이 프로토콜 양적이 고 포괄적으로 여러 영양소 소스의 신진 대사를 조사 하는 실험 절차를 설명 합니다. 이 워크플로, 동위 원소 추적 실험 및 분석 절차의 조합에 따라 결정 될 미생물 소비 영양분의 운명과 분자 synthetized의 대사 기원 수 있습니다.
미생물학의 분야에 있는 연구는 다양 한 방법론의 구현에 의존합니다. 특히, 적절 한 방법의 개발은 실질적으로 독특한 질소와 탄소 소스를 포함 하는 화학적으로 정의 된 미디어에서 성장 하는 미생물의 물질 대사의 광범위 한 지식을 제공에 기여 한다. 반면, 여러 소스의 영양소, 자연 또는 산업 환경에 광범위 한 그들의 존재에도 불구 하 고 신진 대사를 통해 관리 거의 미개척 남아 있습니다. 이 상황은 조사 방해 적합 한 방법론의 부족 때문에 주로 이다.
우리는 양적 및 포괄적 대사 영양소는 다른 분자, 즉, 복잡 한 리소스의 혼합물으로 제공 하는 때 작동 하는 방법을 탐구 하는 실험적인 전략을 보고 합니다. 여기, 우리는 효 모 대사 네트워크를 통해 여러 질소 소스의 분할을 평가 하기 위한 응용 프로그램을 설명 합니다. 워크플로 안정 동위 원소 추적 실험 선택한 13C-또는 15N 표시 기판 사용 하는 동안 얻은 정보를 결합 합니다. 그것은 먼저 이루어져 있다 N 포함 된 분자;의 혼합물을 포함 하는 동일한 매체에 병렬 및 재현성 발효 그러나, 선택 된 질소 소스 때마다 표시 됩니다. 대상된 화합물의 라벨 패턴을 평가 하 고 소비 및 다른 대사 산물에 기판의 복구를 계량 분석 절차 (HPLC, GC-MS)의 조합을 구현 됩니다. 완전 한 데이터 집합의 통합된 분석 셀 내에서 사용 된 기판의 운명에 대 한 개요를 제공합니다. 이 방법은 발효의 온라인 모니터링을 위한 로봇 기반 시스템에 의해 샘플-촉진의 컬렉션에 대 한 정확한 프로토콜을 필요-그리고 수많은 시간이 걸리는 분석의 공적. 이러한 제약에도 불구 하 고 그것은 이해 하 고, 처음으로, 효 모 대사 네트워크를 통해 여러 질소 소스의 분할 허용. 우리는 다른 N 화합물 쪽으로 더 풍부한 소스에서 질소의 재분배를 해명 하 고 휘발성 분자와 proteinogenic 아미노산의 대사 기원 결정.
미생물 물질 대사 작동 하는 방법 이해는 발효 프로세스를 개선 하 고 발효 화합물의 생산을 조절 하는 효율적인 전략의 디자인에 대 한 중요 한 문제 이다. 유전체학 및 기능 유전체학이 마지막이 십년에서 크게 지식의 많은 미생물 대사 네트워크의 토폴로지를 확장에 기여. 이 정보에 액세스할 세포질 기능1의 포괄적인 개요를 목표로 하는 방식의 개발을 주도. 이러한 방법론은 자주 측정 매개 변수 모델 기반 해석에 의존합니다. 이 실험 데이터 포함, 한 손으로, 대사 산물 통풍 관 및 생산 속도 하 고, 다른 한편으로, 양적 세포내 얻은 정보를 동위 원소 추적 프로그램에서 실험. 이러한 데이터는 정의 된 대사 네트워크2,,34다른 통로의 vivo에서 활동의 공제에 대 한 필수 정보를 제공합니다. 현재, 사용할 수 있는 분석 기법만 단일 요소 동위 원소를 사용 하 여 분자의 패턴을 라벨의 정확한 검색을 사용 가능 하 게 하 고 공동 두 동위 요소와 라벨 때. 또한, 대부분의 성장 조건에서 탄소 소스만 구성 되어 하나 또는 두 화합물의 있습니다. 따라서, 탄소 기판에서 13C 동위 원소 예 광 탄에 따라 접근 넓게 그리고 성공적으로 적용 된 탄소 대사 네트워크 작업5,6,7의 완전 한 이해를 개발 하 ,8.
대조적으로, 많은 자연 및 산업 환경에서 미생물 성장을 지 원하는 사용할 수 있는 질소 리소스는 다양 한 분자의 구성 자주 됩니다. 예를 들어 와인 또는 맥주 발효 하는 동안 질소 18 아미노산 및 가변 농도9암모늄의 혼합물으로 제공 됩니다. Anabolism 액세스할 수 있는 N 화합물의이 만드는이 복잡 한 미디어 조건 크게 다른 생리 적 연구에 대 한 일반적으로 사용 되는 후자 질소, 일반적으로 암모늄의 독특한 소스를 사용 하 여 달성 하는.
전반적으로, 질소 화합물 직접 단백질에 통합 되거나 catabolized 내 면. 효 모 Saccharomyces cerevisiae를 포함 하 여 많은 미생물 물질 대사 질소의 네트워크 구조는 매우 복잡 한 기판의 다양성에 따라. 개요로,이 시스템은 글루타민, 조미료, α ketoglutarate10,11, transaminases와 deaminases의 interconversion를 catalyzes 질소 물질 대사의 중앙 코어의 조합을 기반으로 합니다. 이 네트워크를 통해 암모늄 또는 다른 아미노산에서 아민 그룹 수집 하 고 α-keto 산 발표 했다. 이 중간체는 또한 중앙 탄소 대사 (CCM)12,13synthetized. 이 많은 수의 분기 반응 및 중간체, 외 인 질소 소스의 놓을 proteinogenic 아미노산의 anabolism에 관련 된 세포의 근육 요구 충족. 이러한 다른 상호 경로 통해 활동 대사 산물의 배설에도 발생합니다. 특히, α-keto 산 제품의 감각 프로필에 필수적인 참여자는 더 높은 알콜 및 그들의 아세테이트 에스테 르 유도체14, Ehrlich 통로 통해 리디렉션할 수 있습니다. 그 후, 질소 대사 작동 하는 방법 바이오 매스 생산 및 휘발성 분자를 (향기)의 형성에 중요 한 역할을 재생 합니다.
반응, 효소, 및 질소 대사에 관여 하는 유전자는 문학에서 광대 하 게 기술 된다. 그러나, 대사 네트워크를 통해 여러 질소 소스의 배포의 문제는 아니라 아직 해결 되었습니다. 정보의이 부족을 설명 하는 두 가지 주요 이유가 있습니다. 첫째, 질소 대사 네트워크의 중요 한 복잡성의 관점에서 정량적 데이터의 큰 금액은 사용할 수 작업의 완전 한 이해에 필요한 지금까지. 두 번째, 많은 실험의 제약 조건 및 분석 방법의 한계 방지 이전 CCM 함수 설명에 사용 된 방법의 구현.
이러한 문제를 극복 하기 위해 우리는 일련의 동위 원소 추적 실험에서 데이터의 화해를 기반으로 하는 시스템 수준 접근 방법을 개발 하기로 결정 했다. 워크플로가 포함 되어 있습니다.
-다른 선택한 영양 소스 (기판) 때마다 표시 하는 동안 발효 된 동일한 환경 조건 하에서 실시.
-레이블된 기판 및 농도의 잔류 농도 및에서 파생 된 화합물의 동위 원소 농축 발효의 여러 단계에서 정확한 결정을 위한 분석 절차 (HPLC, GC-MS)의 조합 파생 된 바이오 매스를 포함 하 여 레이블이 지정 된 분자의 놓을.
-각 질량과 동위 균형의 계산 소비 레이블이 분자 및 유동 비율의 결정을 통해 미생물에 의해 여러 영양소 소스 관리에 대 한 글로벌 개요를 얻기 위해 데이터 집합의 추가 통합된 분석 .
이 방법론을 적용 하기 위해 주의 문화 사이의 긴장/미생물의 재현 동작에 지불 되어야 합니다. 또한, 다른 문화에서 샘플 같은 잘 정의 된 발효 진행 중 촬영 해야 합니다. 이 원고에 보고 하는 실험적인 작품에서 로봇 기반 시스템 이러한 제약 조건에 대 한 계정에 발효의 온라인 모니터링에 대 한 사용 됩니다.
또한, 연구의 과학적 문제를 해결 하기 위해 적절 한 레이블이 기판 (화합물, 자연, 그리고 라벨의 위치)의 집합을 선택 하는 것이 필수적입니다. 여기, 15N 표시 된 암모늄, 글루타민, 아르기닌 포도 주스에서 발견 세 가지 주요 질소 근원으로 선정 됐다. 이 proteinogenic 아미노산에 소비 화합물에서 질소 재배포의 패턴을 평가 허용. 우리는 또한 소비 아미노산 및 휘발성 분자의 생산에 그들의 공헌의 탄소 등뼈의 운명을 조사 목적. 충족 시키기 위해이 목표, 균일 하 게 13C 라는 신, 이소류신, 트레오닌, valine 포함 되었다 연구에 Ehrlich 통로의 주요 중간체에서 파생 된 아미노산으로.
전반적으로, 우리 양적 효 모 또한으로 탄소 선구자의 초과 제거 하는 동안 발효를 통해 근육의 요구 사항을 충족 하는 외 인 질소 소스를 재배포 하 여 복잡 한 질소 리소스를 관리 하는 방법을 탐구 휘발성 분자입니다. 이 논문에 보고 된 실험 절차 다른 미생물에 의해 사용 된 다른 여러 영양소 소스 조사에 적용할 수 있습니다. 그것은 미생물의 대사 행동에 유전 배경이 나 환경 조건 영향의 분석에 대 한 적절 한 접근을 것 처럼 보인다.
동위 원소 추적 실험을 사용 하 여 신진 대사 네트워크를 통해 화합물의 분할을 측정 하는 것은 미생물 물질 대사의 동작을 이해 하기 위한 유망한 접근 이다. 이 방법론, 하나 또는 두 개의 레이블된 기판, 성공적으로 적용 하는 동안 수 없습니다 현재 구현 여러 레이블이 원소 동위 원소 (즉, 두 개 이상의 기판)를 사용 하 여 다양 한 소스의 대사를 공부. 실제로, 사용할 수 있는 분석 기법 ?…
The authors have nothing to disclose.
우리 장 Roch Mouret, 실 비 Dequin 로봇 기반 발효 시스템의 개념에 기여에 대 한 장-마리 Sabalyrolles 마틴 Pradal, 니콜라 부 비 그리고 Pascale Brial 그들의 기술 지원에 대 한 감사 합니다. 이 프로젝트에서 제공한 Ministère 드 l’Education 회, 드 라 검색 외에 대 한 자금 드 라 Technologie.
D-Glucose | PanReac | 141341.0416 | |
D-Fructose | PanReac | 142728.0416 | |
DL-Malic acid | Sigma Aldrich | M0875 | |
Citric acid monohydrate | Sigma Aldrich | C7129 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
Potassium sulfate | Sigma Aldrich | P0772 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 230391 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A4514 | |
Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 71690 | |
Manganese sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | |
Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z4750 | |
Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | C7631 | |
Potassium iodine | Sigma Aldrich | P4286 | |
Cobalt (II) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | C3169 | |
Boric acid | Sigma Aldrich | B7660 | |
Ammonium heptamolybdate | Sigma Aldrich | A7302 | |
Myo-inositol | Sigma Aldrich | I5125 | |
D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma Aldrich | 21210 | |
Thiamine, hydrochloride | Sigma Aldrich | T4625 | |
Nicotinic acid | Sigma Aldrich | N4126 | |
Pyridoxine | Sigma Aldrich | P5669 | |
Biotine | Sigma Aldrich | B4501 | |
Ergostérol | Sigma Aldrich | E6510 | |
Tween 80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
Ethanol absolute | VWR Chemicals | 101074F | |
Iron (III) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489 | |
L-Aspartic acid | Sigma Aldrich | A9256 | |
L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
L-Alanine | Sigma Aldrich | A7627 | |
L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | |
Glycine | Sigma Aldrich | G7126 | |
L-Histidine | Sigma Aldrich | H8000 | |
L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
L-Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
L-Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | |
L-Methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
L-Phenylalanine | Sigma Aldrich | P2126 | |
L-Proline | Sigma Aldrich | P0380 | |
L-Serine | Sigma Aldrich | S4500 | |
L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
L-Tryptophane | Sigma Aldrich | T0254 | |
L-Tyrosine | Sigma Aldrich | T3754 | |
L-Valine | Sigma Aldrich | V0500 | |
13C5-L-Valine | Eurisotop | CLM-2249-H-0.25 | |
13C6-L-Leucine | Eurisotop | CLM-2262-H-0.25 | |
15N-Ammonium chloride | Eurisotop | NLM-467-1 | |
ALPHA-15N-L-Glutamine | Eurisotop | NLM-1016-1 | |
U-15N4-L-Arginine | Eurisotop | NLM-396-PK | |
Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 270989 | |
Ethyl propanoate | Sigma Aldrich | 112305 | |
Ethyl 2-methylpropanoate | Sigma Aldrich | 246085 | |
Ethyl butanoate | Sigma Aldrich | E15701 | |
Ethyl 2-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 306886 | |
Ethyl 3-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 8.08541.0250 | |
Ethyl hexanoate | Sigma Aldrich | 148962 | |
Ethyl octanoate | Sigma Aldrich | W244910 | |
Ethyl decanoate | Sigma Aldrich | W243205 | |
Ethyl dodecanoate | Sigma Aldrich | W244112 | |
Ethyl lactate | Sigma Aldrich | W244015 | |
Diethyl succinate | Sigma Aldrich | W237701 | |
2-methylpropyl acetate | Sigma Aldrich | W217514 | |
2-methylbutyl acetate | Sigma Aldrich | W364401 | |
3-methyl butyl acetate | Sigma Aldrich | 287725 | |
2-phenylethyl acetate | Sigma Aldrich | 290580 | |
2-methylpropanol | Sigma Aldrich | 294829 | |
2-methylbutanol | Sigma Aldrich | 133051 | |
3-methylbutanol | Sigma Aldrich | 309435 | |
Hexanol | Sigma Aldrich | 128570 | |
2-phenylethanol | Sigma Aldrich | 77861 | |
Propanoic acid | Sigma Aldrich | 94425 | |
Butanoic acid | Sigma Aldrich | 19215 | |
2-methylpropanoic acid | Sigma Aldrich | 58360 | |
2-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | 193070 | |
3-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | W310212 | |
Hexanoic acid | Sigma Aldrich | 153745 | |
Octanoic acid | Sigma Aldrich | W279900 | |
Decanoic acid | Sigma Aldrich | W236403 | |
Dodecanoic acid | Sigma Aldrich | L556 | |
Fermentor 1L | Legallais | AT1357 | Fermenter handmade for fermentation |
Disposable vacuum filtration system | Dominique Deutscher | 029311 | |
Fermenters (250 ml) | Legallais | AT1352 | Fermenter handmade for fermentation |
Sterile tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
Fermentation locks | Legallais | AT1356 | Fermetation locks handmade for fermentation |
BactoYeast Extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | |
BactoPeptone | Becton, Dickinson and Company | 211677 | |
Incubator shaker | Infors HT | ||
Particle Counter | Beckman Coulter | 6605697 | Multisizer 3 Coulter Counter |
Centrifuge | Jouan | GR412 | |
Plate Butler Robotic system | Lab Services BV | PF0X-MA | Automatic instrument |
Plate Butler Software | Lab Services BV | Robot monitor software | |
RobView | In-house developed calculation software | ||
My SQL | International source database | ||
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers | Thermo Fisher Scientific | 50088009 | String Drive 60 |
BenchBlotter platform rocker | Dutscher | 60903 | |
Ammonia enzymatic kit | R-Biopharm AG | 5390 | |
Spectrophotometer cuvettes | VWR | 634-0678 | |
Spectrophotometer UviLine 9400 | Secomam | ||
Amino acids standards physiological – acidics and neutrals | Sigma Aldrich | A6407 | |
Amino acids standards physiological – basics | Sigma Aldrich | A6282 | |
Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent | Biochrom | BC80-6000-06 | |
Sulfosalycilic acid | Sigma Aldrich | S2130 | |
Norleucine | Sigma Aldrich | N1398 | |
Biochrom 30 AAA | Biochrom | ||
EZChrom Elite | Biochrom | Instrument control and Data analysis software | |
Ultropac 8 resin Lithium | Biochrom | BC80-6002-47 | Lithium High Resolution Physiological Column |
Filter Millex GV | Merck Millipore | SLGVX13NL | Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm) |
Membrane filter PALL | VWR | 514-4157 | Supor-450 47mm 0.45µm |
Vacuum pump Millivac Mini | Millipore | XF5423050 | |
Aluminium smooth weigh dish 70mm | VWR | 611-1380 | |
Precision balance | Mettler | Specifications AE163 | |
Dimethyl sulfoxid dried | Merck | 1029310161 | (max. 0.025% H2O) SeccoSolv |
Combustion oven | Legallais | ||
Pierce BCA protein assay kit | Interchim | UP40840A | |
Formic acid | Fluka | 94318 | |
Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure | Merck | 1003171000 | Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
Lithium acetate buffer | Biochrom | 80-2038-10 | |
Commercial solution of hydrolyzed amino acids | Sigma Aldrich | AAS18 | |
L-Methionine sulfone | Sigma Aldrich | M0876 | |
L-Cysteic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 30170 | |
Pyrex glass culture tubes | Sigma Aldrich | Z653586 | |
Pyridine | Acros Organics | 131780500 | 99% Extrapure |
Ethyl chloroformate | Sigma Aldrich | 23131 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich | 32222 | |
Vials | Sigma Aldrich | 854165 | |
Microinserts for 1.5ml vials | Sigma Aldrich | SU860066 | |
GC/MS | Agilent Technologies | 5890 GC/5973 MS | |
Chemstation | Agilent Technologies | Instrument control and data analysis software | |
Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Chromasolv, for HPLC |
Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | ChromasolvPlus, for HPLC |
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal | Sigma Aldrich | 394963 | |
BSTFA | Sigma Aldrich | 33024 | |
DB-17MS column | Agilent Technologies | 122-4731 | 30m*0.25mm*0.15µm |
Sodium sulfate, anhydrous | Sigma Aldrich | 238597 | |
Technical nitrogen | Air products | 14629 | |
Zebron ZB-WAX column | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m*0.25mm*0.25µm |
Helium BIP | Air products | 26699 | |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1702 |