Процесс, основанный на сочетании изотопный Tracer экспериментов расследовать микробного метаболизма множественные источники питательных веществ
Summary
Этот протокол описывает экспериментальная процедура количественно и всесторонне расследовать метаболизм нескольких источников питательных веществ. Этот рабочий процесс, основываясь на комбинации изотопный трассирующими экспериментов и аналитические процедуры, позволяет судьба потребленных питательных веществ и метаболизма происхождение молекул синтезированный микроорганизмами, которые будут определены.
Abstract
Исследования в области микробиологии полагаться на осуществление широкого круга методологий. В частности разработки надлежащих методов существенно способствует обеспечению обширные знания метаболизма микроорганизмов, растущих в химически определенных носителей, содержащих уникальные азота и углерода источников. В отличие от управления через метаболизм нескольких источников питательных веществ, несмотря на их широкое присутствие в природных и промышленных средах, остается практически неисследованной. Эта ситуация объясняется главным образом отсутствием подходящих методологий, который препятствует расследований.
Мы приводим экспериментальная стратегия количественно и всесторонне исследовать, как метаболизм работает когда питательных предоставляется как смесь различных молекул, т.е., комплекс ресурс. Здесь мы описываем его применения для оценки разделение нескольких источников азота через сеть метаболических дрожжей. Рабочий процесс сочетает в себе информацию, полученную во время экспериментов трассирующими стабильный изотоп с помощью выбранных 13C – или 15N-меченых субстратов. Первый состоит из параллельных и воспроизводимые брожения в той же среде, которая включает в себя смесь N-содержащих молекул; Однако источник выбранного азота помечается каждый раз. Сочетание аналитических процедур (ВЭЖХ, GC-MS) осуществляется для оценки маркировки образцы целевых соединений и количественной оценки потребления и восстановления субстратов в других метаболитов. Комплексный анализ полного набора данных обзор о судьбе потребляемых субстратов внутри клетки. Этот подход требует точной протокол для сбора образцов – способствует робот помощь система онлайн мониторинга брожения – и достижения многочисленных времени анализа. Несмотря на эти ограничения она позволила, понимание, в первый раз, перегородки из нескольких источников азота во всей сети метаболических дрожжей. Мы прояснили перераспределение азота из более обильные источники к другим N-соединений и определяется метаболических происхождение летучих молекул и proteinogenic аминокислоты.
Introduction
Понимание как работает микробного метаболизма является ключевым вопросом для разработки эффективных стратегий для улучшения процессов ферментации и модулировать производства бродильных соединений. Достижения в области геномики и функциональной геномики в эти последние два десятилетия в значительной мере способствовали расширение знаний о топологии метаболических сетей в многих микроорганизмов. Доступ к этой информации привело к разработке подходов, которые направлены на всесторонний обзор сотовой функция1. Эти методологии часто полагаются на основе модели интерпретации измеримых параметров. Эти экспериментальные данные включают, с одной стороны, показатели поглощения и производства метаболит, и, с другой стороны, количественные внутриклеточных информация, которая получена из изотопа трассирующими экспериментов. Эти данные обеспечивают необходимую информацию для вычета в vivo активности различных путей в определенных метаболических сети2,3,4. В настоящее время имеющиеся аналитические методы только включить точное обнаружение маркировки модели молекул при использовании изотопов одного элемента и, возможно, когда совместно маркировки с двух изотопов элементов. Кроме того в большинстве условий роста, источника углерода состоит только из одного или двух соединений. Следовательно подходы, основанные на 13C-изотопные трассеры от углеродных подложках были широко и успешно применяется для полного понимания углерода метаболических сетевых операций5,6,7 ,8.
Напротив во многих природных и промышленных средах, азота ресурс, который поддерживает рост микроорганизмов часто состоит из широкого спектра молекул. Например во время брожения вино или пиво, азота предоставляется как смесь 18 аминокислот и аммония в переменной концентрации9. Этот массив N соединений, которые являются доступными для анаболизма делает эти сложные СМИ условия отличаются от тех, которые обычно используются для физиологических исследований, как последний достигаются с помощью уникальный источник азота, обычно аммония.
В целом внутреннюю азотных соединений могут быть непосредственно включены в белки или голодании. Структура сети метаболизма азота у многих микроорганизмов, в том числе дрожжей Saccharomyces cerevisiae, является весьма сложной, в соответствии с разнообразием субстратов. Схематично эта система основана на сочетании центральное ядро метаболизма азота, который катализирует взаимное преобразование глутамина, глутамата и альфа-кетоглутарата10,11, трансаминазы и деаминазами. Через эту сеть аминов группы аммония или другие аминокислоты собираются и α-кето кислоты выпущено. Эти промежуточные также являются синтезированный через Центральный углерода метаболизм (СКК)12,13. Это большое количество разветвленных реакций и посредников, участвующих в катаболизм источников внешних азота и анаболизм proteinogenic аминокислоты, выполняет анаболические требования клеток. Деятельность через эти различных взаимосвязанных маршрутов также приводит к выведению метаболитов. В частности α-кето кислоты могут перенаправляться через Эрлих путь для получения высших спиртов и их ацетата эфира производные14, которые являются важным вклад сенсорные профилей продукции. Впоследствии как работает метаболизма азота играет ключевую роль в производство биомассы и формирования летучих молекул (арома).
Реакции, ферменты и генов, участвующих в метаболизме азота подробно описаны в литературе. Однако еще не рассматривался вопрос о распределении нескольких источников азота в метаболических сети. Есть две основные причины, которые объясняют это отсутствием информации. Во-первых, с учетом важных сложности сети метаболизм азота, большое количество количественных данных не требуется для полного понимания его работы, которая была недоступна до сих пор. Во-вторых, многие экспериментальные ограничения и ограничения аналитических методов помешало реализации подходов, которые ранее использовались для уточнения функции СКК.
Чтобы преодолеть эти проблемы, мы решили разработать системного уровня подход, основанный на сверки данных из серии экспериментов изотопный трассирующими. Процесс включает в себя:
-Набор брожения осуществляется на тех же условиях окружающей среды, в то время как другой источник отдельных питательных веществ (субстрата) помечается каждый раз.
-Сочетание аналитических процедур (ВЭЖХ, GC-MS) для точного определения, на разных стадиях ферментации, остаточная концентрация помечены субстрата и концентрации и изотопного обогащения соединений, которые являются производными от катаболизм помечены молекулы, включая производные биомассы.
-Расчет массы и изотопного равновесия для каждого потребляется помечены молекулы и дальнейшего комплексного анализа набора данных, чтобы получить глобальный обзор управления источниками питательных веществ, микроорганизмов через определение соотношения потока .
Чтобы применить эту методологию, внимание должно уделяться воспроизводимое поведение штамм/микроорганизма между культурами. Кроме того образцы из различных культур должны приниматься в ходе же четко ферментации. В экспериментальной работе в этой рукописи робот помощь система используется для онлайн мониторинг брожения для учета этих ограничений.
Кроме того важно выбрать набор помечены субстратов (соединение, характер и положение маркировки), подходит для решения проблемы научного исследования. Здесь 15N-меченых аммония, глютамин и аргинина были выбраны в качестве трех основных азота источников в виноградный сок. Это позволило оценить шаблон перераспределение азота из потребляемых соединений для proteinogenic аминокислоты. Мы также стремились исследовать судьбу углерода костяк потребляемых аминокислот и их вклада в производство неустойчивых молекул. Для удовлетворения этой цели, равномерно 13C-меченых лейцина, треонин, изолейцин и валин были включены в исследование как аминокислоты, которые являются производными от основных промежуточных Эрлих пути.
В целом мы количественно исследовать, как дрожжи управляет ресурсом комплекс азота перераспределяя источники экзогенной азота выполнить его анаболических требования по всей брожения Кроме того удаляя избыток углерода прекурсоров как летучие молекулы. Экспериментальная процедура, сообщается в настоящем документе может применяться для расследования других множественные источники питательных веществ, используемые другими микроорганизма. Она, как представляется, соответствующий подход для анализа влияния генетический фон или экологических условий на метаболические поведении микроорганизмов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Количественная оценка разбиения соединений через метаболических сетей с использованием изотопных трассирующими экспериментов является перспективным подходом для понимания функционирования микробного метаболизма. Эта методология, в то время как успешно применяется с одним или дву?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Jean-Roch Mouret, Сильви Dequin и Жан-Мари Sabalyrolles для содействия концепции системы роботов с помощью ферментации и Martine бокс, Николя Бувье и Паскаль Brial за их техническую поддержку. Финансирование этого проекта была предоставлена министерство образование и окружение де Nationale de la Recherche et de la Technologie.
Materials
| D-Glucose | PanReac | 141341.0416 | |
| D-Fructose | PanReac | 142728.0416 | |
| DL-Malic acid | Sigma Aldrich | M0875 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma Aldrich | C7129 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| Potassium sulfate | Sigma Aldrich | P0772 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 230391 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A4514 | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 71690 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z4750 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | C7631 | |
| Potassium iodine | Sigma Aldrich | P4286 | |
| Cobalt (II) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | C3169 | |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B7660 | |
| Ammonium heptamolybdate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Myo-inositol | Sigma Aldrich | I5125 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma Aldrich | 21210 | |
| Thiamine, hydrochloride | Sigma Aldrich | T4625 | |
| Nicotinic acid | Sigma Aldrich | N4126 | |
| Pyridoxine | Sigma Aldrich | P5669 | |
| Biotine | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Ergostérol | Sigma Aldrich | E6510 | |
| Tween 80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 101074F | |
| Iron (III) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489 | |
| L-Aspartic acid | Sigma Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L-Alanine | Sigma Aldrich | A7627 | |
| L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G7126 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H8000 | |
| L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| L-Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | |
| L-Methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
| L-Phenylalanine | Sigma Aldrich | P2126 | |
| L-Proline | Sigma Aldrich | P0380 | |
| L-Serine | Sigma Aldrich | S4500 | |
| L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tryptophane | Sigma Aldrich | T0254 | |
| L-Tyrosine | Sigma Aldrich | T3754 | |
| L-Valine | Sigma Aldrich | V0500 | |
| 13C5-L-Valine | Eurisotop | CLM-2249-H-0.25 | |
| 13C6-L-Leucine | Eurisotop | CLM-2262-H-0.25 | |
| 15N-Ammonium chloride | Eurisotop | NLM-467-1 | |
| ALPHA-15N-L-Glutamine | Eurisotop | NLM-1016-1 | |
| U-15N4-L-Arginine | Eurisotop | NLM-396-PK | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 270989 | |
| Ethyl propanoate | Sigma Aldrich | 112305 | |
| Ethyl 2-methylpropanoate | Sigma Aldrich | 246085 | |
| Ethyl butanoate | Sigma Aldrich | E15701 | |
| Ethyl 2-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 306886 | |
| Ethyl 3-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 8.08541.0250 | |
| Ethyl hexanoate | Sigma Aldrich | 148962 | |
| Ethyl octanoate | Sigma Aldrich | W244910 | |
| Ethyl decanoate | Sigma Aldrich | W243205 | |
| Ethyl dodecanoate | Sigma Aldrich | W244112 | |
| Ethyl lactate | Sigma Aldrich | W244015 | |
| Diethyl succinate | Sigma Aldrich | W237701 | |
| 2-methylpropyl acetate | Sigma Aldrich | W217514 | |
| 2-methylbutyl acetate | Sigma Aldrich | W364401 | |
| 3-methyl butyl acetate | Sigma Aldrich | 287725 | |
| 2-phenylethyl acetate | Sigma Aldrich | 290580 | |
| 2-methylpropanol | Sigma Aldrich | 294829 | |
| 2-methylbutanol | Sigma Aldrich | 133051 | |
| 3-methylbutanol | Sigma Aldrich | 309435 | |
| Hexanol | Sigma Aldrich | 128570 | |
| 2-phenylethanol | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Propanoic acid | Sigma Aldrich | 94425 | |
| Butanoic acid | Sigma Aldrich | 19215 | |
| 2-methylpropanoic acid | Sigma Aldrich | 58360 | |
| 2-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | 193070 | |
| 3-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | W310212 | |
| Hexanoic acid | Sigma Aldrich | 153745 | |
| Octanoic acid | Sigma Aldrich | W279900 | |
| Decanoic acid | Sigma Aldrich | W236403 | |
| Dodecanoic acid | Sigma Aldrich | L556 | |
| Fermentor 1L | Legallais | AT1357 | Fermenter handmade for fermentation |
| Disposable vacuum filtration system | Dominique Deutscher | 029311 | |
| Fermenters (250 ml) | Legallais | AT1352 | Fermenter handmade for fermentation |
| Sterile tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Fermentation locks | Legallais | AT1356 | Fermetation locks handmade for fermentation |
| BactoYeast Extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | |
| BactoPeptone | Becton, Dickinson and Company | 211677 | |
| Incubator shaker | Infors HT | ||
| Particle Counter | Beckman Coulter | 6605697 | Multisizer 3 Coulter Counter |
| Centrifuge | Jouan | GR412 | |
| Plate Butler Robotic system | Lab Services BV | PF0X-MA | Automatic instrument |
| Plate Butler Software | Lab Services BV | Robot monitor software | |
| RobView | In-house developed calculation software | ||
| My SQL | International source database | ||
| Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers | Thermo Fisher Scientific | 50088009 | String Drive 60 |
| BenchBlotter platform rocker | Dutscher | 60903 | |
| Ammonia enzymatic kit | R-Biopharm AG | 5390 | |
| Spectrophotometer cuvettes | VWR | 634-0678 | |
| Spectrophotometer UviLine 9400 | Secomam | ||
| Amino acids standards physiological – acidics and neutrals | Sigma Aldrich | A6407 | |
| Amino acids standards physiological – basics | Sigma Aldrich | A6282 | |
| Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent | Biochrom | BC80-6000-06 | |
| Sulfosalycilic acid | Sigma Aldrich | S2130 | |
| Norleucine | Sigma Aldrich | N1398 | |
| Biochrom 30 AAA | Biochrom | ||
| EZChrom Elite | Biochrom | Instrument control and Data analysis software | |
| Ultropac 8 resin Lithium | Biochrom | BC80-6002-47 | Lithium High Resolution Physiological Column |
| Filter Millex GV | Merck Millipore | SLGVX13NL | Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm) |
| Membrane filter PALL | VWR | 514-4157 | Supor-450 47mm 0.45µm |
| Vacuum pump Millivac Mini | Millipore | XF5423050 | |
| Aluminium smooth weigh dish 70mm | VWR | 611-1380 | |
| Precision balance | Mettler | Specifications AE163 | |
| Dimethyl sulfoxid dried | Merck | 1029310161 | (max. 0.025% H2O) SeccoSolv |
| Combustion oven | Legallais | ||
| Pierce BCA protein assay kit | Interchim | UP40840A | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure | Merck | 1003171000 | Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Lithium acetate buffer | Biochrom | 80-2038-10 | |
| Commercial solution of hydrolyzed amino acids | Sigma Aldrich | AAS18 | |
| L-Methionine sulfone | Sigma Aldrich | M0876 | |
| L-Cysteic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 30170 | |
| Pyrex glass culture tubes | Sigma Aldrich | Z653586 | |
| Pyridine | Acros Organics | 131780500 | 99% Extrapure |
| Ethyl chloroformate | Sigma Aldrich | 23131 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 32222 | |
| Vials | Sigma Aldrich | 854165 | |
| Microinserts for 1.5ml vials | Sigma Aldrich | SU860066 | |
| GC/MS | Agilent Technologies | 5890 GC/5973 MS | |
| Chemstation | Agilent Technologies | Instrument control and data analysis software | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Chromasolv, for HPLC |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | ChromasolvPlus, for HPLC |
| N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal | Sigma Aldrich | 394963 | |
| BSTFA | Sigma Aldrich | 33024 | |
| DB-17MS column | Agilent Technologies | 122-4731 | 30m*0.25mm*0.15µm |
| Sodium sulfate, anhydrous | Sigma Aldrich | 238597 | |
| Technical nitrogen | Air products | 14629 | |
| Zebron ZB-WAX column | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m*0.25mm*0.25µm |
| Helium BIP | Air products | 26699 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1702 |
References
- Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts. Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).
- Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression. J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).
- Wiechert, W. 13C metabolic flux analysis. Metab Eng. 3, 195-206 (2001).
- Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints. Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).
- Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments. BMC Bioinformatics. 9, 266 (2008).
- Zamboni, N. 13C metabolic flux analysis in complex systems. Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).
- Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis. Biochimie. 91, 697-702 (2009).
- Quek, L. -. E., Dietmair, S., Krömer, J. O., Nielsen, L. K. Metabolic flux analysis in mammalian cell culture. Metab Eng. 12, 161-171 (2010).
- Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value. J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).
- Magasanik, B., Kaiser, C. A. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 290, 1-18 (2002).
- Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190, 885-929 (2012).
- Cooper, T. G., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 39-99 (1982).
- Jones, E. W., Fink, G. R., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 182-299 (1982).
- Hazelwood, L. A., Daran, J. -. M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism. Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).
- Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions. J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).
- Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network. Genome Res. 13, 244-253 (2003).
- Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments. Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).
