Summary

Процесс, основанный на сочетании изотопный Tracer экспериментов расследовать микробного метаболизма множественные источники питательных веществ

Published: January 22, 2018
doi:

Summary

Этот протокол описывает экспериментальная процедура количественно и всесторонне расследовать метаболизм нескольких источников питательных веществ. Этот рабочий процесс, основываясь на комбинации изотопный трассирующими экспериментов и аналитические процедуры, позволяет судьба потребленных питательных веществ и метаболизма происхождение молекул синтезированный микроорганизмами, которые будут определены.

Abstract

Исследования в области микробиологии полагаться на осуществление широкого круга методологий. В частности разработки надлежащих методов существенно способствует обеспечению обширные знания метаболизма микроорганизмов, растущих в химически определенных носителей, содержащих уникальные азота и углерода источников. В отличие от управления через метаболизм нескольких источников питательных веществ, несмотря на их широкое присутствие в природных и промышленных средах, остается практически неисследованной. Эта ситуация объясняется главным образом отсутствием подходящих методологий, который препятствует расследований.

Мы приводим экспериментальная стратегия количественно и всесторонне исследовать, как метаболизм работает когда питательных предоставляется как смесь различных молекул, т.е., комплекс ресурс. Здесь мы описываем его применения для оценки разделение нескольких источников азота через сеть метаболических дрожжей. Рабочий процесс сочетает в себе информацию, полученную во время экспериментов трассирующими стабильный изотоп с помощью выбранных 13C – или 15N-меченых субстратов. Первый состоит из параллельных и воспроизводимые брожения в той же среде, которая включает в себя смесь N-содержащих молекул; Однако источник выбранного азота помечается каждый раз. Сочетание аналитических процедур (ВЭЖХ, GC-MS) осуществляется для оценки маркировки образцы целевых соединений и количественной оценки потребления и восстановления субстратов в других метаболитов. Комплексный анализ полного набора данных обзор о судьбе потребляемых субстратов внутри клетки. Этот подход требует точной протокол для сбора образцов – способствует робот помощь система онлайн мониторинга брожения – и достижения многочисленных времени анализа. Несмотря на эти ограничения она позволила, понимание, в первый раз, перегородки из нескольких источников азота во всей сети метаболических дрожжей. Мы прояснили перераспределение азота из более обильные источники к другим N-соединений и определяется метаболических происхождение летучих молекул и proteinogenic аминокислоты.

Introduction

Понимание как работает микробного метаболизма является ключевым вопросом для разработки эффективных стратегий для улучшения процессов ферментации и модулировать производства бродильных соединений. Достижения в области геномики и функциональной геномики в эти последние два десятилетия в значительной мере способствовали расширение знаний о топологии метаболических сетей в многих микроорганизмов. Доступ к этой информации привело к разработке подходов, которые направлены на всесторонний обзор сотовой функция1. Эти методологии часто полагаются на основе модели интерпретации измеримых параметров. Эти экспериментальные данные включают, с одной стороны, показатели поглощения и производства метаболит, и, с другой стороны, количественные внутриклеточных информация, которая получена из изотопа трассирующими экспериментов. Эти данные обеспечивают необходимую информацию для вычета в vivo активности различных путей в определенных метаболических сети2,3,4. В настоящее время имеющиеся аналитические методы только включить точное обнаружение маркировки модели молекул при использовании изотопов одного элемента и, возможно, когда совместно маркировки с двух изотопов элементов. Кроме того в большинстве условий роста, источника углерода состоит только из одного или двух соединений. Следовательно подходы, основанные на 13C-изотопные трассеры от углеродных подложках были широко и успешно применяется для полного понимания углерода метаболических сетевых операций5,6,7 ,8.

Напротив во многих природных и промышленных средах, азота ресурс, который поддерживает рост микроорганизмов часто состоит из широкого спектра молекул. Например во время брожения вино или пиво, азота предоставляется как смесь 18 аминокислот и аммония в переменной концентрации9. Этот массив N соединений, которые являются доступными для анаболизма делает эти сложные СМИ условия отличаются от тех, которые обычно используются для физиологических исследований, как последний достигаются с помощью уникальный источник азота, обычно аммония.

В целом внутреннюю азотных соединений могут быть непосредственно включены в белки или голодании. Структура сети метаболизма азота у многих микроорганизмов, в том числе дрожжей Saccharomyces cerevisiae, является весьма сложной, в соответствии с разнообразием субстратов. Схематично эта система основана на сочетании центральное ядро метаболизма азота, который катализирует взаимное преобразование глутамина, глутамата и альфа-кетоглутарата10,11, трансаминазы и деаминазами. Через эту сеть аминов группы аммония или другие аминокислоты собираются и α-кето кислоты выпущено. Эти промежуточные также являются синтезированный через Центральный углерода метаболизм (СКК)12,13. Это большое количество разветвленных реакций и посредников, участвующих в катаболизм источников внешних азота и анаболизм proteinogenic аминокислоты, выполняет анаболические требования клеток. Деятельность через эти различных взаимосвязанных маршрутов также приводит к выведению метаболитов. В частности α-кето кислоты могут перенаправляться через Эрлих путь для получения высших спиртов и их ацетата эфира производные14, которые являются важным вклад сенсорные профилей продукции. Впоследствии как работает метаболизма азота играет ключевую роль в производство биомассы и формирования летучих молекул (арома).

Реакции, ферменты и генов, участвующих в метаболизме азота подробно описаны в литературе. Однако еще не рассматривался вопрос о распределении нескольких источников азота в метаболических сети. Есть две основные причины, которые объясняют это отсутствием информации. Во-первых, с учетом важных сложности сети метаболизм азота, большое количество количественных данных не требуется для полного понимания его работы, которая была недоступна до сих пор. Во-вторых, многие экспериментальные ограничения и ограничения аналитических методов помешало реализации подходов, которые ранее использовались для уточнения функции СКК.

Чтобы преодолеть эти проблемы, мы решили разработать системного уровня подход, основанный на сверки данных из серии экспериментов изотопный трассирующими. Процесс включает в себя:
-Набор брожения осуществляется на тех же условиях окружающей среды, в то время как другой источник отдельных питательных веществ (субстрата) помечается каждый раз.
-Сочетание аналитических процедур (ВЭЖХ, GC-MS) для точного определения, на разных стадиях ферментации, остаточная концентрация помечены субстрата и концентрации и изотопного обогащения соединений, которые являются производными от катаболизм помечены молекулы, включая производные биомассы.
-Расчет массы и изотопного равновесия для каждого потребляется помечены молекулы и дальнейшего комплексного анализа набора данных, чтобы получить глобальный обзор управления источниками питательных веществ, микроорганизмов через определение соотношения потока .

Чтобы применить эту методологию, внимание должно уделяться воспроизводимое поведение штамм/микроорганизма между культурами. Кроме того образцы из различных культур должны приниматься в ходе же четко ферментации. В экспериментальной работе в этой рукописи робот помощь система используется для онлайн мониторинг брожения для учета этих ограничений.

Кроме того важно выбрать набор помечены субстратов (соединение, характер и положение маркировки), подходит для решения проблемы научного исследования. Здесь 15N-меченых аммония, глютамин и аргинина были выбраны в качестве трех основных азота источников в виноградный сок. Это позволило оценить шаблон перераспределение азота из потребляемых соединений для proteinogenic аминокислоты. Мы также стремились исследовать судьбу углерода костяк потребляемых аминокислот и их вклада в производство неустойчивых молекул. Для удовлетворения этой цели, равномерно 13C-меченых лейцина, треонин, изолейцин и валин были включены в исследование как аминокислоты, которые являются производными от основных промежуточных Эрлих пути.

В целом мы количественно исследовать, как дрожжи управляет ресурсом комплекс азота перераспределяя источники экзогенной азота выполнить его анаболических требования по всей брожения Кроме того удаляя избыток углерода прекурсоров как летучие молекулы. Экспериментальная процедура, сообщается в настоящем документе может применяться для расследования других множественные источники питательных веществ, используемые другими микроорганизма. Она, как представляется, соответствующий подход для анализа влияния генетический фон или экологических условий на метаболические поведении микроорганизмов.

Protocol

1. ферментации и выборки Подготовка средств массовой информации и ферментеровПримечание: Все брожения являются осуществляются параллельно, используя же нагрузку и в то же химически определены синтетической среде (SM, композиция, приводятся в таблице 1), котора?…

Representative Results

На рисунке 3 представлена схема рабочего процесса, который был реализован для расследования Управление дрожжей несколько источников азота, которые находятся в процессе брожения вина.Для различных точек выборки, характеристики биологических параме…

Discussion

Количественная оценка разбиения соединений через метаболических сетей с использованием изотопных трассирующими экспериментов является перспективным подходом для понимания функционирования микробного метаболизма. Эта методология, в то время как успешно применяется с одним или дву?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Jean-Roch Mouret, Сильви Dequin и Жан-Мари Sabalyrolles для содействия концепции системы роботов с помощью ферментации и Martine бокс, Николя Бувье и Паскаль Brial за их техническую поддержку. Финансирование этого проекта была предоставлена министерство образование и окружение де Nationale de la Recherche et de la Technologie.

Materials

D-Glucose PanReac 141341.0416
D-Fructose PanReac 142728.0416
DL-Malic acid Sigma Aldrich M0875
Citric acid monohydrate Sigma Aldrich C7129
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P5379
Potassium sulfate Sigma Aldrich P0772
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma Aldrich 230391
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C7902
Sodium chloride Sigma Aldrich S9625
Ammonium chloride Sigma Aldrich A4514
Sodium hydroxide Sigma Aldrich 71690
Manganese sulfate monohydrate Sigma Aldrich M7634
Zinc sulfate heptahydrate Sigma Aldrich Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate Sigma Aldrich C7631
Potassium iodine Sigma Aldrich P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate Sigma Aldrich C3169
Boric acid Sigma Aldrich B7660
Ammonium heptamolybdate Sigma Aldrich A7302
Myo-inositol Sigma Aldrich I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma Aldrich 21210
Thiamine, hydrochloride Sigma Aldrich T4625
Nicotinic acid Sigma Aldrich N4126
Pyridoxine Sigma Aldrich P5669
Biotine Sigma Aldrich B4501
Ergostérol Sigma Aldrich E6510
Tween 80 Sigma Aldrich P1754
Ethanol absolute VWR Chemicals 101074F
Iron (III) chloride hexahydrate Sigma Aldrich 236489
L-Aspartic acid Sigma Aldrich A9256
L-Glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L-Alanine Sigma Aldrich A7627
L-Arginine Sigma Aldrich A5006
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
L-Glutamine Sigma Aldrich G3126
Glycine Sigma Aldrich G7126
L-Histidine Sigma Aldrich H8000
L-Isoleucine Sigma Aldrich I2752
L-Leucine Sigma Aldrich L8000
L-Lysine Sigma Aldrich L5501
L-Methionine Sigma Aldrich M9625
L-Phenylalanine Sigma Aldrich P2126
L-Proline Sigma Aldrich P0380
L-Serine Sigma Aldrich S4500
L-Threonine Sigma Aldrich T8625
L-Tryptophane Sigma Aldrich T0254
L-Tyrosine Sigma Aldrich T3754
L-Valine Sigma Aldrich V0500
13C5-L-Valine Eurisotop CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine Eurisotop CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride Eurisotop NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine Eurisotop NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine Eurisotop NLM-396-PK
Ethyl acetate Sigma Aldrich 270989
Ethyl propanoate Sigma Aldrich 112305
Ethyl 2-methylpropanoate Sigma Aldrich 246085
Ethyl butanoate Sigma Aldrich E15701
Ethyl 2-methylbutanoate Sigma Aldrich 306886
Ethyl 3-methylbutanoate Sigma Aldrich 8.08541.0250
Ethyl hexanoate Sigma Aldrich 148962
Ethyl octanoate Sigma Aldrich W244910
Ethyl decanoate Sigma Aldrich W243205
Ethyl dodecanoate Sigma Aldrich W244112
Ethyl lactate Sigma Aldrich W244015
Diethyl succinate Sigma Aldrich W237701
2-methylpropyl acetate Sigma Aldrich W217514
2-methylbutyl acetate Sigma Aldrich W364401
3-methyl butyl acetate Sigma Aldrich 287725
2-phenylethyl acetate Sigma Aldrich 290580
2-methylpropanol Sigma Aldrich 294829
2-methylbutanol Sigma Aldrich 133051
3-methylbutanol Sigma Aldrich 309435
Hexanol Sigma Aldrich 128570
2-phenylethanol Sigma Aldrich 77861
Propanoic acid Sigma Aldrich 94425
Butanoic acid Sigma Aldrich 19215
2-methylpropanoic acid Sigma Aldrich 58360
2-methylbutanoic acid Sigma Aldrich 193070
3-methylbutanoic acid Sigma Aldrich W310212
Hexanoic acid Sigma Aldrich 153745
Octanoic acid Sigma Aldrich W279900
Decanoic acid Sigma Aldrich W236403
Dodecanoic acid Sigma Aldrich L556
Fermentor 1L Legallais AT1357 Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system Dominique Deutscher 029311
Fermenters (250 ml) Legallais AT1352 Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes Sarstedt 62.554.502
Fermentation locks Legallais AT1356 Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract Becton, Dickinson and Company 212750
BactoPeptone Becton, Dickinson and Company 211677
Incubator shaker Infors HT
Particle Counter Beckman Coulter 6605697 Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge Jouan GR412
Plate Butler Robotic system Lab Services BV PF0X-MA Automatic instrument
Plate Butler Software Lab Services BV Robot monitor software
RobView In-house developed calculation software
My SQL International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers Thermo Fisher Scientific 50088009 String Drive 60
BenchBlotter platform rocker Dutscher 60903
Ammonia enzymatic kit R-Biopharm AG 5390
Spectrophotometer cuvettes VWR 634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400 Secomam
Amino acids standards physiological – acidics and neutrals Sigma Aldrich A6407
Amino acids standards physiological – basics Sigma Aldrich A6282
Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent Biochrom BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid Sigma Aldrich S2130
Norleucine Sigma Aldrich N1398
Biochrom 30 AAA Biochrom
EZChrom Elite Biochrom Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium Biochrom BC80-6002-47 Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV Merck Millipore SLGVX13NL Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL VWR 514-4157 Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini Millipore XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm VWR 611-1380
Precision balance Mettler Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried Merck 1029310161 (max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven Legallais
Pierce BCA protein assay kit Interchim UP40840A
Formic acid Fluka 94318
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure Merck 1003171000 Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer Biochrom 80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids Sigma Aldrich AAS18
L-Methionine sulfone Sigma Aldrich M0876
L-Cysteic acid monohydrate Sigma Aldrich 30170
Pyrex glass culture tubes Sigma Aldrich Z653586
Pyridine Acros Organics 131780500 99% Extrapure
Ethyl chloroformate Sigma Aldrich 23131
Dichloromethane Sigma Aldrich 32222
Vials Sigma Aldrich 854165
Microinserts for 1.5ml vials Sigma Aldrich SU860066
GC/MS Agilent Technologies 5890 GC/5973 MS
Chemstation Agilent Technologies Instrument control and data analysis software
Methanol Sigma Aldrich 34860 Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998 ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal Sigma Aldrich 394963
BSTFA Sigma Aldrich 33024
DB-17MS column Agilent Technologies 122-4731 30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous Sigma Aldrich 238597
Technical nitrogen Air products 14629
Zebron ZB-WAX column Phenomenex 7HG-G007-11 30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP Air products 26699
Glass Pasteur pipettes VWR 612-1702

References

  1. Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts. Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).
  2. Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression. J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).
  3. Wiechert, W. 13C metabolic flux analysis. Metab Eng. 3, 195-206 (2001).
  4. Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints. Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).
  5. Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments. BMC Bioinformatics. 9, 266 (2008).
  6. Zamboni, N. 13C metabolic flux analysis in complex systems. Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).
  7. Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis. Biochimie. 91, 697-702 (2009).
  8. Quek, L. -. E., Dietmair, S., Krömer, J. O., Nielsen, L. K. Metabolic flux analysis in mammalian cell culture. Metab Eng. 12, 161-171 (2010).
  9. Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value. J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).
  10. Magasanik, B., Kaiser, C. A. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 290, 1-18 (2002).
  11. Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190, 885-929 (2012).
  12. Cooper, T. G., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 39-99 (1982).
  13. Jones, E. W., Fink, G. R., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 182-299 (1982).
  14. Hazelwood, L. A., Daran, J. -. M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism. Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).
  15. Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions. J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).
  16. Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network. Genome Res. 13, 244-253 (2003).
  17. Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments. Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).

Play Video

Cite This Article
Bloem, A., Rollero, S., Seguinot, P., Crépin, L., Perez, M., Picou, C., Camarasa, C. Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources. J. Vis. Exp. (131), e56393, doi:10.3791/56393 (2018).

View Video