Fluxo de trabalho baseado na combinação de traçador isotópico experimentos para investigar o metabolismo microbiano de múltiplas fontes de nutrientes

Summary

Este protocolo descreve um procedimento experimental para quantitativamente e exaustivamente investigar o metabolismo de várias fontes de nutrientes. Este fluxo de trabalho, com base em uma combinação de experiências de traçador isotópico e um procedimento analítico, permite que o destino dos nutrientes consumidos e a origem metabólica de moléculas synthetized por microorganismos a ser determinada.

Abstract

Estudos no campo da microbiologia dependem da implementação de uma vasta gama de metodologias. Em particular, o desenvolvimento de métodos adequados substancialmente contribui para fornecer amplo conhecimento do metabolismo dos microrganismos crescendo em meios quimicamente definidos contendo nitrogênio exclusivo e fontes de carbono. Em contraste, a gestão através do metabolismo de várias fontes de nutrientes, apesar de sua ampla presença em ambientes naturais ou industriais, permanece praticamente inexplorada. Esta situação é principalmente devido à falta de metodologias adequadas, o que dificulta as investigações.

Nós relatamos uma estratégia experimental quantitativamente e exaustivamente explorar como metabolismo funciona quando um nutriente é fornecido como uma mistura de moléculas diferentes, ou seja, um recurso complexo. Aqui, descrevemos a sua aplicação para avaliar o particionamento de várias fontes de nitrogênio através da rede metabólica de levedura. O fluxo de trabalho combina informações obtidas durante as experiências de traçador de isótopo estável usando selecionado ¹³C – ou ¹⁵N-rotulado substratos. Primeiro consiste em fermentações paralelas e pode ser reproduzidas no mesmo meio, que inclui uma mistura de moléculas contendo N; no entanto, uma fonte de nitrogênio selecionado é rotulada de cada vez. Uma combinação de procedimentos analíticos (HPLC, GC-MS) é implementada para avaliar os padrões de rotulagem dos compostos alvo e para quantificar o consumo e a recuperação de substratos em outros metabólitos. Uma análise integrada do conjunto completo de dados fornece uma visão geral sobre o destino dos substratos consumidos dentro das células. Essa abordagem requer um protocolo exato para a coleta de amostras – facilitada por um sistema de monitoramento on-line de fermentações robô-assistida – e a realização de inúmeras análises demoradas. Apesar dessas limitações, permitiu compreender, pela primeira vez, o particionamento de várias fontes de nitrogênio em toda a rede metabólica de levedura. Nós elucidado a redistribuição do nitrogênio de fontes mais abundantes em direção a outros compostos de N e determinada a origem metabólica de moléculas voláteis e aminos-ácido proteinogenic.

Introduction

Entendimento como funciona o metabolismo microbiano é uma questão fundamental para a concepção de estratégias eficientes para melhorar os processos de fermentação e modulam a produção de compostos fermentativa. Avanços na genômica e genômica funcional nestas últimas duas décadas, em grande medida contribuídas para alargar o conhecimento da topologia de redes metabólicas em muitos microorganismos. Acesso a esta informação levou ao desenvolvimento de abordagens que aponta para uma visão abrangente da função celular¹. Essas metodologias muitas vezes dependem de uma interpretação baseada em modelo de parâmetros mensuráveis. Estes dados experimentais incluem, por um lado, taxas de absorção e produção do metabólito e, por outro lado, experiências quantitativa informação intracelular que é obtida do traçador de isótopo. Estes dados fornecem informações essenciais para a dedução da atividade na vivo de percursos diferentes em uma rede metabólica definidas^2,3,4. Atualmente, as técnicas analíticas disponíveis apenas permitem a detecção precisa de rotulagem padrões de moléculas quando usando um elemento único isótopo e, possivelmente, quando co etiquetando com dois elementos isotópicos. Além disso, na maioria das condições de crescimento, a fonte de carbono consiste apenas de um ou dois compostos. Por conseguinte, abordagens baseadas em ¹³C-isotópica traçadores de substratos de carbono foram amplamente e com êxito aplicadas para desenvolver uma compreensão completa do carbono rede metabólica operações^{5,6,7 ,8}.

Em contraste, em muitos ambientes naturais e industriais, o recurso de azoto disponível que suporta o crescimento microbiano, muitas vezes é composto de uma vasta gama de moléculas. Por exemplo, durante a fermentação do vinho ou cerveja, o nitrogênio é fornecido como uma mistura de 18 aminoácidos e amônia em concentrações variáveis de⁹. Essa matriz de compostos de N que são acessíveis para o anabolismo faz estas condições complexas de mídia extremamente diferentes daqueles comumente usados para estudos fisiológicos, como o último é obtido usando uma fonte única de nitrogênio, normalmente de amónio.

Em geral, internalizada nitrogênio compostos podem ser diretamente incorporados em proteínas ou catabolizados. A estrutura da rede do metabolismo de nitrogênio em muitos microorganismos, incluindo o fermento Saccharomyces cerevisiae, é muito complexa, em conformidade com a diversidade de substratos. Esquematicamente, este sistema é baseado na combinação do núcleo central do metabolismo de nitrogênio que catalisa a interconversão de glutamina, glutamato e α-cetoglutarato^10,,¹¹, com transaminases e deaminases. Através desta rede, grupos amina de amónio ou outros aminoácidos são reunidos e α-ceto ácidos liberados. Estes intermediários são também synthetized a central carbono metabolismo (CCM)^12,13. Este grande número de reações ramificadas e intermediários, envolvidos em ambos o catabolismo de fontes exógenas de nitrogênio e o anabolismo dos aminos-ácido proteinogenic, cumpre os requisitos anabólicos das células. A atividade através destes diferentes rotas interconectadas resulta também na excreção de metabólitos. Em particular, α-ceto ácidos podem ser redirecionados através da via de Ehrlich para produzir alcoóis superiores e seus acetato éster derivados¹⁴, que são contribuintes essenciais para os perfis sensoriais dos produtos. Posteriormente, como funciona o metabolismo de nitrogênio desempenha um papel fundamental na produção de biomassa e a formação de moléculas voláteis (aroma).

As reações, enzimas e genes envolvidos no metabolismo de nitrogênio são extensivamente descritos na literatura. No entanto, a questão da distribuição de várias fontes de nitrogênio em toda uma rede metabólica não ainda foi resolvida. Existem duas razões principais que explicam esta falta de informação. Em primeiro lugar, tendo em conta a complexidade importante da rede do metabolismo de nitrogênio, uma grande quantidade de dados quantitativos é necessária para um completo entendimento da sua operação, que não estava disponível até agora. Segundo, muitos experimentais restrições e limitações dos métodos analíticos impediram a implementação de abordagens que foram usados anteriormente para a elucidação da função do CCM.

Para superar esses problemas, nós escolhemos desenvolver uma abordagem de nível de sistema que se baseia a reconciliação de dados de uma série de experimentos de traçador isotópico. O fluxo de trabalho inclui:
-Um conjunto de fermentações realizados sob as mesmas condições ambientais, enquanto uma fonte de nutrientes selecionada diferente (substrato) é rotulada de cada vez.
-Uma combinação de procedimentos analíticos (HPLC, GC-MS) para uma determinação precisa, em diferentes fases da fermentação, a concentração residual de rotulada de substrato e a concentração e o enriquecimento isotópico de compostos derivados de o catabolismo da molécula rotulado, incluindo a biomassa derivada.
-Um cálculo do balanço de massa e isotópico para cada consumido molécula etiquetada e uma posterior análise integrada do conjunto de dados para obter uma visão global da gestão de múltiplas fontes de nutrientes por microorganismos através da determinação de taxas de fluxo .

Para aplicar esta metodologia, deve ser dada atenção ao comportamento reprodutível dos microorganismos/tensão entre culturas. Além disso, devem ser colhidas amostras de diferentes culturas durante o andamento de fermentação bem definidos mesmo. No trabalho experimental relatado neste manuscrito, um sistema de robô-assistida é usado para monitoramento on-line de fermentações para contabilizar essas restrições.

Além disso, é essencial escolher um conjunto de substratos rotulados (composto, natureza e posição da rotulagem) que é apropriado para abordar o problema científico do estudo. Aqui, arginina, glutamina e ¹⁵N-rotulado amónio foram selecionados como as três fontes de nitrogênio principais encontradas no suco de uva. Isso permitiu avaliar o padrão de redistribuição do nitrogênio de compostos consumidos para o aminos-ácido proteinogenic. Nós também objetivou investigar o destino do backbone de aminoácidos consumidos e sua contribuição para a produção de moléculas voláteis de carbono. Para cumprir este objectivo, uniformemente ¹³C-rotulado leucina, valina, treonina e isoleucina foram incluídos no estudo como aminoácidos, que são derivados de grandes intermediários da via de Ehrlich.

No geral, nós exploramos quantitativamente como fermento gerencia um recurso complexo nitrogênio pela redistribuição de fontes exógenas de nitrogênio para cumprir suas exigências anabolizantes durante a fermentação enquanto Adicionalmente, removendo o excesso de precursores de carbono como moléculas voláteis. O procedimento experimental relatado neste artigo pode ser aplicado para investigar outras múltiplas fontes de nutrientes usados por qualquer outro microorganismo. Parece ser uma abordagem adequada para a análise do impacto do fundo genético ou condições ambientais sobre o comportamento metabólico de microorganismos.

Protocol

1. fermentação e amostragem Preparação de mídia e fermentadoresNota: Todas as fermentações são efectuadas em paralelo, usando a mesma tensão e na mesma quimicamente definidas sintético médio (SM, composição fornecida na tabela 1), que inclui uma mistura de amônia e aminoácidos como fontes de nitrogênio15. Para cada fermentação, um composto único nitrogênio é fornecido exclusivamente em um uniforme etiquetados 13C ou f…

Representative Results

A Figura 3 apresenta um diagrama de fluxo de trabalho que foi implementado para investigar a gestão pelo fermento de várias fontes de nitrogênio que são encontrados durante a fermentação do vinho.Para diferentes pontos de amostragem, as características de parâmetros – crescimento biológico, padrões de consumo de nitrogênio e o perfil de aminoácidos, proteinogenic demonstrará uma grande reprodutibilidade entre fermentações (<strong class="…

Discussion

Quantificar o particionamento de compostos através de redes metabólicas usando experimentos traçador isotópico é uma abordagem promissora para a compreensão do funcionamento do metabolismo microbiano. Esta metodologia, quando aplicada com êxito com um ou dois substratos rotulados, atualmente não pode ser implementada para estudar o metabolismo de várias fontes usando vários isótopos elementais rotulados (ou seja, mais de dois substratos). Com efeito, as técnicas analíticas disponíveis permitem a de…

Materials

D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	230391
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9625
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A4514
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	71690
Manganese sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	M7634
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma Aldrich	C7631
Potassium iodine	Sigma Aldrich	P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C3169
Boric acid	Sigma Aldrich	B7660
Ammonium heptamolybdate	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inositol	Sigma Aldrich	I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma Aldrich	21210
Thiamine, hydrochloride	Sigma Aldrich	T4625
Nicotinic acid	Sigma Aldrich	N4126
Pyridoxine	Sigma Aldrich	P5669
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Ergostérol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Ethanol absolute	VWR Chemicals	101074F
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	236489
L-Aspartic acid	Sigma Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanine	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G3126
Glycine	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidine	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Aldrich	L8000
L-Lysine	Sigma Aldrich	L5501
L-Methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Sigma Aldrich	P2126
L-Proline	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptophane	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrosine	Sigma Aldrich	T3754
L-Valine	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valine	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine	Eurisotop	NLM-396-PK
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	270989
Ethyl propanoate	Sigma Aldrich	112305
Ethyl 2-methylpropanoate	Sigma Aldrich	246085
Ethyl butanoate	Sigma Aldrich	E15701
Ethyl 2-methylbutanoate	Sigma Aldrich	306886
Ethyl 3-methylbutanoate	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Ethyl hexanoate	Sigma Aldrich	148962
Ethyl octanoate	Sigma Aldrich	W244910
Ethyl decanoate	Sigma Aldrich	W243205
Ethyl dodecanoate	Sigma Aldrich	W244112
Ethyl lactate	Sigma Aldrich	W244015
Diethyl succinate	Sigma Aldrich	W237701
2-methylpropyl acetate	Sigma Aldrich	W217514
2-methylbutyl acetate	Sigma Aldrich	W364401
3-methyl butyl acetate	Sigma Aldrich	287725
2-phenylethyl acetate	Sigma Aldrich	290580
2-methylpropanol	Sigma Aldrich	294829
2-methylbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-methylbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-phenylethanol	Sigma Aldrich	77861
Propanoic acid	Sigma Aldrich	94425
Butanoic acid	Sigma Aldrich	19215
2-methylpropanoic acid	Sigma Aldrich	58360
2-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	193070
3-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	W310212
Hexanoic acid	Sigma Aldrich	153745
Octanoic acid	Sigma Aldrich	W279900
Decanoic acid	Sigma Aldrich	W236403
Dodecanoic acid	Sigma Aldrich	L556
Fermentor 1L	Legallais	AT1357	Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system	Dominique Deutscher	029311
Fermenters (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes	Sarstedt	62.554.502
Fermentation locks	Legallais	AT1356	Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Incubator shaker	Infors HT
Particle Counter	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
Plate Butler Robotic system	Lab Services BV	PF0X-MA	Automatic instrument
Plate Butler Software	Lab Services BV		Robot monitor software
RobView			In-house developed calculation software
My SQL			International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter platform rocker	Dutscher	60903
Ammonia enzymatic kit	R-Biopharm AG	5390
Spectrophotometer cuvettes	VWR	634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400	Secomam
Amino acids standards physiological – acidics and neutrals	Sigma Aldrich	A6407
Amino acids standards physiological – basics	Sigma Aldrich	A6282
Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent	Biochrom	BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid	Sigma Aldrich	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm	VWR	611-1380
Precision balance	Mettler		Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried	Merck	1029310161	(max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven	Legallais
Pierce BCA protein assay kit	Interchim	UP40840A
Formic acid	Fluka	94318
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure	Merck	1003171000	Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer	Biochrom	80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids	Sigma Aldrich	AAS18
L-Methionine sulfone	Sigma Aldrich	M0876
L-Cysteic acid monohydrate	Sigma Aldrich	30170
Pyrex glass culture tubes	Sigma Aldrich	Z653586
Pyridine	Acros Organics	131780500	99% Extrapure
Ethyl chloroformate	Sigma Aldrich	23131
Dichloromethane	Sigma Aldrich	32222
Vials	Sigma Aldrich	854165
Microinserts for 1.5ml vials	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Instrument control and data analysis software
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal	Sigma Aldrich	394963
BSTFA	Sigma Aldrich	33024
DB-17MS column	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous	Sigma Aldrich	238597
Technical nitrogen	Air products	14629
Zebron ZB-WAX column	Phenomenex	7HG-G007-11	30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP	Air products	26699
Glass Pasteur pipettes	VWR	612-1702