Summary

Fluxo de trabalho baseado na combinação de traçador isotópico experimentos para investigar o metabolismo microbiano de múltiplas fontes de nutrientes

Published: January 22, 2018
doi:

Summary

Este protocolo descreve um procedimento experimental para quantitativamente e exaustivamente investigar o metabolismo de várias fontes de nutrientes. Este fluxo de trabalho, com base em uma combinação de experiências de traçador isotópico e um procedimento analítico, permite que o destino dos nutrientes consumidos e a origem metabólica de moléculas synthetized por microorganismos a ser determinada.

Abstract

Estudos no campo da microbiologia dependem da implementação de uma vasta gama de metodologias. Em particular, o desenvolvimento de métodos adequados substancialmente contribui para fornecer amplo conhecimento do metabolismo dos microrganismos crescendo em meios quimicamente definidos contendo nitrogênio exclusivo e fontes de carbono. Em contraste, a gestão através do metabolismo de várias fontes de nutrientes, apesar de sua ampla presença em ambientes naturais ou industriais, permanece praticamente inexplorada. Esta situação é principalmente devido à falta de metodologias adequadas, o que dificulta as investigações.

Nós relatamos uma estratégia experimental quantitativamente e exaustivamente explorar como metabolismo funciona quando um nutriente é fornecido como uma mistura de moléculas diferentes, ou seja, um recurso complexo. Aqui, descrevemos a sua aplicação para avaliar o particionamento de várias fontes de nitrogênio através da rede metabólica de levedura. O fluxo de trabalho combina informações obtidas durante as experiências de traçador de isótopo estável usando selecionado 13C – ou 15N-rotulado substratos. Primeiro consiste em fermentações paralelas e pode ser reproduzidas no mesmo meio, que inclui uma mistura de moléculas contendo N; no entanto, uma fonte de nitrogênio selecionado é rotulada de cada vez. Uma combinação de procedimentos analíticos (HPLC, GC-MS) é implementada para avaliar os padrões de rotulagem dos compostos alvo e para quantificar o consumo e a recuperação de substratos em outros metabólitos. Uma análise integrada do conjunto completo de dados fornece uma visão geral sobre o destino dos substratos consumidos dentro das células. Essa abordagem requer um protocolo exato para a coleta de amostras – facilitada por um sistema de monitoramento on-line de fermentações robô-assistida – e a realização de inúmeras análises demoradas. Apesar dessas limitações, permitiu compreender, pela primeira vez, o particionamento de várias fontes de nitrogênio em toda a rede metabólica de levedura. Nós elucidado a redistribuição do nitrogênio de fontes mais abundantes em direção a outros compostos de N e determinada a origem metabólica de moléculas voláteis e aminos-ácido proteinogenic.

Introduction

Entendimento como funciona o metabolismo microbiano é uma questão fundamental para a concepção de estratégias eficientes para melhorar os processos de fermentação e modulam a produção de compostos fermentativa. Avanços na genômica e genômica funcional nestas últimas duas décadas, em grande medida contribuídas para alargar o conhecimento da topologia de redes metabólicas em muitos microorganismos. Acesso a esta informação levou ao desenvolvimento de abordagens que aponta para uma visão abrangente da função celular1. Essas metodologias muitas vezes dependem de uma interpretação baseada em modelo de parâmetros mensuráveis. Estes dados experimentais incluem, por um lado, taxas de absorção e produção do metabólito e, por outro lado, experiências quantitativa informação intracelular que é obtida do traçador de isótopo. Estes dados fornecem informações essenciais para a dedução da atividade na vivo de percursos diferentes em uma rede metabólica definidas2,3,4. Atualmente, as técnicas analíticas disponíveis apenas permitem a detecção precisa de rotulagem padrões de moléculas quando usando um elemento único isótopo e, possivelmente, quando co etiquetando com dois elementos isotópicos. Além disso, na maioria das condições de crescimento, a fonte de carbono consiste apenas de um ou dois compostos. Por conseguinte, abordagens baseadas em 13C-isotópica traçadores de substratos de carbono foram amplamente e com êxito aplicadas para desenvolver uma compreensão completa do carbono rede metabólica operações5,6,7 ,8.

Em contraste, em muitos ambientes naturais e industriais, o recurso de azoto disponível que suporta o crescimento microbiano, muitas vezes é composto de uma vasta gama de moléculas. Por exemplo, durante a fermentação do vinho ou cerveja, o nitrogênio é fornecido como uma mistura de 18 aminoácidos e amônia em concentrações variáveis de9. Essa matriz de compostos de N que são acessíveis para o anabolismo faz estas condições complexas de mídia extremamente diferentes daqueles comumente usados para estudos fisiológicos, como o último é obtido usando uma fonte única de nitrogênio, normalmente de amónio.

Em geral, internalizada nitrogênio compostos podem ser diretamente incorporados em proteínas ou catabolizados. A estrutura da rede do metabolismo de nitrogênio em muitos microorganismos, incluindo o fermento Saccharomyces cerevisiae, é muito complexa, em conformidade com a diversidade de substratos. Esquematicamente, este sistema é baseado na combinação do núcleo central do metabolismo de nitrogênio que catalisa a interconversão de glutamina, glutamato e α-cetoglutarato10,,11, com transaminases e deaminases. Através desta rede, grupos amina de amónio ou outros aminoácidos são reunidos e α-ceto ácidos liberados. Estes intermediários são também synthetized a central carbono metabolismo (CCM)12,13. Este grande número de reações ramificadas e intermediários, envolvidos em ambos o catabolismo de fontes exógenas de nitrogênio e o anabolismo dos aminos-ácido proteinogenic, cumpre os requisitos anabólicos das células. A atividade através destes diferentes rotas interconectadas resulta também na excreção de metabólitos. Em particular, α-ceto ácidos podem ser redirecionados através da via de Ehrlich para produzir alcoóis superiores e seus acetato éster derivados14, que são contribuintes essenciais para os perfis sensoriais dos produtos. Posteriormente, como funciona o metabolismo de nitrogênio desempenha um papel fundamental na produção de biomassa e a formação de moléculas voláteis (aroma).

As reações, enzimas e genes envolvidos no metabolismo de nitrogênio são extensivamente descritos na literatura. No entanto, a questão da distribuição de várias fontes de nitrogênio em toda uma rede metabólica não ainda foi resolvida. Existem duas razões principais que explicam esta falta de informação. Em primeiro lugar, tendo em conta a complexidade importante da rede do metabolismo de nitrogênio, uma grande quantidade de dados quantitativos é necessária para um completo entendimento da sua operação, que não estava disponível até agora. Segundo, muitos experimentais restrições e limitações dos métodos analíticos impediram a implementação de abordagens que foram usados anteriormente para a elucidação da função do CCM.

Para superar esses problemas, nós escolhemos desenvolver uma abordagem de nível de sistema que se baseia a reconciliação de dados de uma série de experimentos de traçador isotópico. O fluxo de trabalho inclui:
-Um conjunto de fermentações realizados sob as mesmas condições ambientais, enquanto uma fonte de nutrientes selecionada diferente (substrato) é rotulada de cada vez.
-Uma combinação de procedimentos analíticos (HPLC, GC-MS) para uma determinação precisa, em diferentes fases da fermentação, a concentração residual de rotulada de substrato e a concentração e o enriquecimento isotópico de compostos derivados de o catabolismo da molécula rotulado, incluindo a biomassa derivada.
-Um cálculo do balanço de massa e isotópico para cada consumido molécula etiquetada e uma posterior análise integrada do conjunto de dados para obter uma visão global da gestão de múltiplas fontes de nutrientes por microorganismos através da determinação de taxas de fluxo .

Para aplicar esta metodologia, deve ser dada atenção ao comportamento reprodutível dos microorganismos/tensão entre culturas. Além disso, devem ser colhidas amostras de diferentes culturas durante o andamento de fermentação bem definidos mesmo. No trabalho experimental relatado neste manuscrito, um sistema de robô-assistida é usado para monitoramento on-line de fermentações para contabilizar essas restrições.

Além disso, é essencial escolher um conjunto de substratos rotulados (composto, natureza e posição da rotulagem) que é apropriado para abordar o problema científico do estudo. Aqui, arginina, glutamina e 15N-rotulado amónio foram selecionados como as três fontes de nitrogênio principais encontradas no suco de uva. Isso permitiu avaliar o padrão de redistribuição do nitrogênio de compostos consumidos para o aminos-ácido proteinogenic. Nós também objetivou investigar o destino do backbone de aminoácidos consumidos e sua contribuição para a produção de moléculas voláteis de carbono. Para cumprir este objectivo, uniformemente 13C-rotulado leucina, valina, treonina e isoleucina foram incluídos no estudo como aminoácidos, que são derivados de grandes intermediários da via de Ehrlich.

No geral, nós exploramos quantitativamente como fermento gerencia um recurso complexo nitrogênio pela redistribuição de fontes exógenas de nitrogênio para cumprir suas exigências anabolizantes durante a fermentação enquanto Adicionalmente, removendo o excesso de precursores de carbono como moléculas voláteis. O procedimento experimental relatado neste artigo pode ser aplicado para investigar outras múltiplas fontes de nutrientes usados por qualquer outro microorganismo. Parece ser uma abordagem adequada para a análise do impacto do fundo genético ou condições ambientais sobre o comportamento metabólico de microorganismos.

Protocol

1. fermentação e amostragem Preparação de mídia e fermentadoresNota: Todas as fermentações são efectuadas em paralelo, usando a mesma tensão e na mesma quimicamente definidas sintético médio (SM, composição fornecida na tabela 1), que inclui uma mistura de amônia e aminoácidos como fontes de nitrogênio15. Para cada fermentação, um composto único nitrogênio é fornecido exclusivamente em um uniforme etiquetados 13C ou f…

Representative Results

A Figura 3 apresenta um diagrama de fluxo de trabalho que foi implementado para investigar a gestão pelo fermento de várias fontes de nitrogênio que são encontrados durante a fermentação do vinho.Para diferentes pontos de amostragem, as características de parâmetros – crescimento biológico, padrões de consumo de nitrogênio e o perfil de aminoácidos, proteinogenic demonstrará uma grande reprodutibilidade entre fermentações (<strong class="…

Discussion

Quantificar o particionamento de compostos através de redes metabólicas usando experimentos traçador isotópico é uma abordagem promissora para a compreensão do funcionamento do metabolismo microbiano. Esta metodologia, quando aplicada com êxito com um ou dois substratos rotulados, atualmente não pode ser implementada para estudar o metabolismo de várias fontes usando vários isótopos elementais rotulados (ou seja, mais de dois substratos). Com efeito, as técnicas analíticas disponíveis permitem a de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin e Jean-Marie Sabalyrolles, contribuir para a concepção do sistema de fermentação assistida por robótica e Martine Pradal, Nicolas Bouvier e Pascale Brial pelo apoio técnico. Financiamento para este projeto foi fornecido pelo Ministère de Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie.

Materials

D-Glucose PanReac 141341.0416
D-Fructose PanReac 142728.0416
DL-Malic acid Sigma Aldrich M0875
Citric acid monohydrate Sigma Aldrich C7129
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P5379
Potassium sulfate Sigma Aldrich P0772
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma Aldrich 230391
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C7902
Sodium chloride Sigma Aldrich S9625
Ammonium chloride Sigma Aldrich A4514
Sodium hydroxide Sigma Aldrich 71690
Manganese sulfate monohydrate Sigma Aldrich M7634
Zinc sulfate heptahydrate Sigma Aldrich Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate Sigma Aldrich C7631
Potassium iodine Sigma Aldrich P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate Sigma Aldrich C3169
Boric acid Sigma Aldrich B7660
Ammonium heptamolybdate Sigma Aldrich A7302
Myo-inositol Sigma Aldrich I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma Aldrich 21210
Thiamine, hydrochloride Sigma Aldrich T4625
Nicotinic acid Sigma Aldrich N4126
Pyridoxine Sigma Aldrich P5669
Biotine Sigma Aldrich B4501
Ergostérol Sigma Aldrich E6510
Tween 80 Sigma Aldrich P1754
Ethanol absolute VWR Chemicals 101074F
Iron (III) chloride hexahydrate Sigma Aldrich 236489
L-Aspartic acid Sigma Aldrich A9256
L-Glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L-Alanine Sigma Aldrich A7627
L-Arginine Sigma Aldrich A5006
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
L-Glutamine Sigma Aldrich G3126
Glycine Sigma Aldrich G7126
L-Histidine Sigma Aldrich H8000
L-Isoleucine Sigma Aldrich I2752
L-Leucine Sigma Aldrich L8000
L-Lysine Sigma Aldrich L5501
L-Methionine Sigma Aldrich M9625
L-Phenylalanine Sigma Aldrich P2126
L-Proline Sigma Aldrich P0380
L-Serine Sigma Aldrich S4500
L-Threonine Sigma Aldrich T8625
L-Tryptophane Sigma Aldrich T0254
L-Tyrosine Sigma Aldrich T3754
L-Valine Sigma Aldrich V0500
13C5-L-Valine Eurisotop CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine Eurisotop CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride Eurisotop NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine Eurisotop NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine Eurisotop NLM-396-PK
Ethyl acetate Sigma Aldrich 270989
Ethyl propanoate Sigma Aldrich 112305
Ethyl 2-methylpropanoate Sigma Aldrich 246085
Ethyl butanoate Sigma Aldrich E15701
Ethyl 2-methylbutanoate Sigma Aldrich 306886
Ethyl 3-methylbutanoate Sigma Aldrich 8.08541.0250
Ethyl hexanoate Sigma Aldrich 148962
Ethyl octanoate Sigma Aldrich W244910
Ethyl decanoate Sigma Aldrich W243205
Ethyl dodecanoate Sigma Aldrich W244112
Ethyl lactate Sigma Aldrich W244015
Diethyl succinate Sigma Aldrich W237701
2-methylpropyl acetate Sigma Aldrich W217514
2-methylbutyl acetate Sigma Aldrich W364401
3-methyl butyl acetate Sigma Aldrich 287725
2-phenylethyl acetate Sigma Aldrich 290580
2-methylpropanol Sigma Aldrich 294829
2-methylbutanol Sigma Aldrich 133051
3-methylbutanol Sigma Aldrich 309435
Hexanol Sigma Aldrich 128570
2-phenylethanol Sigma Aldrich 77861
Propanoic acid Sigma Aldrich 94425
Butanoic acid Sigma Aldrich 19215
2-methylpropanoic acid Sigma Aldrich 58360
2-methylbutanoic acid Sigma Aldrich 193070
3-methylbutanoic acid Sigma Aldrich W310212
Hexanoic acid Sigma Aldrich 153745
Octanoic acid Sigma Aldrich W279900
Decanoic acid Sigma Aldrich W236403
Dodecanoic acid Sigma Aldrich L556
Fermentor 1L Legallais AT1357 Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system Dominique Deutscher 029311
Fermenters (250 ml) Legallais AT1352 Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes Sarstedt 62.554.502
Fermentation locks Legallais AT1356 Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract Becton, Dickinson and Company 212750
BactoPeptone Becton, Dickinson and Company 211677
Incubator shaker Infors HT
Particle Counter Beckman Coulter 6605697 Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge Jouan GR412
Plate Butler Robotic system Lab Services BV PF0X-MA Automatic instrument
Plate Butler Software Lab Services BV Robot monitor software
RobView In-house developed calculation software
My SQL International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers Thermo Fisher Scientific 50088009 String Drive 60
BenchBlotter platform rocker Dutscher 60903
Ammonia enzymatic kit R-Biopharm AG 5390
Spectrophotometer cuvettes VWR 634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400 Secomam
Amino acids standards physiological – acidics and neutrals Sigma Aldrich A6407
Amino acids standards physiological – basics Sigma Aldrich A6282
Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent Biochrom BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid Sigma Aldrich S2130
Norleucine Sigma Aldrich N1398
Biochrom 30 AAA Biochrom
EZChrom Elite Biochrom Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium Biochrom BC80-6002-47 Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV Merck Millipore SLGVX13NL Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL VWR 514-4157 Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini Millipore XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm VWR 611-1380
Precision balance Mettler Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried Merck 1029310161 (max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven Legallais
Pierce BCA protein assay kit Interchim UP40840A
Formic acid Fluka 94318
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure Merck 1003171000 Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer Biochrom 80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids Sigma Aldrich AAS18
L-Methionine sulfone Sigma Aldrich M0876
L-Cysteic acid monohydrate Sigma Aldrich 30170
Pyrex glass culture tubes Sigma Aldrich Z653586
Pyridine Acros Organics 131780500 99% Extrapure
Ethyl chloroformate Sigma Aldrich 23131
Dichloromethane Sigma Aldrich 32222
Vials Sigma Aldrich 854165
Microinserts for 1.5ml vials Sigma Aldrich SU860066
GC/MS Agilent Technologies 5890 GC/5973 MS
Chemstation Agilent Technologies Instrument control and data analysis software
Methanol Sigma Aldrich 34860 Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998 ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal Sigma Aldrich 394963
BSTFA Sigma Aldrich 33024
DB-17MS column Agilent Technologies 122-4731 30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous Sigma Aldrich 238597
Technical nitrogen Air products 14629
Zebron ZB-WAX column Phenomenex 7HG-G007-11 30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP Air products 26699
Glass Pasteur pipettes VWR 612-1702

References

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Cite This Article
Bloem, A., Rollero, S., Seguinot, P., Crépin, L., Perez, M., Picou, C., Camarasa, C. Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources. J. Vis. Exp. (131), e56393, doi:10.3791/56393 (2018).

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