. Système robotique pour le suivi des fermentations haut débit automatisé. Plate-forme robotique (A). Fermenteurs (a) sont placés dans les guides de soutien magnétique agitation plaques (b). Une barrière immatérielle de sécurité (c) protège les utilisateurs. Un bras robotisé (d) déplace les fermenteurs, successivement, de leur emplacement sur un des 6 en remuant les plaques à une balance de précision (e) sur la gauche de la table de travail, pour mesurer le poids toutes les 4 heures. La plateforme robotique se trouve dans une pièce à température contrôlée. (B) Représentation schématique de l’architecture logicielle. Une interface graphique permet aux utilisateurs de définir les paramètres expérimentaux. Cette information est transmise à l’application de commande qui contrôle le bras robotique et enregistre le poids différent dans data.xlm crus différents fichiers (1 fichier/fermentation). Le logiciel de calcul, puis collecte les fichiers xlm et calcule, pour chaque point dans le temps, la quantité de CO2 est rejetée (exprimée en g/L), qui est proportionnelle à la quantité de sucres qui ont été consommés en ce moment et la vitesse de fermentation, ce qui correspond au taux de production de CO2 , g CO2/L/h (proportionnelle au taux de consommation de sucre). Les données sont stockées dans une base de données relationnelle et visualisés à l’aide d’une interface graphique dédiée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Analyse par CPG-SM d’acide aminé : exemple d’alanine. (A) chromatogramme obtenu après dérivation d’acide aminé à l’aide de DMFDMA. (B) les spectres d’alanine dérivé de masse. Deux crêtes principales qui correspondent à des fragments avec m0/z = 99 et m0/z = 158. (C) réaction de dérivation d’alanine avec DMFDMA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Flux de travail pour l’analyse quantitative du métabolisme de l’azote de multiples sources par levure. Ce processus comprend les fermentations (i) un ensemble de 28 (7 sources d’azote et les fermentations avec ou sans composés azotés en deux exemplaires) ; (ii) une partie analytique qui implique différentes procédures d’extraction et de dérivation des molécules et des analyses HPLC ou GM-MS et (iii) de traitement des données brutes et une analyse intégrée des ensembles de données. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Reproductibilité des paramètres biologiques d’un ensemble de fermentations indépendantes. (A-B) Moyenne des valeurs et des écarts de poids sec et la teneur en protéines qui ont été prélevés les fermentations indépendantes 14 réalisées à l’aide de composés non étiquetés. (C-D) Valeurs moyennes et écarts-types des protéinogéniques et des acides aminés consommés qui ont été mesurés au cours des fermentations indépendantes 14 effectué à l’aide de composés non étiquetés. Production de CO2 : 5 (vert), 10 (bleu), 40 (rose) et 90 (violet) g/L. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Redistribution d’azote provenant de trois sources principales d’azote à l’acide aminé pendant la fermentation. (A) origine métabolique de l’acide aminé : diriger l’incorporation d’homologue consommée (bleu) et la synthèse de novo de l’azote fourni par consommés arginine (orange), glutamine (vert), ammonium (rose) ou autres (acides aminés Purple). Exprimée en pourcentage du montant total de chaque acide aminé acide. (B) Comparaison entre le montant de consommé d’acides aminés (bleu) et la partie de l’acide aminé consommée qui est récupéré directement en protéines, calculée à partir des données qui ont été obtenues dans les expériences de traceur 15N (violets) ou expérimentalement mesuré pendant la fermentation avec 13molécules marquées C (roses). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Analyse quantitative de la valine et leucine métabolisme. Partitionnement de leucine consommée (vert) et valine (bleu) à travers le réseau métabolique lorsque 40 g/L de CO2 sont produits. Les barres sont proportionnels à la quantité de chaque composé et sont exprimés en µM, y compris la fraction qui a été synthétisé par métabolisme de carbone central (orange). Les valeurs de la police régulière : montant en µM ; les valeurs dans la police en italique : pourcentage de valine consommée (bleu) ou de la leucine (vert) qui est catabolisé par la voie. Les calculs sont fournis dans le tableau 1 et tableau 2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Composés Montant par litre
Glucose C6H12O6 240 g
Acide malique C4H6O5 6 g
Acide citrique C6H8O7 6 g
Phosphate de potassium KH2PO4 0,75 g
Sulfate de potassium K2SO4 0,5 g
Sulfate de magnésium MgSO4, 7 H2O 0,25 g
Chlorure de calcium CaCl2, 2 H2O 0,155 g
Chlorure de sodium NaCl 0,2 g
Myo-inositol 20 mg
Pantothénate de calcium 1,5 mg
Chlorhydrate de thiamine 0,223 mg
Acide nicotinique 2 mg
Pyridoxine 0,25 mg
Biotine 0,003
MnSO4· H2O 4 mg
ZnSO4·7H2O 4 mg
CuSO4·5H2O 1 mg
CoCl2·6H2O 0,4 mg
H3BO3 1 mg
(NH4) 6 Mo7O24 1 mg
Ergostérol 3,75 mg
Acide oléique 1,25 ML
Tween 80 125 ΜL
Tyrosine 8,6 mg
Tryptophane 84,4 mg
Isoleucine 15,4 mg
Aspartate 20,9 mg
Glutamate 56,7 mg
Arginine 176,2 mg
Leucine 22,8 mg
Thréonine 35,7 mg
Glycine 8,6 mg
Glutamine 237,8 mg
Alanine 68,4 mg
Valine 20,9 mg
Méthionine 14,8 mg
Phénylalanine 17,9 mg
Sérine 37,0 mg
Histidine 15,4 mg
Lysine 8,0 mg
Cystéine 6,2 mg
Proline 288,3 mg
L’ammoniac chlorure NH4Cl 220 mg
Le pH du milieu a été ajusté à 3.3 avec NaOH 10 M.

Tableau 1. Composition du milieu synthétique utilisé dans cette étude. Ce milieu chimiquement défini imite la composition du jus de raisin.

Tampon d’élution Température
De 0 à 6 min Citrate de lithium, 200 mM, pH 2,8 32 ° C
De 6 à 38 min Citrate de lithium, 300 mM, pH 3 32 ° C
De 38 à 57 min Citrate de lithium, 500 mM, pH 3.15 64,5 ° C
De 57 à 83 min Citrate de lithium, 900 mM, pH 3,5 75 ° C
De 83 à 120 min Citrate de lithium, 1650 mM, pH 3.55 75 ° C
De 120 à 130 min Hydroxyde de lithium, 300 mM

Le tableau 2. Conditions d’utilisation pour la séparation des acides aminés par chromatographie échangeuse d’ions. Tampons d’élution avec des concentrations accrues de sels sont successivement utilisés en combinaison avec un gradient de température pour permettre la séparation des acides aminés.

Acides aminés Réactif de dérivatisation RT (min) Grappes de ion (m/z)
Alanine ECFa 3.86 116, 117, 118, 119
DMFDMAb 6.37 99, 100, 101, 102
DMFDMAb 6.37 158, 159, 160, 161
Glycine ECFa 4.19 102, 103, 104
ECFa 4.19 175, 176, 177
DMFDMAb 6.61 85, 86, 87
DMFDMAb 6.61 144, 145, 146
Valine ECFa 4.97 144, 145, 146, 147, 148, 149
DMFDMAb 7.37 127, 128, 129, 130, 131, 132
DMFDMAb 7.37 143, 144, 145, 146, 147, 148
DMFDMAb 7.37 186, 187, 188, 189, 190, 191
Leucine ECFa 5.67 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164
Isoleucine ECFa 5,85 158, 159, 160, 161, 162, 163, 165
Thréonine ECFa 6.48 146, 147, 148, 149, 150
ECFa 6.48 175, 176, 177, 178, 179
Sérine ECFa 6.53 132, 133, 134, 135
ECFa 6.53 175, 176, 177, 178
Proline ECFa 6.83 142, 143, 144, 145, 146, 147
Aspartate ECFa 7.89 188, 189, 190, 191, 192
DMFDMAb 11.77 115, 116, 117, 118, 119
DMFDMAb 11.77 216, 217, 218, 219, 220
Glutamate ECFa 8.81 202, 203, 204, 205, 206, 207
DMFDMAb 12,75 111, 112, 113, 114, 115, 116
DMFDMAb 12,75 143, 144, 145, 146, 147, 148
DMFDMAb 12,75 230, 231, 232, 233, 234, 235
Phénylalanine ECFa 9.53 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201
DMFDMAb 13.67 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152
Lysine ECFa 11.95 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162
Histidine ECFa 12.54 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333
Arginine BSTFAc 18,8 174, 175, 176, 177, 178, 179
un ECF, Chloroformiate d’éthyle ; b DMFDMA, (N, N)-diméthylformamide dibutyle acétal ; c BSTFA, (N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide).

Tableau 3. Paramètres analytiques utilisés pour la détermination de l’enrichissement isotopique des acides aminés à l’aide d’ions sélectionnés (SIM) mode de surveillance. Ce tableau résume les agents chimiques utilisés pour la dérivation, le temps de rétention des composés dérivés et le cluster des ions obtenus en MS (mode Impact électronique) pour chaque acide aminé.

Acides aminés Réactif de dérivatisation RT (min) Grappes de ion (m/z)
Alanine ECFa 3.86 116, 117, 118, 119
DMFDMAb 6.37 99, 100, 101, 102
DMFDMAb 6.37 158, 159, 160, 161
Glycine ECFa 4.19 102, 103, 104
ECFa 4.19 175, 176, 177
DMFDMAb 6.61 85, 86, 87
DMFDMAb 6.61 144, 145, 146
Valine ECFa 4.97 144, 145, 146, 147, 148, 149
DMFDMAb 7.37 127, 128, 129, 130, 131, 132
DMFDMAb 7.37 143, 144, 145, 146, 147, 148
DMFDMAb 7.37 186, 187, 188, 189, 190, 191
Leucine ECFa 5.67 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164
Isoleucine ECFa 5,85 158, 159, 160, 161, 162, 163, 165
Thréonine ECFa 6.48 146, 147, 148, 149, 150
ECFa 6.48 175, 176, 177, 178, 179
Sérine ECFa 6.53 132, 133, 134, 135
ECFa 6.53 175, 176, 177, 178
Proline ECFa 6.83 142, 143, 144, 145, 146, 147
Aspartate ECFa 7.89 188, 189, 190, 191, 192
DMFDMAb 11.77 115, 116, 117, 118, 119
DMFDMAb 11.77 216, 217, 218, 219, 220
Glutamate ECFa 8.81 202, 203, 204, 205, 206, 207
DMFDMAb 12,75 111, 112, 113, 114, 115, 116
DMFDMAb 12,75 143, 144, 145, 146, 147, 148
DMFDMAb 12,75 230, 231, 232, 233, 234, 235
Phénylalanine ECFa 9.53 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201
DMFDMAb 13.67 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152
Lysine ECFa 11.95 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162
Histidine ECFa 12.54 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333
Arginine BSTFAc 18,8 174, 175, 176, 177, 178, 179

Tableau 4. Utilisé pour la détermination de l’enrichissement isotopique et la quantification des composés volatils à l’aide d’ions sélectionnés (SIM) mode de surveillance des paramètres analytiques. Ce tableau résume les temps de rétention et la grappe des ions obtenus en MS (mode Impact électronique) pour chacun des composés volatils.

Tableau 5. Traitement des données brutes provenant de la quantification des résidus acides aminés Dataset contient des données de mesures initiales et résiduelles des acides aminés. Ces valeurs sont utilisées pour calculer le montant de l’acide aminé consommé (par soustraction). Moyennes et écarts sont calculés pour les autres calculs. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 6. Traitement des données brutes provenant de la quantification de l’acide aminé. Ce jeu de données contient des données sur la composition en acides aminés d’hydrolysats (A) de la biomasse et la fraction des protéines dans la biomasse (B). Ces valeurs sont utilisées pour évaluer le pourcentage massique de chaque acide aminé dans les protéines (C). Moyennes et écarts sont calculés pour les autres calculs. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 7. Acide aminé. Cette feuille de calcul est utilisée pour calculer la concentration de l’acide aminé de données résumées dans le tableau 5 et le tableau 6(en mM). Moyennes et écarts sont calculés pour les autres calculs. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 8. Traitement des données brutes provenant de la quantification des alcools supérieurs. Dataset comprend des données à partir des mesures des concentrations de composés volatiles (A) et convertit les données exprimées en unités de mg/L à µM (B). Moyennes et écarts sont calculés pour les autres calculs. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 9. Traitement des données brutes provenant de la détermination de l’acide aminé à l’aide des enrichissements isotopiques 15substrats marqués au N.
Moyennes et écarts sont calculés pour les autres calculs. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 10. Traitement des données brutes provenant de la détermination de l’enrichissement isotopique de l’acide aminé et les composés volatils à l’aide de 13substrats marqués au C.
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Discussion

Quantification de la séparation de composés par l’intermédiaire de réseaux métaboliques à l’aide d’expériences de traceur isotopique est une approche prometteuse pour comprendre le fonctionnement du métabolisme microbien. Cette méthode, alors qu’il est appliqué avec succès avec un ou deux substrats marqués, ne peut être appliquée actuellement pour étudier le métabolisme de diverses sources à l’aide de plusieurs isotopes élémentaires étiquetées (c.-à-d., plus de deux substrats). En effet, les techniques analytiques disponibles permettent la détermination précise des modèles étiquetage d’acide aminé et molécules exclusivement lorsqu’on utilise des isotopes d’un élément unique et éventuellement si co marquage avec deux éléments. Par conséquent, pour pallier ces lacunes et évaluer la gestion de multiples sources d’éléments nutritifs par les microorganismes, nous avons choisi de répéter une série de cultures dans les mêmes conditions environnementales tout en étiquetage un substrat sélectionné avec 13C ou 15 Isotopes N. Puis, plus loin combinaison de l’information spécifique fournie par chaque 13C ou de l’expérience de traceur 15N offre une vue étendue quantitative du métabolisme de plusieurs sources.

La réalisation de l’approche signalé s’appuie sur la mise en œuvre d’une série reproductible des cultures dans des conditions normales et le prélèvement d’échantillons sur une population de cellules dans un état physiologique défini qui est la même pour toutes les cultures (cellule croissance, la consommation du substrat, etc.). Ces conditions doivent être remplies pour que les données obtenues à partir des expériences indépendantes peuvent être mélangées et analysées ensemble. Répondant à ces contraintes nécessite une observation précise et fréquentes de l’activité microbienne qui a été réalisée, dans les travaux expérimentaux rapportés ici, utilisant un système assistée par robot de surveillance en ligne d’activité de fermentation de la levure. Toutefois, des méthodes plus conventionnelles de culture du micro-organisme et de surveillance, tels que la détermination de la croissance cellulaire en mesurant la densité optique, permet de normaliser la procédure d’échantillonnage.

Une autre condition sine qua non pour mener à bien cette méthodologie est d’avoir une vision claire des voies métaboliques qui sont impliqués dans le réseau pour être l’objet d’une enquête. Cette connaissance est essentielle pour choisir l’ensemble des substrats marqués qui sont le plus approprié pour traiter de la question à l’étude. Les composés marqués ainsi que la nature et la position de l’étiquette (13C, 15N ou autres) dans les molécules doit être sélectionné convenablement afin d’i) récupérer toutes les étiquettes fournies par les substrats dans les composés dérivés de leur catabolisme et le sont encore examinées dans la procédure et ii) obtenir des données redondantes qui démontrent la précision de la méthodologie et la validité des conclusions. La procédure décrite ici inclut également un nombre important d’analyses qui pourraient être lente et coûteuse en ressources humaines et financières. En outre, certaines contraintes analytiques peuvent limiter l’utilisation de cette méthodologie. Tout d’abord, utilisateurs doivent s’assurer que toutes les méthodes analytiques qui sont nécessaires pour la quantification des composés produits pendant le métabolisme microbien et pour la détermination de leur enrichissement isotopique sont disponibles. Deuxièmement, cette approche ne s’applique qu’à l’évaluation du métabolisme des substrats pour lequel toute la conversion composés sont produites en quantité suffisante pour doser avec précision.

Dans cet article, nous avons appliqué ce flux de travail pour étudier la gestion des multiples sources d’azote par les levures au cours de la fermentation du vin. Ce rapport offert de nouvelles connaissances sur le métabolisme de la levure, y compris le catabolisme substantiel d’amino-acides plus consommés, combinée à leur incorporation directe faible en protéines et l’apport majeur de CCM pour approvisionner les précurseurs qui est davantage utilisée pour la synthèse de novo d’acide aminé et de la formation de molécules volatiles.

Plus largement, l’approche décrite ici peut être utilisé pour quantifier le partitionnement de plusieurs substrats à travers le réseau métabolique de tout micro-organisme. Il permettra aux chercheurs afin d’élucider le sort de tous les composés consommés après leur entrée dans les cellules et d’aborder l’identification de l’origine métabolique de précurseurs et de produits. Cette information peut être utile pour comparer l’activité métabolique des souches qui ont des origines génétiques différentes ou se développer dans des conditions différentes et, par conséquent, pour élaborer des stratégies rationnelles pour améliorer les procédés de fermentation.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin et Jean-Marie Sabalyrolles pour leur contribution à la conception du système robotique assistée par fermentation et Martine Pradal, Nicolas Bouvier et Pascale Brial pour leur soutien technique. Le financement de ce projet a été fourni par le Ministère de l’Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
D-Glucose PanReac 141341.0416
D-Fructose PanReac 142728.0416
DL-Malic acid Sigma Aldrich M0875
Citric acid monohydrate Sigma Aldrich C7129
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P5379
Potassium sulfate Sigma Aldrich P0772
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma Aldrich 230391
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C7902
Sodium chloride Sigma Aldrich S9625
Ammonium chloride Sigma Aldrich A4514
Sodium hydroxide Sigma Aldrich 71690
Manganese sulfate monohydrate Sigma Aldrich M7634
Zinc sulfate heptahydrate Sigma Aldrich Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate Sigma Aldrich C7631
Potassium iodine Sigma Aldrich P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate Sigma Aldrich C3169
Boric acid Sigma Aldrich B7660
Ammonium heptamolybdate Sigma Aldrich A7302
Myo-inositol Sigma Aldrich I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma Aldrich 21210
Thiamine, hydrochloride Sigma Aldrich T4625
Nicotinic acid Sigma Aldrich N4126
Pyridoxine Sigma Aldrich P5669
Biotine Sigma Aldrich B4501
Ergostérol Sigma Aldrich E6510
Tween 80 Sigma Aldrich P1754
Ethanol absolute VWR Chemicals 101074F
Iron (III) chloride hexahydrate Sigma Aldrich 236489
L-Aspartic acid Sigma Aldrich A9256
L-Glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L-Alanine Sigma Aldrich A7627
L-Arginine Sigma Aldrich A5006
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
L-Glutamine Sigma Aldrich G3126
Glycine Sigma Aldrich G7126
L-Histidine Sigma Aldrich H8000
L-Isoleucine Sigma Aldrich I2752
L-Leucine Sigma Aldrich L8000
L-Lysine Sigma Aldrich L5501
L-Methionine Sigma Aldrich M9625
L-Phenylalanine Sigma Aldrich P2126
L-Proline Sigma Aldrich P0380
L-Serine Sigma Aldrich S4500
L-Threonine Sigma Aldrich T8625
L-Tryptophane Sigma Aldrich T0254
L-Tyrosine Sigma Aldrich T3754
L-Valine Sigma Aldrich V0500
13C5-L-Valine Eurisotop CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine Eurisotop CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride Eurisotop NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine Eurisotop NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine Eurisotop NLM-396-PK
Ethyl acetate Sigma Aldrich 270989
Ethyl propanoate Sigma Aldrich 112305
Ethyl 2-methylpropanoate Sigma Aldrich 246085
Ethyl butanoate Sigma Aldrich E15701
Ethyl 2-methylbutanoate Sigma Aldrich 306886
Ethyl 3-methylbutanoate Sigma Aldrich 8.08541.0250
Ethyl hexanoate Sigma Aldrich 148962
Ethyl octanoate Sigma Aldrich W244910
Ethyl decanoate Sigma Aldrich W243205
Ethyl dodecanoate Sigma Aldrich W244112
Ethyl lactate Sigma Aldrich W244015
Diethyl succinate Sigma Aldrich W237701
2-methylpropyl acetate Sigma Aldrich W217514
2-methylbutyl acetate Sigma Aldrich W364401
3-methyl butyl acetate Sigma Aldrich 287725
2-phenylethyl acetate Sigma Aldrich 290580
2-methylpropanol Sigma Aldrich 294829
2-methylbutanol Sigma Aldrich 133051
3-methylbutanol Sigma Aldrich 309435
Hexanol Sigma Aldrich 128570
2-phenylethanol Sigma Aldrich 77861
Propanoic acid Sigma Aldrich 94425
Butanoic acid Sigma Aldrich 19215
2-methylpropanoic acid Sigma Aldrich 58360
2-methylbutanoic acid Sigma Aldrich 193070
3-methylbutanoic acid Sigma Aldrich W310212
Hexanoic acid Sigma Aldrich 153745
Octanoic acid Sigma Aldrich W279900
Decanoic acid Sigma Aldrich W236403
Dodecanoic acid Sigma Aldrich L556
Fermentor 1L Legallais AT1357 Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system Dominique Deutscher 029311
Fermenters (250 ml) Legallais AT1352 Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes Sarstedt 62.554.502
Fermentation locks Legallais AT1356 Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract Becton, Dickinson and Company 212750
BactoPeptone Becton, Dickinson and Company 211677
Incubator shaker Infors HT
Particle Counter Beckman Coulter 6605697 Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge Jouan GR412
Plate Butler Robotic system Lab Services BV PF0X-MA Automatic instrument
Plate Butler Software Lab Services BV Robot monitor software
RobView In-house developed calculation software
My SQL International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers Thermo Fisher Scientific 50088009 String Drive 60
BenchBlotter platform rocker Dutscher 60903
Ammonia enzymatic kit R-Biopharm AG 5390
Spectrophotometer cuvettes VWR 634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400 Secomam
Amino acids standards physiological - acidics and neutrals Sigma Aldrich A6407
Amino acids standards physiological - basics Sigma Aldrich A6282
Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent Biochrom BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid Sigma Aldrich S2130
Norleucine Sigma Aldrich N1398
Biochrom 30 AAA Biochrom
EZChrom Elite Biochrom Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium Biochrom BC80-6002-47 Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV Merck Millipore SLGVX13NL Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL VWR 514-4157 Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini Millipore XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm VWR 611-1380
Precision balance Mettler Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried Merck 1029310161 (max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven Legallais
Pierce BCA protein assay kit Interchim UP40840A
Formic acid Fluka 94318
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure Merck 1003171000 Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer Biochrom 80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids Sigma Aldrich AAS18
L-Methionine sulfone Sigma Aldrich M0876
L-Cysteic acid monohydrate Sigma Aldrich 30170
Pyrex glass culture tubes Sigma Aldrich Z653586
Pyridine Acros Organics 131780500 99% Extrapure
Ethyl chloroformate Sigma Aldrich 23131
Dichloromethane Sigma Aldrich 32222
Vials Sigma Aldrich 854165
Microinserts for 1.5ml vials Sigma Aldrich SU860066
GC/MS Agilent Technologies 5890 GC/5973 MS
Chemstation Agilent Technologies Instrument control and data analysis software
Methanol Sigma Aldrich 34860 Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998 ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal Sigma Aldrich 394963
BSTFA Sigma Aldrich 33024
DB-17MS column Agilent Technologies 122-4731 30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous Sigma Aldrich 238597
Technical nitrogen Air products 14629
Zebron ZB-WAX column Phenomenex 7HG-G007-11 30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP Air products 26699
Glass Pasteur pipettes VWR 612-1702

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Flux de travail basé sur la combinaison de traceur isotopique des expériences pour étudier le métabolisme microbien de multiples Sources d’éléments nutritifs
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Bloem, A., Rollero, S., Seguinot, P., Crépin, L., Perez, M., Picou, C., Camarasa, C. Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources. J. Vis. Exp. (131), e56393, doi:10.3791/56393 (2018).More

Bloem, A., Rollero, S., Seguinot, P., Crépin, L., Perez, M., Picou, C., Camarasa, C. Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources. J. Vis. Exp. (131), e56393, doi:10.3791/56393 (2018).

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