Arbeidsflyt basert på kombinasjonen av isotopanrikning Tracer eksperimenter for å undersøke mikrobiell metabolismen av flere næringsstoffer kilder

Summary

Denne protokollen beskriver en eksperimentelle prosedyren kvantitativt og omfattende undersøke metabolismen av flere næringsstoffer kilder. Denne arbeidsflyten, basert på en kombinasjon av isotopanrikning tracer eksperimenter og en analytiske prosedyren kan skjebnen til brukte næringsstoffer og metabolske opprinnelsen til molekyler synthetized av mikroorganismer skal fastsettes.

Abstract

Studier innen mikrobiologi stole på gjennomføringen av en rekke metoder. Spesielt bidrar utviklingen av egnede metoder vesentlig til å gi omfattende kunnskap om metabolismen av mikroorganismer vokser i kjemisk definerte mediet som inneholder unike nitrogen og karbon kilder. Derimot forblir styring gjennom metabolisme av flere næringsstoffer kilder, til tross for sin brede tilstedeværelse i natur- eller industrielle miljøer, nesten ukjente. Denne situasjonen skyldes hovedsakelig mangel på passende metoder, som hindrer undersøkelser.

Vi rapporterer en eksperimentell strategi kvantitativt og omfattende utforske hvordan stoffskiftet fungerer når et næringsstoff som finnes som en blanding av ulike molekyler, i.e., en omfattende ressurs. Her beskriver vi sin søknad for å vurdere partisjonering flere nitrogen kilder gjennom gjær metabolske nettverket. Arbeidsflyten kombinerer informasjon innhentet under stabil isotop tracer eksperimenter med valgte ¹³C- eller ¹⁵N-merket underlag. Den første består av parallelle og reproduserbar fermentations i samme medium, som inneholder en blanding av N inneholder molekyler; men er en valgte nitrogen kilde merket hver gang. En kombinasjon av analytisk prosedyrer (HPLC, GC-MS) er gjennomført å vurdere merking mønstre av målrettet forbindelser og å kvantifisere forbruk og gjenoppretting av underlag i andre metabolitter. En integrert analyse av hele datasettet gir en oversikt over skjebnen til brukte underlag i celler. Dette krever en presis protokoll for innsamling av prøver-tilrettelagt av en robot-assistert system for avlytting av fermentations- og oppnåelse av mange tidkrevende analyser. Til tross for disse begrensningene er lov det forståelse for første gang, partisjonering av flere nitrogen kilder på gjær metabolske nettverket. Vi belyst videreformidling av nitrogen fra mer rikelig kilder mot andre N-forbindelser og bestemt metabolske opprinnelsen til ustabile molekyler og proteinogenic aminosyrer.

Introduction

Forstå er hvordan mikrobiell metabolisme driver en viktig sak for utformingen av effektive strategier for å forbedre gjæring prosesser og modulere produksjonen av fermentative forbindelser. Fremskritt i genomics og funksjonell genomforskning i disse to siste tiårene i stor grad bidratt til å utvide kunnskapen om topologien for metabolske nettverk i mange mikroorganismer. Tilgang til denne informasjonen førte til utviklingen av tilnærminger som mål for en omfattende oversikt over cellulære funksjoner¹. Disse metodene er ofte avhengige av en modell-basert tolkning av målbare parametere. Disse eksperimentelle data omfatter, på den ene siden metabolitten opptak og produksjon priser, og på den annen side, kvantitativ intracellulær informasjon som hentes fra isotop tracer eksperimenter. Disse dataene inneholder viktig informasjon om fradrag i vivo aktivitet av ulike veier i en definert metabolske nettverk^2,3,4. Foreløpig tilgjengelig analytiske teknikker bare aktiverer nøyaktig påvisning av merking mønstre av molekyler ved en ett element isotop og muligens når co merking med to isotopanrikning elementer. Videre under de fleste vekst forhold består karbon kilde bare av én eller to-forbindelser. Følgelig ble tilnærminger basert på ¹³C-isotopanrikning tracers fra karbon underlag utbredt og vellykket brukt til å utvikle en fullstendig forståelse av karbon metabolske nettverk operasjoner^{5,6,7 ,8}.

I kontrast i mange naturlige og industrielle miljøer består tilgjengelig nitrogen ressursen som støtter mikrobiell vekst ofte av en rekke molekyler. For eksempel i vin eller øl gjæring leveres nitrogen som en blanding av 18 aminosyrer og ammonium variabel konsentrasjoner⁹. Dette rekke N forbindelser som er tilgjengelige for anabolism gjør disse komplekse media forholdene svært forskjellig fra de som vanligvis brukes for fysiologiske studier, som sistnevnte er oppnådd ved hjelp av en unik kilde til nitrogen, vanligvis ammonium.

Samlet internalisert nitrogen forbindelser kan være direkte innlemmet i proteiner eller catabolized. Nettverkets struktur av nitrogen stoffskiftet i mange mikroorganismer, inkludert gjær Saccharomyces cerevisiae, er svært kompleks i samsvar med mangfoldet av underlag. Skjematisk, er dette systemet basert på kombinasjonen av den sentrale kjernen av nitrogen stoffskifte som gir interconversion glutamin, glutamat og α-ketoglutarate^10,11, transaminaser og deaminases. Gjennom dette nettverket, Amin grupper fra ammonium eller andre aminosyrer er samlet og α-keto syrer utgitt. Disse mellomprodukter er også synthetized til sentrale karbon metabolisme (CCM)^12,13. Antall forgrenet reaksjoner og mellomprodukter, involvert i både katabolisme eksogene nitrogen kilder og anabolism av proteinogenic aminosyrer, oppfyller kravene anabole cellene. Aktiviteten gjennom disse forskjellige sammenkoblede ruter resulterer også i utskillelse av metabolitter. Spesielt kan α-keto syrer bli sendt gjennom Ehrlich sti å produsere høyere alkoholer og deres acetate ester derivater¹⁴, som er viktige bidragsytere til sensorisk profil av produkter. Deretter spiller hvordan nitrogen metabolisme opererer en nøkkelrolle i biomasse produksjon og dannelsen av flyktige molekyler (aroma).

Reaksjoner, enzymer og gener involvert i nitrogen metabolisme er grundig beskrevet i litteraturen. Men har spørsmålet om distribusjon av flere nitrogen kilder gjennom et metabolske nettverk ikke ennå blitt adressert. Det er to hovedgrunner som forklarer denne mangelen på informasjon. Først lys viktig kompleksiteten av nitrogen metabolisme nettverket, en stor mengde kvantitative data er nødvendig for en fullstendig forståelse av driften som ikke var tilgjengelig før nå. Andre, mange eksperimentelle begrensninger og begrensninger av analytiske metoder hindret gjennomføringen av tilnærminger som tidligere ble brukt til utviklingen av CCM-funksjonen.

For å overvinne disse problemene, valgte vi å utvikle en systemnivå tilnærming basert på avstemming av data fra en rekke isotopanrikning tracer eksperimenter. Arbeidsflyten inneholder:
-Et sett av fermentations utført under samme miljømessige forhold, mens en annen valgte næringsstoffer kilde (substrat) er merket hver gang.
-En kombinasjon av analytisk prosedyrer (HPLC, GC-MS) for en nøyaktig bestemmelse, på ulike stadier av gjæring, gjenværende konsentrasjonen av merket substrat og konsentrasjonen og isotopanrikning anriking av forbindelser som er avledet fra katabolisme av merket molekyl, inkludert avledede biomasse.
– En beregning av masse og isotopanrikning saldoen for hver fortært merket molekylet og en mer integrert analyse av datasettet å få en generell oversikt over forvaltningen av flere næringsstoffer kilder av mikroorganismer gjennom bestemmelse av flux prosenter .

Hvis du vil bruke denne metoden, må oppmerksomhet betales i reproduserbar virkemåten til den belastning/microorganism mellom kulturer. Videre må prøver fra ulike kulturer tas under samme veldefinerte gjæring utviklingen. I eksperimentelle arbeidet i dette manuskriptet, brukes en robot-assistert system for avlytting av fermentations å ta hensyn til disse begrensninger.

Det er viktig å velge et sett med merket underlag (sammensatte, natur og plasseringen av merkingen) som passer til til vitenskapelige problemet av studien. Her, ble ¹⁵N-merket ammonium, glutamin og arginin valgt som tre store nitrogen kildene funnet i druesaft. Dette tillot vurdere mønster av nitrogen omfordeling fra brukte forbindelser til aminosyrer proteinogenic. Vi har også som mål å undersøke skjebnen til karbon ryggraden i brukte aminosyrer og deres bidrag til produksjonen av flyktige molekyler. For å oppfylle dette målet, jevnt ¹³C-merket leucine, ble isoleucin, threonin og Valin inkludert i studien som aminosyrer som er avledet fra store intermediates av Ehrlich veien.

Samlet utforsket vi kvantitativt hvordan gjær administrerer en kompleks nitrogen ressurs ved å omfordele eksogene nitrogen kilder for å oppfylle sin anabole krav gjennom gjæring under i tillegg fjerning overskytende av karbon prekursorer som flyktige molekyler. Den eksperimentelle prosedyren i notatet kan brukes for å undersøke andre flere næringsstoffer kilder brukes av noen andre microorganism. Det synes å være en passende tilnærming for analyse av virkningen av genetisk bakgrunn eller miljøforhold på metabolske virkemåten av mikroorganismer.

Protocol

1. gjæring og prøvetaking Utarbeidelse av media og fermentersMerk: Alle fermentations er utført parallelt, bruker den samme stammen og på samme kjemisk definert syntetiske medium (SM, komposisjon i tabell 1), som inneholder en blanding av ammonium og aminosyrer nitrogen kilder15. For hver gjæring tilbys et enkelt nitrogen sammensatt utelukkende i jevnt merket 13C eller 15N skjemaer (100%), mens andre fortsatt umerket. For …

Representative Results

Figur 3 viser en skjematisk diagram for arbeidsflyten som ble gjennomført for å undersøke forvaltningen av gjær flere nitrogen kilder finnes i vin gjæring.For ulike steder av prøvetaking, biologiske parametere-vekst egenskapene, nitrogen forbruksmønstre og profilen proteinogenic aminosyrer-Vis en høy reproduserbarhet blant fermentations (Figur 4). Konsistens validerer relevansen av tilnærming basert på en kombinasjo…

Discussion

Kvantifisere partisjonering av forbindelser via metabolske nettverk som bruker isotopanrikning tracer eksperimenter er en lovende tilnærming for å forstå drift av mikrobielle metabolisme. Nå denne metodikken, mens ble brukt med en eller to merket underlag, kan ikke implementeres for å studere metabolisme av ulike kilder ved hjelp av flere merket elementær isotoper (dvs., mer enn to underlag). Faktisk kan tilgjengelig analytiske teknikker nøyaktig bestemmelse av merking mønstre av proteinogenic aminosyrer…

Materials

D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	230391
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9625
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A4514
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	71690
Manganese sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	M7634
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma Aldrich	C7631
Potassium iodine	Sigma Aldrich	P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C3169
Boric acid	Sigma Aldrich	B7660
Ammonium heptamolybdate	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inositol	Sigma Aldrich	I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma Aldrich	21210
Thiamine, hydrochloride	Sigma Aldrich	T4625
Nicotinic acid	Sigma Aldrich	N4126
Pyridoxine	Sigma Aldrich	P5669
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Ergostérol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Ethanol absolute	VWR Chemicals	101074F
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	236489
L-Aspartic acid	Sigma Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanine	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G3126
Glycine	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidine	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Aldrich	L8000
L-Lysine	Sigma Aldrich	L5501
L-Methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Sigma Aldrich	P2126
L-Proline	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptophane	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrosine	Sigma Aldrich	T3754
L-Valine	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valine	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine	Eurisotop	NLM-396-PK
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	270989
Ethyl propanoate	Sigma Aldrich	112305
Ethyl 2-methylpropanoate	Sigma Aldrich	246085
Ethyl butanoate	Sigma Aldrich	E15701
Ethyl 2-methylbutanoate	Sigma Aldrich	306886
Ethyl 3-methylbutanoate	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Ethyl hexanoate	Sigma Aldrich	148962
Ethyl octanoate	Sigma Aldrich	W244910
Ethyl decanoate	Sigma Aldrich	W243205
Ethyl dodecanoate	Sigma Aldrich	W244112
Ethyl lactate	Sigma Aldrich	W244015
Diethyl succinate	Sigma Aldrich	W237701
2-methylpropyl acetate	Sigma Aldrich	W217514
2-methylbutyl acetate	Sigma Aldrich	W364401
3-methyl butyl acetate	Sigma Aldrich	287725
2-phenylethyl acetate	Sigma Aldrich	290580
2-methylpropanol	Sigma Aldrich	294829
2-methylbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-methylbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-phenylethanol	Sigma Aldrich	77861
Propanoic acid	Sigma Aldrich	94425
Butanoic acid	Sigma Aldrich	19215
2-methylpropanoic acid	Sigma Aldrich	58360
2-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	193070
3-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	W310212
Hexanoic acid	Sigma Aldrich	153745
Octanoic acid	Sigma Aldrich	W279900
Decanoic acid	Sigma Aldrich	W236403
Dodecanoic acid	Sigma Aldrich	L556
Fermentor 1L	Legallais	AT1357	Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system	Dominique Deutscher	029311
Fermenters (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes	Sarstedt	62.554.502
Fermentation locks	Legallais	AT1356	Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Incubator shaker	Infors HT
Particle Counter	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
Plate Butler Robotic system	Lab Services BV	PF0X-MA	Automatic instrument
Plate Butler Software	Lab Services BV		Robot monitor software
RobView			In-house developed calculation software
My SQL			International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter platform rocker	Dutscher	60903
Ammonia enzymatic kit	R-Biopharm AG	5390
Spectrophotometer cuvettes	VWR	634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400	Secomam
Amino acids standards physiological – acidics and neutrals	Sigma Aldrich	A6407
Amino acids standards physiological – basics	Sigma Aldrich	A6282
Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent	Biochrom	BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid	Sigma Aldrich	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm	VWR	611-1380
Precision balance	Mettler		Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried	Merck	1029310161	(max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven	Legallais
Pierce BCA protein assay kit	Interchim	UP40840A
Formic acid	Fluka	94318
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure	Merck	1003171000	Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer	Biochrom	80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids	Sigma Aldrich	AAS18
L-Methionine sulfone	Sigma Aldrich	M0876
L-Cysteic acid monohydrate	Sigma Aldrich	30170
Pyrex glass culture tubes	Sigma Aldrich	Z653586
Pyridine	Acros Organics	131780500	99% Extrapure
Ethyl chloroformate	Sigma Aldrich	23131
Dichloromethane	Sigma Aldrich	32222
Vials	Sigma Aldrich	854165
Microinserts for 1.5ml vials	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Instrument control and data analysis software
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal	Sigma Aldrich	394963
BSTFA	Sigma Aldrich	33024
DB-17MS column	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous	Sigma Aldrich	238597
Technical nitrogen	Air products	14629
Zebron ZB-WAX column	Phenomenex	7HG-G007-11	30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP	Air products	26699
Glass Pasteur pipettes	VWR	612-1702