Summary
提出了一种新的细菌表面快速抗原显示技术, 它涉及表面法, 其次是暴露于与单体素融合的感兴趣的蛋白质。用选定抗原载入卡介苗, 成功地提高了其免疫原性, 表明表面修饰可以取代传统的遗传方法。
Abstract
肺结核 (tb) 是一种严重的传染性疾病, 唯一可用的疫苗是牛牛卡介苗 Guérin (BCG) 是安全和有效的保护儿童的严重结核脑膜炎和某些形式的传播结核, 但未能保护肺结核, 这是最普遍的疾病形式。有前途的战略, 以改善 BCG 目前依赖于其转化的基因编码免疫m 结核)特异抗原和/或互补基因编码共同因素, 将刺激抗原呈现单元格。这些方法的主要局限性包括效率低、稳定性低、表达载体安全程度不确定等。在这项研究中, 我们提出了一种替代方法的疫苗改进, 其中包括卡介苗与外源蛋白的利益的表面上的细菌, 而不是转化与质粒编码相应的基因。首先, 在标准的大肠杆菌表达系统中, 有兴趣的蛋白质与单体素融合, 然后用来装饰化 BCG 的表面。用蛋白抗原修饰的 BCG 表面进行动物实验, 表明该修饰菌完全免疫, 能够诱导特定的 T 细胞反应。总而言之, 这里所提供的数据强烈支持一种新的、有效的方法来重塑目前的 BCG 疫苗, 取代了传统的与外源核酸互补的方法。
Introduction
已经提出了各种战略来取代目前的结核疫苗 bcg, 包括蛋白质佐剂系统、病毒向量技术、减毒活的m tb菌株以及基因改造的卡介苗菌株, 以引入基因过度表达 bcg 抗原, 在感染1或结核分枝杆菌特异抗原在 bcg2中没有充分表达。然而, 基因工程面临着许多障碍, 包括安全级别不确定、耗时过程和表达载体效率低下4,5。关于改进 BCG, 需要另一种方法来提高免疫原性, 而不需要不确定的基因交替。
在这项研究中, 我们介绍了一种新的策略, 显示在 BCG 细胞表面感兴趣的重组蛋白, 这是基于已知的高亲和性素与生物素的相互作用。这种方法允许快速和可重现的素融合蛋白在表面化卡介苗, 这有助于广泛的操作 bcg, 以达到最大的提高其功效, 同时保持其优良的安全性记录, 观察了几十年的使用。
素亲和性为生物素是极端高 ( Kd = 10−15 M ) 和一旦形成 , 生物素 - 素复合体是非常稳定的 , 并且在变性情况下只可能扰6。然而, 这种类型的相互作用作为一种基因转移方法的替代, 长期而可逆的显示重组蛋白是必需的。因此, 我们在这里介绍了一个低亲和力单体素 (Kd = 107 M), 这将导致从表面修饰的 BCG 在抗原呈递细胞内摄取的蛋白质的可逆释放。为了提供一个概念的证明, 我们测试了这种方法使用单体素嵌合体蛋白对应的代理抗原从蛋白 (卵子)7,8。结果表明, bcg 细胞表面可以方便、快速地用单体素融合蛋白进行修饰, 并且这种与 bcg 表面的结合是稳定和可重复的, 没有细菌生长和生存的可察觉的变化。此外, 我们发现, bcg 装饰与单体素融合与卵子 (AviOVA) 可以诱导免疫反应类似的 bcg 诱导的基因表达相同的抗原都在体外和在体内。这一技术的可逆显示蛋白质的细菌表面是一个有效的替代传统的基因转移方法, 可以提供一个平台的广泛操作卡介苗和进一步应用在疫苗发展.
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Protocol
所有动物都按照不列颠哥伦比亚大学动物保育和使用委员会批准的协议进行维护。实验得到动物保育和使用委员会的批准, 并按照加拿大动物保育委员会的指导方针进行。动物保证福利号是 A11-0247。
1. 表达质粒的单体素融合蛋白的生成
- 子克隆单体素序列12成 pDEST17 质粒之间的 "CTC" 和 "GAA" 网站对应的 133-134bp. (即, 介于 6-histag 和 pDEST17 Attr1重组站点) 之间以获得 p17-Avi。
注: 单体素 DNA 序列如下图所示。三突变引入野生型素获得单体素显示在粗体字符。
gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggcATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
acaaGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt - 设计底漆两侧的 B1 和反鱼雷B2 网站对应的卵子多肽757-1035 (I-A b-和 H-2Kb限制表位) DNA 序列。底漆序列是: b1-OVA
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT 和卷 b2-OVA
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC。(b1 和 b2 序列是粗体的.- PCR 放大卵子多肽757-1035 DNA 序列与上面的引物 pUC57-OVA 质粒作为模板。
- 通过特定于站点的体外重组反应 (如, BP Clonase) 将 PCR 产物克隆成 pDONR-221, 以获得 pDONR 卵。
- 利用 LR Clonase 反应将感兴趣的基因转移到 p17-Avi, 获得 p17-Avi-OVA。
注: 有关 BP 和 LR 重组克隆的详细信息, 请参阅制造商手册。
2. 单体素融合蛋白的表达、纯化和复用
- 将 p17-Avi-OVA 质粒转化为大肠杆菌 BL21 并诱导250毫升的大肠杆菌 BL21 培养与 IPTG (0.1 米) 3 小时在37° c.
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细菌和包涵体的溶解
- 250毫升的诱导 BL21 培养30分钟离心在 4000 x g 和4° c。
- 收集10毫升的裂解缓冲液 (50 毫米三盐酸, 150 毫米氯化钠, 6 米胍-hcl, pH 1.5-2.5) 和孵育15分钟在95° c。在一个旋转的室温下通宵孵育。
- 离心机30分钟在 1.5万 x g 和4° c 和收集上清液。
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用镍 NTA 柱纯化上清 (溶解包涵体分数) 的 Avi 卵。
- 用裂解缓冲液稀释包涵体1:2。
- 每250毫升的文化衍生包涵体使用4毫升的镍 NTA 树脂。
- 用10毫升的溶解缓冲液 (pH 7.0) 冲洗3x。
- 洗与10毫升的洗脱缓冲液 (裂解缓冲液 pH 7.0 与250毫米咪唑)。
- 再洗蛋白由渐进稀释 (1:10) 和快速涡流在三缓冲 (pH 7.5) 含有1毫米的双制式, 200 毫米 NDSB256 (3 (Benzyldimethylammonio) 磺), 0.5 毫米吐温 80, 500 毫米精氨酸, 200 毫米氯化钠为30分钟室温。
- De 盐和缓冲交换折叠蛋白质从三缓冲入 PBS 与蛋白质集中器根据制造商的协议。
- 在 3500 x g和4° c 的情况下, 用离心法去除聚合体30分钟, 并在-20 ° c 储存可溶性蛋白等分。
3. BCG 细胞表面法
- 种植卡介苗在 Middlebrook 7H9 汤与 10% OADC (油酸, 白蛋白和葡萄糖溶液) 和0.05% 吐温80在37° c 在一个振动筛平台在 50 rpm 直到 OD = 0.5-1。
注: bcg 是生物安全等级2病原体, 所有有关 bcg 的实验都应在生物安全柜内进行, 并配备适当的个人防护设备。 - 洗涤 109 BCG 3 次与500µL 的冰冷内毒素免费 PBS 加 0.1% Tween80 (PBST) (pH 8.0)。在无菌内毒素的 PBS 中悬浮卡介苗颗粒。
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立即使用前, 准备1毫升的10毫米磺-NHS SS 生物素在无菌过滤水中。
- 孵育细菌与1毫升的0.5 毫米磺-NHS SS 生物素在室温下为30分钟。
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用500µL 的冰冷 PBST 清洗标记的细菌3次, 以去除非反应的法试剂。
- 再悬浮颗粒在1毫升的 PBST。
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为了评估法效率, 染色 108化卡介苗与亲和 FITC (1:100, 25 µL) 在室温下20分钟。
- 在室温下孵育1毫升2% 粉煤灰中的染色菌, 然后通过流式细胞仪分析对法的含量进行检测。
4. 化分枝杆菌的表型: 生长和存活
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用 10% OADC (油酸、白蛋白和葡萄糖溶液) 和0.05% 吐温80在37° c 的 Middlebrook 7H9 汤中生长 BCG 菌株, 在 50 rpm 的振动筛平台上。
- 在8天的时间内记录细菌培养的光学密度 (OD600)。
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使用 BCG-卢克 (以前描述的9) 来检测巨噬细胞中细菌的存活。
- 感染 RAW264.7 细胞与化卡介苗-卢克 (莫伊 10:1) 或未经治疗的 bcg-卢克 (控制) 和孵化在37° c 超过48小时的时间内。
- 冲洗细胞单分子, 然后溶解 0.025% SDS 释放摄入的细菌。
- 用荧光检测系统和计测量生物发光的生产。
注意: 发光信号是细菌生存能力的指示。有关荧光化验的详情, 请参阅制造商手册。
5. 单体素融合蛋白与化卡介苗表面的结合
- 混合 5 x 108化卡介苗与 Avi 蛋白 (10 微克/毫升决赛在 PBS t) 为 1 h 在室温下在振动筛平台。
- 洗涤细菌3次与500µL 冰冷 PBST 和着色兔抗素抗体 (Ab) (1:100 稀释, 先前描述的10) 为20分钟室温, 然后与 FITC 共轭山羊抗兔 IgG Ab 在相同的条件。
- 用500µL PBST 洗涤细菌3次, 用流式细胞仪分析表面装饰的程度。
6. 分枝杆菌冻干
- Biotinylate 细菌根据步骤 3.1-3.4 和外套化细菌与 Avi 卵根据步5.1。
- 分化和涂布细菌 (108), 用 PBS 洗涤, 再在0.5 毫升冻干培养基中重新悬浮 (25% Sauton 培养基、75% H2O 和 1.5% Na 谷氨酸)。
- 将细菌转移到玻璃瓶中, 在一夜之间冷冻-80 ° c 冷冻。
- Lyophilize 用冷冻干燥机为24小时装满和冰冻的玻璃瓶。
- 在室温下储存干燥样品, 必要时在 PBS 中进行重组。
- 重复步骤3.5 以评估法和表面涂层的稳定性。
7. 吞噬试验
- 在10厘米直径培养皿中生长生264.7 巨噬细胞, 在含有 5% FCS 的 DMEM 培养基中, 1% 每种 l-谷氨酰胺、HEPES、非必需氨基酸、青霉素和链霉素直到 70-80% 70-100。
- 种子 2 x 106生264.7 巨噬细胞在 6-井板中。允许单元格在37° c 和 5% CO2的夜间粘附。
- 根据步骤 3.1-3.4 和 5.1, 生成 DsRed bcg (以前描述的9), 用 avi 卵 (DsRed 卡介苗-avi-卵) 装饰。
- 用 DsRed 卡介苗-Avi-卵或未经处理的 DsRed 卡介苗感染原细胞, 在莫伊20:1 为24小时, 在37° c。
- 洗涤细胞三次和处理使用1毫升0.25% 胰蛋白酶在37° c 为10分钟去除部分分离的细菌。
- 室温下20分钟, 在 PBS 中固定2.5% 的粉煤灰。
- 用 PBS 冲洗 3x, 用流式细胞仪分析。
8. 化卡介苗在巨噬细胞内的细胞内贩运
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荧光显微镜
- 种子 3 x 105生264.7 巨噬细胞在片的 24-井板上。允许单元格在37° c 和 5% CO2的夜间粘附。
- 在37° c 和 5% CO2的维持培养基中, 以分枝杆菌 (莫伊 10:1) 感染巨噬细胞, 4 至 24 h。
- 清洗细胞和处理去除附着的表面, 不摄入细菌, 如步骤7.5。
- 在 pbs 中, 在室温下20分钟修复2.5% 只粉煤灰中的感染细胞, 然后用 pbs 3 冲洗。
- Permeabilize 细胞在封闭/性缓冲 (0.1% 海卫 X-100, 3% BSA 在 PBS) 在室温下20分钟。
- 使用特定的兴趣抗体 (例如, 兔抗素 Ab) 在10微克/毫升, 在性缓冲20分钟在室温下其次抗体 (如, FITC 山羊抗兔 IgG) 20 分钟。
- 冲洗细胞3x 与 PBS, 一旦与水, 并在幻灯片上安装10μ l 水的安装介质, 以尽量减少荧光漂白。
- 使用带有 63 x/1.4 计划-色差目标的荧光显微镜, 通过数字共聚焦显微镜检查幻灯片。使用与显微镜软件耦合的数码相机记录图像。
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免疫染色与电镜
- 种子 2 x 106生264.7 巨噬细胞在 6-井板中。
- 用4% 的粉煤灰固定在室温下4小时的卡介苗感染的巨噬细胞。
- 用 PBS 洗两次样品。
- 在4% 低熔点琼脂糖中嵌入样品, 在70% 乙醇中脱水。
- 将样品转移到丙烯酸树脂和聚合50° c。
- 用切片切割出 60 nm 剖面, 并在镍网格上收集剖面。
- 用10微克/毫升素抗体在室温或4° c 夜间在孵化溶液 (PBS 和 0.1% BSA) 中标记样品, 然后用孵化液金-共轭 F (ab)2超小山羊抗兔 IgG (1/20) 在室温下为1小时温度在孵化溶液中。
- 用蒸馏水冲洗切片, 2% 戊二醛染色, 再冲洗, 晾干, 用电子显微镜检查。
9. 动物免疫和器官加工
注: 所有步骤应在生物安全柜中完成。
- 通过化和蛋白质涂层细菌通过 271/2G 针10次, 使单细胞悬浮。
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采取 1 x 106细菌在100μ l 无内毒素 PBS 和免疫雌性 C57BL/6 小鼠 (I-ab, H-2Kb, 5-6 星期老) 皮下的颈背。
- 单独注射100μ l 的 PBS 控制小鼠。
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安乐免疫小鼠20天后经 CO2吸入后经宫颈脱位后免疫接种。
- 分离脾脏并将其转化为 RPMI 介质。
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通过一个5毫升注射器柱塞的70µm 细胞过滤器捣碎脾脏。
- 用5毫升的 RPMI 洗。离心机 (800 x g, 3 分钟) 以隔离单个单元悬浮。
- 用小鼠生物素阳性选择试剂盒和 biotin-Ter119/Erythroid 细胞抗体消耗红细胞。
- 离心和重新悬浮细胞在10毫升完全 RPMI (10% FCS, 1% l-谷氨酰胺, 1% 青霉素, 1% 链霉素, 和50μ m 2-我)。
10. I-Ab聚丙烯染色, 以确定抗原特异的 CD4+ t 细胞和细胞内细胞因子染色的频率, 以确定在免疫动物中释放细胞因子的抗原特异性 t 细胞的频率
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聚丙烯染色
- 用 PE 共轭 I-Ab-卵子323-339控制和免疫小鼠 (~ 20 x 106细胞) 脾染色体 (1/12.5 稀释) 为1小时, 在37° c 在装订缓冲器 (PBS 与 2% FCS 和0.1% 南3)。
- 添加 AF647 CD4 Ab (1:25) 和 7-反倾销 (检测死细胞), 以脾在室温下20分钟。
- 用流式细胞仪分析样品。
- 在 CD4 阳性区域获得50万事件, 以确定聚丙烯阳性事件的频率。
注: 总脾是由 SSC/FSC 斑点杂交定义, 活细胞通过排除 7-反倾销阳性事件, 和 CD4 子集通过浇 AF647 阳性事件。
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抗原特异性细胞因子释放 T 细胞的频率
- 将大约 1 x 107脾转换为4毫升的完全 RPMI 介质, 在六-井板中有或没有重组卵 (10 µg/毫升) 并孵育 16 h。
- 治疗细胞与 Brefeldin A (1:1, 000) 为另外的 5 h。
- 用 PBS 洗涤, 并受细胞内细胞因子染色, 如下所示:
- 在室温下为30分钟的 PE-CD8 或 PE-Cy7-CD4 Ab (1:50 在装订缓冲器中) 染色细胞样品。
- 室温下4% 粉煤灰固定20分钟。
- Permeabilize 使用性解决方案, 根据制造商的指示。
- 用 AF647-conjugated 干扰素抗体 (1:50) 在室温下20分钟清洗细胞和标签。
- 洗涤细胞和受流式细胞仪分析如上文所述。
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Representative Results
采用上述一般程序, 研究了 BCG 表面法和替代抗原卵修饰的可行性。经改良的卡介苗的免疫原性被测试在体内。细菌表面易于标记的生物素快速显示素嵌合抗原没有任何可察觉的变化的细菌表型。通过抗原表达细胞有效地摄取了经过改良的卡介苗, 并能诱导小鼠的特定卵子免疫应答。
单体素融合质粒和蛋白质的生成
生成的表达质粒 p17-Avi 与网关方法相容, 用于生产单体素融合蛋白。卵子被克隆成 p17-Avi, 并在大肠杆菌中表达, 然后按照上面的描述 ( 图 1) 纯化和折叠。
生物素有效地附着在细菌表面, 不影响细菌生长或生存
细菌被标记为不同浓度 (0-1 毫米) 的生物素和染色检查的效率, 表面法根据上述协议。流式细胞仪分析显示, 荧光直方图在标记为 0.5 mM 生物素 (图 2) 的细菌中的总转移, 并在本研究中使用这种浓度来产生化细菌。接下来, 我们研究了细菌表面修饰对细菌表型的影响, 发现化和控制未经处理的 BCG 在8天的时间内显示了类似的生长剖面 (图 3A)。bcg 表达荧光 (bcg-卢克)9用于检测巨噬细胞的细菌存活。指示细菌存活的发光信号记录在48小时以上. 结果显示, 化和控制细菌之间的逐渐生存能力下降的相似性 (图 3B)。总之, 这些数据清楚地表明, 细菌表面法不影响细菌生长或生存在巨噬细胞内, 这是重要的, 因为增加生存在巨噬细胞可能意味增加细菌毒力。
细菌表面修饰的效率
根据上述协议, 化细菌在与单体素的融合中被涂上了卵抗原肽。流式细胞仪分析显示, 对非化细菌的卵子结合程度最低 (8.31 ± 0.42,图 4A, 顶部面板) 和重要水平的卵子结合到化细菌 (多边基金会 = 54.67 ± 4.98) 相比, 控制细菌 (多边基金会 = 5.92 ±0.22,图 4A, 下部面板)。
BCG 表面装饰的稳定性
由于传统的卡介苗是作为干粉来配制的, 因此本研究中出现的一个重要问题是冷冻干燥、重构、冷藏或室温贮藏后改性卡介苗的稳定性。因此, 我们检查了在冻干卡介苗的 avi 卵 (表面装饰与 avi 卵) 和新装修的细菌制剂的 avi 卵的表面显示。结果 (图 4B) 显示, 在冷冻干燥和室温贮藏后一个月内, 细菌表面的 avi 卵水平保持稳定, 可被检测到, 与新鲜卡介苗卵的准备情况相比, 这表明这一表面装饰方法适用于疫苗研制。
巨噬细胞表型不受细菌表面修饰的影响
为了了解这种表面修饰方法是否干扰细菌进入宿主细胞, 我们使用 RAW264.7 细胞和 DsRed 细菌9进行了上述协议中描述的吞噬试验。图 4C显示, 与未涂布的野生型 bcg (24.47 ± 1.18%) 相比, 细菌表面修饰 bcg 对细菌进入 (22.5 ± 1.57%) 没有明显的干扰, 表明 bcg 表面修饰对巨噬细胞没有影响型.
素融合蛋白旅行细胞与 MHC 分子的协同定位
为了检查在巨噬细胞内的 Avi-卵子修饰的 BCG 的命运, 如上面的协议中所描述的, 附着的原始细胞受到了荧光显微镜的感染和检查。获得的图像 (图 5A) 显示, Avi 卵不仅存在于细菌表面, 而且还与细菌分离和移位到细胞质。为了进一步验证这一结果, 我们进行了一个免疫染色实验, 得到的图像清楚地表明, Avi 卵抗原不仅存在于 bcg 表面, 但也可以从 bcg 表面分离, 交叉 phagosomal 膜, 并旅行向胞 (图 5B)。为了进一步研究是否能够将其表面蛋白货物运送到抗原表达通路, 巨噬细胞被感染了 avi-卵子卡介苗, 如协议所述, 并受到共焦分析。结果 (图 6A) 显示, 有定位的 Avi-卵子与 I-A 分子, 提示素融合蛋白分离和移位抗原展示室, 他们被加载到 MHC II 分子。结果还表明, avi 肽本地化与第一类分子在 BCG 吞噬时染色 H-2kb (图 6B), 这表明有可能呈现的 avi 卵抗原的 CD8+ T 细胞由噬.这些数据表明, 一旦表面修饰细菌进入巨噬细胞, 抗原就能向抗原表达通路的方向传输。
表面装饰细菌完全免疫
为了检查表面修饰 bcg 是否能够诱导一个特定的免疫反应在体内, C57BL/6 小鼠接种了 PBS 单独 (控制), 野生型卡介苗, Avi-卵子装饰 bcg, 和 bcg 基因改造与质粒表达类似的卵抗原。根据该协议, 20 天后, 对免疫小鼠进行了牺牲, 并发现了特定于卵子的 CD4+ t 细胞和特定于卵子的 t 细胞释放细胞因子的频率。结果 (图 7A-b) 显示, 与 bcg 疫苗相比, 接种卡介苗的 bcg 免疫的动物中有较大比例的卵子特异性 CD4+T 细胞应答. bcg 基因修饰对卡介苗表现出类似的免疫应答Avi-卵细胞 (图 7)。这些数据表明, 细菌表面修饰法能够诱导抗原特异 CD4 的显著扩张, 而 t 细胞的反应诱导程度与 BCG 基因工程表达类似的卵抗原.
由于细胞内细胞因子也是抗原特异 t 细胞反应的重要指标, 细胞内细胞因子染色 (ICS) 的实验, 以进一步评估 t 细胞免疫应答通过确定的表达和频率免疫细胞因子在动物接种的卵子修饰细菌和细菌遗传转化的卵表达质粒。我们检查了干扰素-γ释放的水平, 这是已知的保护反应的细胞内细菌11。我们证明了, 我们能够检测到与细菌免疫的动物相比, 免疫细菌表面 (BCG-Avi-卵和 BCG-p19-Avi-OVA) 的 CD4 细胞中有类似的特定于卵子的干扰素-γ释放的水平.基因表达的卵细胞 (BCG-p19-OVA) (图 8A)。重要的是, 我们也能够检测出高得多的干扰素-γ (CD8) 在卡介苗免疫的动物中, 与卡介苗免疫的动物相比, 基因表达卵细胞 ( 图 8BC)这表明, 生物素-素介导的抗原方法的表面显示可以有效取代 BCG 转化与核酸。
图 1: 构建用于生产素融合蛋白的重组克隆质粒.(a)单体素的基因段编码是用限制点 NdeI 和 NotI 和亚在6x 组氨酸和门卡式盒之间合成 pDEST17, 生成 p17-Avi 质粒。卵子肽252-345 DNA 序列以带 * 终止, B 站点被克隆到 pDONR221. 此后, 卵子基因被亚成 p17-Avi。图像编辑和转载的许可, 从公共图书馆一12。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: BCG 法的效率.化以不同浓度的琥珀酰亚胺-SS-生物素为30分钟的室温, 然后用 FITC-亲和进行标记, 用流式细胞仪分析。结果显示为绿色荧光强度直方图, 插入图代表平均荧光强度 (多边组织) 的平均± SEM 从3独立实验中扣除。* P < 0.05;** < 0.01;P < 0.001。图像编辑和转载的许可, 从公共图书馆一12。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: BCG 表面的法不影响其在巨噬细胞中的生长或存活.(A) 毕-bcg 和控制未标记的野生型 bcg 在完整的7H9 培养基中生长, 在8天的时间内进行了复制监测。结果被表达为生长曲线,即, 平均吸光度在 600 nm 作为时间的功能, 从3独立的实验。(B) 巨噬细胞感染了毕-卡介苗-卢克或控制未标记的 bcg-卢克在指定的时间段内, 然后细胞裂解被制备并检测出生物发光以探测出可行的细菌。结果被表达为平均相对光单位 (RLU) ± SEM 从3独立实验。图像编辑和转载的许可, 从公共图书馆一12。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 与毕-BCG 结合的 Avi-卵子及其稳定性.(A) 毕-dsRed-bcg (表达红色荧光的细菌, 以前描述的9) 和控制非化 dsRed-bcg 在室温下与 Avi 虫卵混合, 1 h, 并通过表面染色对卵结合程度进行评价兔抗素抗体和 FITC 山羊抗兔 IgG (FL1)。用流式细胞仪对样品进行洗涤和分析。结果显示为绿色荧光强度直方图, 其值为三独立实验所得的毕-BCG-AviOVA 结合的多光谱模型的平均± SEM。(B) 在 A 中描述的用流式细胞仪标记和分析了以 avi-卵和新鲜制作的 avi-卵-毕-bcg 为的冻干毕卡介苗.所显示的数据是三独立实验的代表, 其值是由三独立实验获得的 Avi-卵-毕-BCG 结合的平均数字。(C) 原始巨噬细胞感染 DsRed 卡介苗-Avi-OOVA 或 DsRed-bcg, 在24小时37° c。然后用胰蛋白酶、固定的方法对样品进行洗涤, 并进行分析。结果被表达为红色荧光直方图, 反映了吞噬的程度。数值表明, 从三独立实验中摄取卡介苗的细胞的平均百分率± SEM。图像编辑和转载的许可, 从公共图书馆一12。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 从 BCG 表面分离的 Avi 卵, 并越过 phagosomal 膜向胞.(A) 盖板上附着的原始细胞在37° c 时感染了24小时的 dsRed-BCG, 然后固定/化, 用兔抗素抗体和 FITC 山羊抗兔 IgG 染色。样品安装在显微镜的幻灯片和数字共聚焦显微镜分析。红色信号表明 BCG 和绿色信号的位置反映了 Avi 的定位。虚线表明巨噬细胞的边界和右下面板是一个4X 放大的插入显示在左面板。(B) BCG-AviOVA 感染的原细胞的薄切片固定与甲醛, 并依次孵育抗素抗体和金-共轭山羊抗兔 IgG, 以可视化 Avi 卵, 并用电子显微镜检查。显示了12,000X 的放大倍数。箭头表明, 从 BCG 表面分离的 Avi 卵, 并出口到体膜之外。所显示的图像是两个独立实验的代表。图像编辑和转载的许可, 从公共图书馆一12。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 素-融合抗原与 MHC II 类和 i 类分子进行局部化.黏附的 BMA3.1A7 细胞, 老鼠巨噬细胞线, 被传染了与卵巢被装饰的 GFP-BCG (表达绿色荧光, 早先被描述的9) 为 4 h, 然后刺激与干扰素γ为 24 h. 细胞然后固定/化和沾染兔抗素抗体, alexa 594 抗兔 IgG 和任何一个 alexa 647 鼠抗鼠 I a (a) 或 alexa 647 鼠抗老鼠 H-2kb (b)。样品安装在显微镜的幻灯片和数字共聚焦显微镜分析。绿色信号表明, BCG-GFP 和红色信号的位置反映了 Avi-卵的定位。蓝色信号表示 MHC II 类或 i 类分子的位置。虚线表示感兴趣的区域。箭头表示 Avi 定位与 MHC 分子。显示的图像是两个独立实验的代表。图像编辑和转载的许可, 从公共图书馆一12。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7:在体内CD4+ T 细胞对卵子修饰 BCG 的反应。C57BL/6 小鼠皮下注射与 bcg 表面装饰与卵子, 未经修改的 bcg 野生类型, PBS (控制), bcg 基因转化为表达卵子 (BCG-p19-OVA), 或转化为控制质粒和表面装饰的 Avi 卵 (BCG-p19-AviOVA)。经过20天的时间, 脾是准备从脾脏的安乐死动物和染色与 PE 共轭 I-一个b-卵子323-339体 (a), 其次是 AF647-CD4 抗体和 7-反倾销。然后用流式细胞仪分析样品。结果表示为两个参数的点图, 显示聚丙烯阳性事件的平均频率± SEM 在 CD4+的人口从两个动物/组。所显示的数据是三独立实验的代表 (共有六只老鼠被检测出每只老鼠的细胞样本)。图中的数据 (B) 以平均值 (总共50万事件) 中的聚丙烯特定的 CD4+细胞从两个动物/组和三独立的实验中被表示为绝对值± SEM。* P < 0.05;** < 0.01;P < 0.001。图像编辑和转载的许可, 从公共图书馆一12。请单击此处查看此图的较大版本.
图 8: T 细胞释放细胞因子的频率响应 Avi-卵子包衣卡介苗免疫.采用 PBS、卡介苗野型、bcg、BCG-p19-OVA、BCG-p19-AviOVA 等脾的免疫小鼠, 用重组卵蛋白刺激16小时, 再用 5 h 期治疗 Brefeldin a 细胞, 然后冲洗首先用 PE-Cy7 anti-CD4 (A) 或 PE 抗 CD8 抗体 (B) 染色, 然后 AF647 抗干扰素γ抗体。然后用流式细胞仪对细胞进行洗涤和分析。结果表示为两个参数的点图, 以显示在 CD4+和 CD8+的两个动物/组中的干扰素生成细胞子集的平均频率± SEM。所显示的数据是三独立实验的代表 (共有六只老鼠被检测出每只老鼠的细胞样本)。图 (C) 中的数据被表示为干扰素释放 CD4 的绝对数± SEM (左图) 或干扰素释放 CD8 + t 细胞 (右图) 从两个动物/组和三独立实验。* P < 0.05;** < 0.01;P < 0.001。图像编辑和转载的许可, 从公共图书馆一12。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
我们在这项研究中报告了一种非遗传的方法快速有效地显示外源性蛋白在 BCG 表面, 以增加任何特定的抗原或特定的功能性质, 预期有效地提高细菌的免疫原性。我们证明, BCG 细胞表面可以很容易化的瞬时表面装饰与素融合蛋白。总的过程可以在2小时内完成, 而遗传转化和阳性克隆的选择需要2到3月的时间滞后。表面改性不影响细菌的生长和存活。用替代抗原卵细胞修饰的细菌能够将抗原传递到抗原表达通路, 并在体内诱导特定的免疫反应, 用流式细胞仪检测包括 MHC 聚丙烯染色和细胞因子染色 (ic)。更重要的是,在活体中的研究清楚地表明, 表面修饰的细菌能够诱导类似的免疫应答水平与 BCG 基因工程表达类似抗原。
素生物素相互作用是最强的非共价相互作用已知在自然与 Kd 10−15 M13。它不仅是生物学研究中常用的一个有用的工具14, 而且最近也被证明适用于癌症治疗的15,16。在这项研究中, 一个三重突变 (N54A, W110K 和 N17I) 被应用于野生型素转换 tetrameric 素的形式单体素, 大大减少素生物素亲和性 (Kd= 10−7 M) 和绑定可逆的到生物素。这种单体素是用来开发一个 p17-Avi 质粒, 是兼容的网关重组克隆 (Invitrogen) 的一步快速表达的一种蛋白质的兴趣。这一新版本的单体素有几个优点, 包括防止大细菌丛聚集和瞬态/可逆细菌表面显示的蛋白质的利益。因此, 一旦被宿主细胞摄取, Avi 融合蛋白就能从化细菌和交通细胞的表面分离出来。最后, 突变将素转化为非糖化形式, 可适用于酵母或转基因植物17,18 , 用于在真核系统中生产大量的素融合蛋白。这种形式的单体素的选择, 而不是一个版本的单体亲和 (mSA)19, 其中有亲和和 rhizavidin 序列和具有更高的绑定亲和力 (Kd 10−9 M)与 mAvidin。通过初步试验, mSA 嵌合体蛋白与 mAvidin 嵌合体蛋白相比, 对化菌具有更低的结合效率。因此, 这项研究是基于 mAvidin 的, 但单体亲和或其他形式的亲和/素也将是其他应用的可能性。
所述协议的成功实施取决于所生成的融合蛋白的质量和细菌表面法的效率。洗 Avi 标记的蛋白质应该是 de 盐渍和缓冲交换到 PBS 使用适当的分子量蛋白质集中器。在某些蛋白质的高浓度因子中, 可能发生沉淀, 因此, 首先应使用少量的洗蛋白对浓度因子进行测试和测定,例如, 0.5 至1毫升的溶解包涵体稀释于 PBS 20 毫升。然后集中。在整个过程中保持4° c 左右的蛋白质温度也很重要, 以避免沉淀。
为了提高细菌表面法的效率, 磺-琥珀酰亚胺 SS 生物素应贮存在其原始容器中, 在4° c 的黑暗中。该试剂具有极高的吸湿敏感性;因此, 在开放前, 含有试剂的小瓶应平衡到室温。此外, 生物素库存解决方案 (10 毫米) 应在使用前立即作为 NHS-酯类基团水解, 并成为非反应很快。生物素库存解决方案不能存储和重用;每个法实验都需要一个新的生物素小瓶。为了取得最佳效果, 推荐新鲜的卡介苗、新鲜的培养基以及新鲜的缓冲。如本议定书所述, 化和包衣卡介苗可以冻干并保存至少30天, 而不会影响表面涂层的质量。这是特别有用的, 当发送或转移样品从一个位置到另一个或当执行长的课程实验。
这种 BCG 表面装饰方法也提供了其他令人兴奋的可能性, 以快速准确的方式分析和评价新研制的候选疫苗的免疫原性。新型结核疫苗的主要目标是诱导 TH1 类型的细胞, 如 CD4 的+和 CD8 的+ T 细胞, 它们在预防结核病方面发挥重要作用。本研究开发的素生物素系统为评估这些 T 细胞的反应提供了一个非常有用的工具。这种在 BCG 表面快速显示重组蛋白/抗原的新技术, 是快速准确评估许多免疫蛋白 (例如, 分泌特定的m tb的保护功效的一个很好的工具。蛋白质), 从而可以转化为有效疫苗的开发。
通过调节和改变细菌表面的 Avi 融合蛋白的浓度, 该方法的另一个优点是同时在细菌表面上显示不同的抗原, 以最大限度地提高疫苗的有效性。由于研究表明, bcg 干扰重要的巨噬细胞功能, 如体成熟20,21和抗原呈现21, 一个进一步改善 bcg 的可能性可能是装饰 bcg 表面与感兴趣的抗原一起加速体成熟的因素的组合。
这项技术的一些局限性包括大规模生产重组蛋白的要求, 这在低收入地区可能具有挑战性和昂贵。此外, 生产难以纯化的蛋白质需要进行故障排除和优化。然而, 随着重组蛋白生产技术的改进, 这些局限性是可以规避的。另一个限制包括在实验室动物和人类中自然发生的抗素抗体的可能性,22可能会妨碍使用素治疗的目的。然而, 其他实验室已经测试了素治疗的安全性和有效性, 并表明, 素的安全性和有效性并没有显著影响其免疫原性23。有趣的是, 将野生型 tetrameric 素转化为单体形式, 大大降低了其免疫原性24。
综上所述, 这种利用素生物素系统提高卡介苗免疫原性的新技术, 通过快速、可再生的非遗传细菌表面修饰的兴趣蛋白, 可以成功取代传统的 bcg 转化与抗原编码质粒。此外, 这种新的方法不仅可以促进现有的卡介苗疫苗的改善, 但也可以提供一个新的平台, 快速评估几乎任何潜在的抗原或蛋白质通常难以表达的基因在 bcg, 与广泛在结核病疫苗开发中的应用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 Dr. R 斯托克斯为波士顿巴斯德菌株和 a. 技术支持。我们还感谢金瑞对基因合成的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin-free RPMI 1640 | StemCell Technologies | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS biotin | Thermo Fisher | 21328 | |
| FITC-conjugated streptavidin | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL International | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON polyhistidine-Tag purification resin | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| AF647 rat anti-mouse IFN-g | BD Bioscience | 557735 | |
| AF647 rat anti-mouse I-A/I-E | BD Bioscience | 562367 | |
| PeCy7 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 552775 | |
| PE rat anti-mouse CD8 Ab | BD Bioscience | 561095 | |
| AF 647 rat anti-mouse H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC-conjugated goat anti rabbit antibody | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG | Electron Microscopy Sciences | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Diagnostic Systems | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 murine macrophage cell lines | American Type Culture Collection | ||
| pDEST17 plasmid | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA plasmid | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 plasmid | Invitrogen | 12536017 | |
| Ni-NTA columns | Qiagen | 31014 | |
| Pierce protein concentrators | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II epifluorescence microscope | Carl Zeiss Inc | ||
| CCD digital camera | Retiga EX, QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV electron microscope | FEI Company | G2 200Kv | |
| 70μm Falcon cell strainer | Thermo Fisher | 87712 | |
| EasyStep mouse biotin positive selection kit | StemCell | 18556 | |
| biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Pharmingen | 554714 | |
| Bright-Glo Luciferase assay system | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 microtome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 freeze dryer | Savant Instruments | NL 50 | |
| Wheaton boroscilicate glass vials | Wheaton | VWR 66011-675 |
References
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