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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Expression des antigènes exogènes dans le Mycobacterium bovis BCG par l’intermédiaire de décoration de Surface Non génétiques avec le système avidine-biotine

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56421
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine and Vancouver Costal Health Research Institute, University of British Columbia, 2Institute of Biomedical Technology, University of Tampere

Summary

Une nouvelle technique pour l’affichage rapide de l’antigène sur la surface bactérienne est présente, ce qui implique biotinylation surface suivie d’une exposition à des protéines d’intérêt en fusion avec avidine monomère. Chargement de BCG avec certains antigènes avec succès améliore son immunogénicité, suggérant que la décoration de surfaces peut remplacer les approches génétiques traditionnelles.

Abstract

La tuberculose est une maladie infectieuse grave et le bacille de M. bovis de vaccin disponible uniquement Calmette-Guérin (BCG) est sûr et efficace pour la protection contre la méningite tuberculeuse grave de l’enfant et de certaines formes de tuberculose disséminée, mais ne parvient pas à protéger contre la tuberculose pulmonaire, qui est la forme la plus répandue de la maladie. Des stratégies prometteuses pour améliorer le BCG actuellement fonder soit sur sa transformation avec gènes codant immunodominant M. tuberculosis (Mtb)-antigènes spécifiques et/ou de complémentation avec des gènes codant des co-facteurs qui stimuleraient l’antigène cellules présentatrices. Les principales limites de ces approches incluent faible efficacité et faible stabilité au niveau incertain de sûreté des vecteurs d’expression. Dans cette étude, nous présentons une approche alternative à l’amélioration de vaccin, qui se compose de complémentation de BCG avec des protéines exogènes d’intérêt sur la surface des bactéries, plutôt que de transformation avec des plasmides codant des gènes correspondants. Tout d’abord, les protéines d’intérêt sont exprimées en fusion avec avidine monomère dans la norme d’e. coli des systèmes d’expression, puis utilisée pour décorer la surface de biotinylé BCG. L’expérimentation animale utilisant BCG surface ornée d’antigène de l’ovalbumine substitut démontre que la bactérie modifiée est immunogène et capables d’induire des lymphocytes T spécifiques. Au total, les données présentées ici fortement appuient un roman et une méthode efficace pour remodeler le vaccin BCG actuel qui remplace l’approche conventionnelle laborieux de complémentation avec des acides nucléiques exogènes.

Introduction

Diverses stratégies ont été proposées pour remplacer l’actuel TB vaccin BCG, y compris les protéines adjuvant systèmes, technologies vectorisées virales, souches vivantes atténuées de tuberculosis et des souches de BCG génétiquement modifiées, soit pour introduire des gènes surexprimant les antigènes BCG qui ne sont pas suffisamment exprimées au cours de l’infection1 ou VTT-antigènes spécifiques non présent dans le BCG2. Génie génétique, cependant, est confrontée à de nombreux obstacles y compris le niveau incertain de la sécurité, le processus fastidieux et la faible efficacité de vecteurs d’expression,4,5. En ce qui concerne l’amélioration de BCG, une autre approche est nécessaire pour améliorer l’immunogénicité sans la nécessité d’alternances génétiques incertains.

Dans cette étude, nous introduisons une nouvelle stratégie pour l’affichage des protéines recombinantes d’intérêt sur la surface des cellules par le BCG qui repose sur l’interaction de l’avidine bien connue de haute affinité avec de la biotine. Cette approche permet une fixation rapide et reproductible des protéines de fusion recombinantes avidine sur la surface de biotinylé BCG, ce qui facilite les manipulations larges de BCG à réaliser une amélioration maximale de son efficacité tout en conservant son excellente sécurité enregistrer, observé au cours des décennies d’utilisation.

L’avidine affinité pour la biotine est extrêmement élevée (Kd = 10−15 M) et une fois formé, le complexe biotine-avidine est très stable et peut seulement être perturbé sous dénaturer des conditions6. Toutefois, pour ce type d’interaction pour servir comme une alternative de méthode de transfert de gène, affichage à long terme mais réversible de protéines recombinantes est requise. Ainsi, nous avons introduit ici une avidine monomère de faible affinité (Kd = 10−7 M) que mène à la libération réversible de protéines de la surface décorée BCG ingéré une fois à l’intérieur de cellules présentatrices. Afin de fournir une preuve de concept, nous avons testé cette méthode en utilisant une protéine chimérique avidine monomère correspondant à un antigène de substitution provenant d’ovalbumine (OVA)7,8. Les résultats ont montré que la surface des cellules par le BCG peut être facilement et rapidement décorée avec des protéines de fusion avidine monomère et que cette liaison à la surface du BCG est stable et reproductible sans changement détectable à la survie et la croissance bactérienne. En outre, nous avons constaté que BCG orné de monomère avidine fusionnée avec des ovules (AviOVA) peut induire une réponse immunitaire semblable à celle induite par le BCG génétiquement exprimant l’antigène même in vitro et in vivo. Cette technologie d’affichage réversible de protéines d’intérêt sur la surface bactérienne est donc un remplacement efficace des approches de transfert de gène traditionnel et peut fournir une plate-forme pour les grandes manipulations du BCG et de nouvelles demandes en vaccin développement.

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Protocol

Tous les animaux ont été maintenues conformément aux protocoles approuvés par les comités de l’emploi à l’Université de la Colombie-Britannique et animalier. Expériences ont été approuvés par les comités de l’utilisation et de protection des animaux et interprétés selon le Canadian Council on Animal Care lignes directrices. Le nombre de bien-être des animaux assurance est A11-0247.

1. génération des protéines de Fusion de monomère avidine exprimant des plasmides

  1. Cloner l’avidine monomère séquence12 dans le plasmide pDEST17 entre les sites « CCT » et « GAA » qui correspond à 133-134bp. (c'est-à-direentre la 6-histag et le site de recombinaison Attr1 pDEST17) pour obtenir p17-Avi.
    Remarque : La séquence d’ADN de monomère avidine est illustrée ci-dessous. Les trois mutations introduites en avidine sauvage pour obtenir l’avidine monomère sont indiquées en caractères gras.
    gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc STCATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
    agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
    ACAAGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
    tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
    attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga
  2. Concevoir des amorces flanqués de sites AttB1 et B2 Attcorrespondant aux ovules polypeptide757-1035 (I-Ab- et H-2_Kb-restreint des épitopes) séquence d’ADN. Séquences d’amorces sont : Attb1-OVA
    B2-OVA TCCTTGAGCAGCTTGAGAGTATACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTgirot et Att
    GIROTACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 et b2 des Attséquences figurent en caractères gras).
    1. PCR-amplifier OVA757-1035 ADN séquence polypeptidique avec les amorces ci-dessus en utilisant le plasmide pUC57-OVA comme gabarit.
    2. Cloner les produits PCR dans pDONR-221 à travers une in situ in vitro réaction de recombinaison (p. ex., Clonase BP) pour obtenir des pDONR-OVA.
  3. Transférer le gène d’intérêt dans p17-Avi à l’aide de la réaction Clonase LR pour obtenir p17-Avi-OVA.
    Remarque : Pour plus de détails de clonage de recombinaison BP et LR, voir le manuel du constructeur.

2. monomère avidine Fusion Protein Expression, Purification et repliement

  1. Transformer le plasmide p17-Avi-OVA en e. coli BL21 et induire de 250 mL d’e. coli BL21 culture avec IPTG (0,1 M) pendant 3 h à 37 ° C.
  2. Lyse des bactéries et la solubilisation des corps d’Inclusion
    1. Granule le 250 mL de la culture BL21 induite par 30 min de centrifugation à 4 000 x g et 4 ° C.
    2. Recueillir des granulés dans 10 mL de tampon de lyse (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 Guanidine-HCL, pH 1,5 à 2,5 M) et incuber pendant 15 minutes à 95 ° C. Incuber une nuit à température ambiante sur un agitateur.
    3. Centrifuger 30 min à 15 000 x g et 4 ° C et à frais viré surnageant.
  3. Purifier Avi-OVA de surnageant (Fraction solubilisée corps d’Inclusion) à l’aide de colonnes Ni-NTA.
    1. Diluer les corps d’inclusion 1:2 avec tampon de lyse.
    2. Utilisez 4 mL de résine Ni-NTA par 250 mL de corps d’inclusion dérivées de la culture.
    3. Laver 3 x 10 ml de tampon de lyse (pH 7,0).
    4. Éluer avec 10 mL de tampon d’élution (lyse tampon pH 7.0 avec imidazole 250 mM).
  4. Replier la protéine éluée par dilution progressive (01:10) et une agitation rapide dans un tampon Tris (pH 7.5) contenant 1 millimètre DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0,5 mM Tween 80, arginine 500 mM et 200 mM NaCl pendant 30 min à température ambiante.
  5. Hors sel et échange tampon replié protéine de tampon Tris dans PBS avec concentrateurs de protéines selon les protocoles du fabricant.
  6. Supprimer des agrégats par centrifugation pendant 30 min à 3 500 g x et à 4 ° C et stocker les aliquotes de protéine soluble à-20 ° C.

3. Biotinylation de Surface cellulaire de BCG

  1. Croître BCG en bouillon Middlebrook 7H 9 bouillon avec 10 % OADC (acide oléique, solution d’albumine et dextrose) et 0,05 % de Tween 80 à 37 ° C sur une plateforme de shaker à 50 tr/min jusqu'à OD = 0,5-1.
    Remarque : Le BCG est un pathogène de niveau 2 de biosafety et toutes les expériences concernant le BCG devraient être faites dans une armoire avec un équipement de protection personnels de biosécurité.
  2. Lavez 109 BCG 3 fois avec 500 µL de PBS gratuit endotoxine glacee plus 0,1 % Tween80 (PBST) (pH 8,0). Suspendre pastille de BCG dans du PBS gratuit endotoxine stérile.
  3. Immédiatement avant l’emploi, préparer 1 mL de biotine Sulfo-NHS SS 10 mM dans l’eau filtrée stérile.
    1. Incuber les bactéries avec 1 mL de 0,5 mM de biotine Sulfo-NHS SS à température ambiante pendant 30 min.
  4. Laver les bactéries marqués 3 fois avec 500 µL de glacé PBST froid pour enlever non-réagi biotinylation réactif.
    1. Resuspendre le culot dans 1 mL de PBST.
  5. Evaluer l’efficacité biotinylation, tache 108 biotinylé BCG avec streptavidine-FITC (au 1/100, 25 µL) à température ambiante pendant 20 min.
    1. Incuber les bactéries colorées dans 1 mL de 2 % PFA pendant 20 min à température ambiante et ensuite examiner les niveaux de biotinylation par analyse en cytométrie en flux.

4. phénotype des mycobactéries biotinylés : croissance et survie

  1. Croissance des souches de BCG en bouillon Middlebrook 7H 9 bouillon avec 10 % OADC (acide oléique, solution d’albumine et dextrose) et 0,05 % de Tween 80 à 37 ° C sur une plateforme de shaker à 50 tr/min.
    1. Enregistre la densité optique (OD600) de la culture bactérienne pendant une période de 8 jours.
  2. Utilisez le BCG-Luc (décrite précédemment9) pour détecter la survie des bactéries dans les macrophages.
    1. Infecter les cellules RAW264.7 avec biotinylé BCG-Luc (MOI 10:1) ou non traitées par le BCG-Luc (contrôle) et incubé à 37 ° C sur un 48 h de délai.
    2. Laver les monocouches de cellules et puis lyse avec 0.025 % SDS pour libérer des bactéries ingérées.
    3. Mesurer la production de bioluminescence avec système de dosage de luciférase et luminomètre.
      NOTE : Signal de Luminescence est révélatrice de la viabilité bactérienne. Veuillez consulter le manuel du fabricant pour plus de détails de l’analyse de luciferase.

5. la liaison de la protéine avidine-Fusion monomère à Surface de BCG biotinylés

  1. Mélanger 5 x 108 biotinylé BCG avec Avi-protéine (10 μg/mL final PBS-T) pendant 1 h à température ambiante sur la plate-forme agitatrice.
  2. Bactéries de laver 3 fois avec 500 µL de PBST froid glacé et tache avec anticorps de lapin anti-avidine (Ab) (dilution 1 : 100, décrites précédemment10) pendant 20 min à température ambiante, puis à la FITC conjuguent anti-lapin de chèvre Ab IgG dans les mêmes conditions.
  3. Laver 3 fois avec 500 µL de PBST, les bactéries et d’analyser par cytométrie de flux pour évaluer l’ampleur de la décoration de surfaces.

6. la lyophilisation des mycobactéries

  1. Biotinylater bactéries selon l’étape 3.1 à 3.4 et manteau biotinylé bactéries avec Avi-OVA selon étape 5.1.
  2. Aliquote biotinylé et enduits bactéries (108), laver avec du PBS et remettre en suspension dans 0,5 mL de milieu de lyophilisation (1,5 % milieu de Sauton de 25 % et 75 % H2O Na-glutamate).
  3. Transférer des bactéries de flacons en verre et congeler dans un congélateur à-80 ° C durant la nuit.
  4. Lyophiliser les flacons en verre remplis et congelés pendant 24 h à l’aide d’un gel du séchoir.
  5. Stocker les échantillons séchés à température ambiante et reconstituer dans du PBS quand nécessaire.
  6. Répétez l’étape 3.5 pour évaluer la biotinylation et stabilité de revêtement de surface.

7. phagocytose Assay

  1. Grandir 264.7 cellules macrophages dans les récipients de culture de diamètre de 10 cm en DMEM moyen contenant 5 % FCS, 1 % de L-glutamine, HEPES, acides aminés non essentiels et la pénicilline et la streptomycine jusqu'à la confluence de 70 à 80 %.
  2. 2 x 106 RAW 264.7 cellules de macrophages dans une plaque 6 puits de graines. Permettre aux cellules d’adhérer une nuit à 37 ° C et 5 % de CO2.
  3. Générer la DsRed BCG (décrite précédemment9) décoré avec Avi-OVA (DsRed BCG-Avi-OVA) selon les étapes 3.1 à 3.4 et 5.1.
  4. Infecter les cellules RAW avec DsRed BCG-Avi-OVA ou non traitée DsRed BCG à MOI 20:1 pendant 24 h à 37 ° C.
  5. Laver trois fois les cellules et trypsinize en utilisant 1 mL de 0,25 % de trypsine à 37 ° C pendant 10 min pour éliminer les bactéries partiellement détachées.
  6. Difficulté à 2,5 % PFA dans du PBS pendant 20 min à température ambiante.
  7. Laver 3 fois avec du PBS et d’analyser par cytométrie en flux.

8. intracellulaire d’oeufs décorés biotinylé BCG dans les Macrophages

  1. Microscopie en fluorescence
    1. Graines de 3 x 105 RAW 264.7 cellules de macrophages sur les lamelles dans une assiette de 24 puits. Permettre aux cellules d’adhérer une nuit à 37 ° C et 5 % de CO2.
    2. Infecter les cellules macrophages avec mycobactéries (MOI 10:1) dans les médias de maintenance sans antibiotiques à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 4 à 24 h.
    3. Laver les cellules et trypsinize pour supprimer la surfaces bactéries non ingéré, attachés comme à l’étape 7,5.
    4. Cellules Fix infecté dans 2,5 % PFA dans du PBS pendant 20 min à température ambiante suivi par 3 lavages avec du PBS.
    5. Permeabilize des cellules dans un tampon bloquant/perméabilisation (0,1 % X-100 Triton, 3 % de BSA dans du PBS) pendant 20 min à température ambiante.
      1. Anticorps spécifiques d’utilisation d’intérêt (p. ex., lapin anti-avidine Ab) à 10 μg/mL en perméabilisation tampon pendant 20 min à température ambiante suivi d’anticorps secondaire (p. ex., IgG anti-lapin FITC-chèvre) pendant 20 min.
    6. Laver les cellules 3 fois avec du PBS, une fois avec de l’eau monter sur diapositives de 10 μl de milieu de montage aqueux pour réduire au minimum le photoblanchiment de fluorescence.
    7. Examiner les diapositives de la microscopie confocale numérique à l’aide d’un microscope à épifluorescence équipé x 63 / 1.4 objectif Plan-Apochromat. Enregistrer des images à l’aide d’un appareil photo numérique couplé au logiciel de microscope.
  2. La coloration immunologique à l’or et la microscopie électronique
    1. Graines de 2 x 106 RAW 264.7 cellules de macrophages en plaques 6 puits.
    2. Difficulté des macrophages infecté par le BCG avec 4 % PFA pendant 4 h à température ambiante.
    3. Échantillons de laver deux fois avec du PBS.
    4. Intégrer des échantillons dans l’agarose de bas point de fusion de 4 % et déshydrater dans l’éthanol à 70 %.
    5. Transfert des échantillons de résine acrylique et polymériser à 50 ° C.
    6. Découper 60 sections nm avec un microtome et recueillir des sections sur les grilles de nickel.
    7. Étiqueter les échantillons avec 10 μg/mL d’anticorps avidine pendant 1 h à température ambiante ou à 4 ° C durant la nuit dans une solution d’incubation (BSA PBS et 0,1 %) et laver ensuite avec incubation solution conjugué or f2 ultra petite chèvre-anti-lapin IgG (1/20) pendant 1 h à la salle température dans la solution d’incubation.
    8. Laver les sections dans l’eau distillée, tache au glutaraldéhyde à 2 %, laver, sécher à l’air, puis examinez au microscope électronique à.

9. animale vaccination et traitement de l’orgue

Remarque : Toutes les mesures devraient être prises dans une armoire de sécurité biologique.

  1. Col biotinylé et protéine enduit bactéries à travers 271/2G aiguille 10 fois de faire suspension monocellulaire.
  2. Prendre 1 x 106 bactéries dans 100 μl de PBS exempte d’endotoxine et immuniser une souris C57BL/6 femelles (I-A,b, H - 2 Kb, vieux de 5 à 6 semaines) par voie sous-cutanée dans la peau du cou.
    1. Injecter des souris témoins avec 100 μl de PBS seul.
  3. Euthanasier souris immunisées 20 jours après la vaccination par inhalation de2 CO suivie par dislocation cervicale.
    1. Isoler la rate et transférez-le dans milieu RPMI.
  4. Purée de rate à travers un tamis de cellule de 70 µm avec un piston de seringue de 5 mL.
    1. Laver avec 5 mL de RPMI. Centrifugeuse (800 x g, 3 min) pour isoler une suspension monocellulaire.
    2. Appauvrissent la RBC avec kit de sélection positive de biotine de souris avec des cellules érythroïdes-Ter119/biotine Ab.
    3. Centrifuger et remettre en suspension les cellules dans 10 mL de RPMI complet (FCS de 10 %, 1 % L-glutamine, pénicilline 1 %, 1 % streptomycine et 50 μM 2-ME).

10. I-Ab tétramère de coloration pour déterminer les fréquences de spécifiques à l’antigène CD4+ des cellules T et intracellulaire Cytokine coloration pour déterminer des fréquences de spécifiques à l’antigène T cellules libérant Cytokines chez les animaux vaccinés

  1. Tétramère coloration
    1. Tache de splénocytes de contrôle et de la souris immunisées (~ 20 x 106 cellules) avec conjugué PE I-Ab-tétramères de323-339 OVA (dilution 1/12,5) pendant 1 h à 37 ° C dans le tampon de liaison (PBS avec FCS 2 % et 0,1 % NaN3).
    2. Ajouter AF647 CD4 Ab (01:25) et 7-AAD (pour détecter les cellules mortes) de splénocytes pendant 20 min à température ambiante.
    3. Analyser des échantillons par cytométrie en flux.
    4. Acquérir 500 000 événements dans la région de CD4 positif afin de déterminer la fréquence d’événements positifs tétramère.
      NOTE : Total splénocytes sont définies par la tache de dot SSC/FSC, des cellules vivantes par l’exclusion des événements positifs 7-AAD, ainsi que ses sous-ensembles CD4 par le déclenchement des événements positifs AF647.
  2. Fréquence de l’antigène spécifique Intracellular Cytokine libérant des lymphocytes T
    1. Transfert environ 1 × 107 splénocytes dans 4 mL de milieu RPMI complet en six plats avec ou sans ovules recombinantes (10 µg/mL) et incuber pendant 16 h.
    2. Traiter les cellules avec la bréfeldine A (1:1, 000) pendant 5 h supplémentaires.
    3. Laver avec du PBS et sous réserve de la cytokine intracellulaire coloration comme suit :
      1. Une coloration des échantillons de cellules avec PE-CD8 ou PE-Cy7-CD4 Ab (01:50 dans le tampon de liaison) à température ambiante pendant 30 min.
      2. Difficulté à 4 % PFA à température ambiante pendant 20 min.
      3. Permeabilize à l’aide de la solution de la perméabilisation, selon les instructions du fabricant.
      4. Laver les cellules et étiquette avec conjugué AF647 IFN-γ Ab (01:50) pendant 20 min à température ambiante.
      5. Laver les cellules et soumis à l’analyse en cytométrie en flux, comme décrit ci-dessus.

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Representative Results

Les procédures générales décrites ci-dessus, la faisabilité de BCG biotinylation surface et décoration avec l’antigène ovules de la mère porteuse a été examinée. L’immunogénicité de la BCG modifié a ensuite été testé in vivo. La surface bactérienne a été facilement étiquetée avec la biotine pour affichage rapide d’antigènes chimérique avidine sans modification décelable dans les phénotypes bactériennes. Le BCG modifié qui en résulte est efficacement ingéré par les cellules de présentation de l’antigène et peut induire une réponse immunitaire de propres ovules chez la souris.

Génération de monomère avidine fusion plasmides et protéines
Un expression plasmide p17-Avi a été généré pour être compatible avec la méthodologie de la passerelle à utiliser pour produire des protéines de fusion de monomère avidine. OVULES a été cloné en p17-Avi et exprimée chez e. coli, puis purifié et replié tel que décrit ci-dessus (Figure 1).

Biotine attache efficacement à la surface bactérienne et n’affecte pas la croissance bactérienne ou survie
Les bactéries ont été marquées avec différentes concentrations (0-1 mM) de la biotine et teinté d’examiner l’efficacité de surface biotinylation conformément aux protocoles ci-dessus. Analyse en cytométrie en flux a montré un changement total d’histogramme de fluorescence dans les bactéries marqués à la biotine de 0,5 mM (Figure 2), et cette concentration a été utilisée tout au long de cette étude pour générer des bactéries biotinylé. Ensuite, nous avons examiné l’effet de la modification de la surface bactérienne sur le phénotype bactérienne et trouvé que biotinylé et contrôle non traitée par le BCG affiche un profil de croissance similaires sur une période de 8 jours (Figure 3 a). BCG exprimant la luciférase (BCG-Luc)9 a servi à étudier la survie bactérienne dans les macrophages. Signaux de luminescence indicatif de viabilité bactérienne ont été enregistrées plus de 48 h les résultats obtenus ont montré des profils similaires de diminution progressive de la viabilité entre bactéries biotinylé et contrôle (Figure 3 b). En conclusion, ces données indiquent clairement que biotinylation surface bactérienne n’affecte pas la croissance bactérienne ou survie dans les macrophages, qui est important puisque l’augmentation de la survie dans les macrophages pourrait signifier une hausse dans la virulence bactérienne.

Efficacité de la décoration de surface bactérienne
Biotinylé bactéries ont été revêtus de peptide antigène ovules en fusion avec le monomère avidine, conformément aux protocoles ci-dessus. Analyse en cytométrie en flux a montré un niveau minimal d’ovules contraignant à des bactéries non-biotinylé (MFI = 8,31 ± 0,42, Figure 4 a, panneau supérieur) et des niveaux importants d’ovules liez aux bactéries biotinylé (MFI = ± 54.67 4,98) par rapport aux bactéries de contrôle (MFI = ± 5,92 0,22, figure 4 a, abaissez panneau).

Stabilité de la décoration de surfaces de BCG
Étant donné que les vaccins BCG vivants classiques sont formulés comme les poudres séchées, une importante question qui se pose au cours de cette étude était la stabilité du BCG modifié après que lyophilisation, reconstitution et conservation au réfrigérateur ou à température ambiante. Donc, nous avons examiné la surface affichage d’Avi-OVA au BCG lyophilisé Avi-OVA (surface décorée avec Avi-OVA) et fraîchement décoré Préparations bactériennes. Les résultats (Figure 4 b) ont montré que les niveaux d’Avi-OVA sur la surface bactérienne restent stable et détectable un mois après la lyophilisation et entreposage à température de la pièce par rapport à des préparations fraîches de BCG Avi-OVA, qui s’est avéré que cette surface méthode de décoration convient pour le développement de vaccins.

Phénotype macrophage n’est pas affectée par la décoration de surfaces bactérienne
Pour voir si cette méthode de décoration de surfaces interfère avec entrée bactérienne dans les cellules hôtes, nous avons utilisé les cellules RAW264.7 et DsRed bactéries9 pour effectuer un test de phagocytose décrit dans le protocole ci-dessus. La figure 4 montre que la surface bactérienne décoré par le BCG n’a pas eu interférence significative avec entrée bactérienne (22,5 ± 1,57 %) par rapport aux non couché type sauvage BCG (24.47 ± 1,18 %) indiquant que décoration de surfaces du BCG n’a aucun effet sur les macrophages phénotype.

Protéines de fusion avidine voyagent intracellulairement et localiser conjointement avec les molécules du CMH
Pour examiner le sort d’Avi-OVA-décorée BCG dans les macrophages, les cellules adhérentes de RAW ont été infectés et étudiés par microscopie de fluorescence, tel que décrit dans le protocole ci-dessus. Images obtenues (Figure 5 a) ont montré que Avi-OVA était non seulement présents sur la surface bactérienne, mais aussi détaché et translocation vers le cytoplasme lointain aux bactéries. Pour vérifier ce résultat, nous avons réalisé une expérience de coloration immunologique à l’or et les images obtenues montrent clairement que les antigènes Avi-OVA ne sont pas seulement présents sur la surface du BCG, mais peuvent aussi se détacher de la surface de BCG, traversent la membrane du phagosome et voyage vers le cytosol (Figure 5 b). Pour examiner plus avant si les bactéries Avi-OVA décorés étaient capables de transporter leur cargaison de protéine de surface dans la voie de présentation de l’antigène, macrophages étaient infectés par BCG Avi-OVA, tel que décrit dans le protocole et soumis à des analyses confocale. Résultats (Figure 6 a) ont montré qu’il y avait de co-localisation d’Avi-OVA avec des molécules d’I-A, suggérant que la protéine de fusion avidine détaché et transloqué aux compartiments de présentation de l’antigène où elles ont été chargées sur des molécules MHC II. Résultats ont également montré que peptide Avi-OVA se localise conjointement avec la classe I molécules dans les phagosomes BCG lorsqu’elle est colorée pour H-2_kb (Figure 6 b), qui a démontré qu’il n’y a potentielle présentation des antigènes Avi-OVA CD8+ T des cellules par le macrophage. Ces données indiquent qu’une fois la surface décorée bactéries pénètrent dans les macrophages, les antigènes sont en mesure de trafic vers les voies de présentation de l’antigène.

Surface des bactéries décorées sont entièrement immunogènes
Afin de déterminer si la surface décorée par le BCG est capable d’induire une réponse immunitaire spécifique en vivo, C57BL/6 souris ont été immunisés avec PBS seul (contrôle), BCG sauvage, Avi-OVA décoré par le BCG et BCG génétiquement transformées avec un plasmide d’exprimer une antigène OVA similaire. Souris immunisées ont été sacrifiés à 20 jours plus tard et les fréquences des ovules propres CD4+ T cellules et les cellules T propres ovules libérant les cytokines ont été détectés, selon le protocole. Résultats (Figure 7 a-B) ont montré une plus grande proportion des ovules propres CD4+réponse des lymphocytes T chez les animaux vaccinés par le BCG recouvert d’Avi-OVA comparée au BCG WT. BCG génétiquement modifiées pour exprimer les ovules ont montré une réponse immunitaire similaire au BCG AVI-OVA (Figure 7). Ces données ont montré que la méthode de décoration de surface bactérienne est capable d’induire une expansion considérable de l’antigène CD4 spécifiques+ T les cellules et le degré d’induction de réponse des lymphocytes T est comparable au BCG génétiquement modifié pour exprimer un OVA similaires antigène.

Étant donné que les cytokines intracellulaires sont également des indicateurs importants de l’antigène des lymphocytes T spécifiques aux réponses, cytokines intracellulaires (ICS) expériences de coloration ont été menées pour évaluer plus précisément les réponses immunitaires lymphocyte T en déterminant l’expression et la fréquence des cytokines effectrices chez les animaux vaccinés avec bactéries d’OVA-décorée et génétiquement transformé avec un OVA exprimant le plasmide. Nous avons examiné les niveaux de version d’IFN-γ, qui est un indicateur connu de réponse protectrice contre les bactéries intracellulaires11. Nous avons démontré que nous étions capables de détecter des niveaux similaires d’ovules propres IFN-γ libérant CD4+ cellules chez les animaux vaccinés avec bactéries surface décorée avec des ovules (BCG-Avi-OVA et BCG-p19-Avi-OVA) par rapport aux animaux vaccinés avec des bactéries génétiquement exprimant des ovules (BCG-p19-OVA) (Figure 8 a). Ce qui est important, nous avons également pu détecter des fréquences nettement plus élevés d’IFN-γ produisant CD8+ T cellules chez les animaux vaccinés par le BCG-Avi-OVA par rapport aux animaux vaccinés par le BCG génétiquement exprimant des ovules (Figure 8 b-C) qui montre que la biotine-avidine médiée par affichage surface de méthodologie de l’antigène peut efficacement remplacer la transformation de BCG avec des acides nucléiques.

Figure 1
Figure 1 : Construction d’une recombinaison clonage plasmide pour la production de protéines de fusion avidine. (A) un segment de gène codant pour l’avidine monomère a été synthétisé avec des sites de restriction Ndel et NotI et sous-cloné dans le pDEST17 entre l’histidine 6 x et la cassette de passerelle pour générer le plasmide p17-Avi. OVA peptide252-345 ADN séquences s’est arrêtés avec attB sites ont été clonés dans pDONR221. Par la suite, les gènes d’ovules ont été sous-cloné dans p17-Avi. Image édité et réimprimé avec la permission de PLOS ONE12. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : efficacité du BCG biotinylation. Le BCG a été biotinylé avec différentes concentration de NHS-SS-biotine pendant 30 min à température ambiante, puis étiquetés avec la Streptavidine-FITC et analysés par cytométrie en flux. Les résultats sont présentés comme des histogrammes d’intensité de fluorescence verte et l’insertion graphique représente la moyenne ± SEM des intensités de fluorescence moyenne (MFI) déduit de 3 expériences indépendantes. * P < 0,05 ; ** P < 0,01 ; P < 0,001. Image édité et réimprimé avec la permission de PLOS ONE12. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Biotinylation de surface par le BCG n’a pas affecté sa croissance ou sa survie dans les macrophages. (A) Biot-BCG et contrôle non sauvage BCG ont été cultivés en complet 7 H 9 médias et réplication a été suivie sur une période de 8 jours. Les résultats sont exprimés en courbes de croissance, c'est-à-direla moyenne absorbance à 600 nm en fonction du temps ± SEM de 3 expériences indépendantes. (B) les Macrophages ont été infectés avec Biot-BCG-Luc ou BCG-Luc sans étiquette de contrôle pour les périodes indiquées, puis cellule lysats ont été préparés et testés pour la bioluminescence détecter des bactéries viables. Les résultats sont exprimés en unités relatives de lumière la moyenne (RLU) ± SEM de 3 expériences indépendantes. Image édité et réimprimé avec la permission de PLOS ONE12. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Avi-OVA liant à Biot-BCG et sa stabilité. (A) Biot-dsRed-BCG (bactéries exprimant une fluorescence rouge, décrit précédemment9) et contrôle non-biotinylé dsRed-BCG ont été mélangés avec Avi-OVA à température ambiante pendant 1 h et l’étendue des ovules contraignant a été évalué par coloration de surface avec anticorps de lapin anti-avidine et anti-lapin de chèvre-FITC IgG (FL1). Des échantillons ont été lavés et analysés par cytométrie en flux. Les résultats sont présentés comme des histogrammes d’intensité de fluorescence verte et valeurs sont moyenne ± SEM de MFI de Biot-BCG-AviOVA liaison obtenu à partir de trois expériences indépendantes. Biot BCG lyophilisé (B) revêtus d’Avi-OVA et fraîchement Avi-OVA-Biot-BCG ont été étiquetés et analysés par cytométrie en flux, comme décrit dans A. Données présentées sont représentatifs de trois expériences indépendantes, et valeurs lient moyenne ± SEM des IMF d’Avi-OVA-Biot-BCG obtenus à partir de trois expériences indépendantes. (C) les macrophages RAW ont été infectés par DsRed BCG-Avi-OOVA ou DsRed-BCG pendant 24 h à 37 ° C. Échantillons ont été ensuite lavés, traités avec de la trypsine, fixe et analysés par FACS. Les résultats sont exprimés en histogrammes de fluorescence rouge, qui reflètent l’étendue de la phagocytose. Les valeurs indiquent le pourcentage moyen ± SEM des cellules, l’ingestion de BCG obtenu à partir de trois expériences indépendantes. Image édité et réimprimé avec la permission de PLOS ONE12. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Avi-OVA détaché de la surface de BCG et traversé la membrane phagosome vers le cytosol. (A) des cellules adhérentes RAW sur les lamelles ont été infectés par OVA-décorée dsRed-BCG pendant 24 h à 37 ° C et puis fixe/perméabilisées et colorées avec des anticorps de lapin anti-avidine et FITC-chèvre de anti-lapin IgG. Échantillons ont été montés sur lames de microscope et analysés par microscopie confocale numérique. Signaux rouges indiquent la position du BCG et signaux verts reflètent la localisation d’Avi-OVA. La ligne pointillée indique la limite de cellules macrophages et bas à droite panneau est un grossissement de 4 X de l’encart illustré à gauche. (B) les coupes minces de cellules RAW BCG-AviOVA infecté ont été fixés avec du paraformaldéhyde et incubés de manière séquentielle avec anticorps anti-avidine et anti-lapin de chèvre or Conjugué IgG de visualiser Avi-OVA et examinés au microscope électronique. Grossissement de 12 000 X s’affiche. Les flèches indiquent Avi-OVA dissociée de la surface de BCG et exporté au-delà de la membrane du phagosome. Les images montrées sont des représentants des deux expériences indépendantes. Image édité et réimprimé avec la permission de PLOS ONE12. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : antigène avidine-fusion localisée conjointement avec MHC classe II et molécules de classe I. Cellules adhérentes de BMA3.1A7, une lignée de cellules macrophages de souris, abritaient des ovules décoré GFP-BCG (exprimant vert fluorescent, décrites précédemment9) pendant 4 h puis stimulées avec IFN-γ pour 24 h. cellules et ont été puis fixe/perméabilisées et colorées avec anticorps de lapin anti-avidine, IgG anti-lapin Alexa 594 et Alexa 647 rat anti-souris-A (A) ou Alexa 647 rat anti-souris H-2_kb (B). Échantillons ont été montés sur lames de microscope et analysés par microscopie confocale numérique. Signaux verts indiquent la position du BCG-GFP et signaux rouges reflètent la localisation d’Avi-OVA. Signaux bleus indiquent la position du CMH de classe II ou molécules de classe I. La ligne pointillée indique la zone d’intérêt. Pointes de flèches indiquent co-localisation d’Avi-OVA avec les molécules du CMH. Les images sont des représentants de deux expériences indépendantes. Image édité et réimprimé avec la permission de PLOS ONE12. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : In vivo CD4+ réponse des lymphocytes T au BCG OVA-décorée. Souris C57BL/6 ont été injectées par voie sous-cutanée avec BCG surface décorée avec ovules, non modifiées par le BCG sauvage, PBS (contrôle), BCG génétiquement transformé pour exprimer des ovules (BCG-p19-OVA) ou transformées avec contrôle plasmidique et surface décorée avec Avi-OVA ( BCG-p19-AviOVA). Après une période de 20 jours, splénocytes ont été préparés à partir de la rate d’animaux euthanasiés et colorées au conjugué PE I-Ab-tétramères de323-339 OVA (A) suivie d’anticorps AF647-CD4 et 7-AAD. Des échantillons ont été analysés puis par cytométrie en flux. Les résultats sont exprimés en parcelles dot deux paramètres qui montrent les fréquences moyennes ± SEM du tétramère événements positifs dans le CD4+ population de deux animaux/groupe. Données présentées sont représentatifs des trois expériences indépendantes (un total de six souris ont été examinés avec les échantillons de cellules de chaque souris évalués en trois exemplaires). Les données dans les graphiques (B) sont exprimées en moyenne la valeur ± SEM du nombre absolu (sur un total de 500 000 événements) du tétramère OVA CD4 spécifiques+ dans les cellules de deux animaux/groupe et trois expériences indépendantes. * P < 0,05 ; ** P < 0,01 ; P < 0,001. Image édité et réimprimé avec la permission de PLOS ONE12. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : fréquences des cellules T, libération de cytokines en réponse à Avi-OVA enduits BCG-vaccination. Splénocytes de souris immunisées avec du PBS, BCG sauvage, surface de BCG WT orné d’Avi-OVA, BCG-p19-OVA et BCG-p19-AviOVA ont été stimulés par la protéine recombinante ovules pour 16 h, suivi d’un traitement de 5 h-période avec la bréfeldine A. Cells étaient alors lavés et teinté d’abord avec PE-Cy7 anti-CD4 (A) ou les anticorps anti-CD8 de PE (B) puis les anticorps anti-IFN-γ AF647. Cellules étaient ensuite lavés et analysés par cytométrie en flux. Les résultats sont exprimés comme deux paramètres dot complote pour montrer les fréquences moyennes ± SEM de sous-ensembles de cellules productrices de IFN-γ CD4+ et CD8+ des populations de deux animaux/groupe. Données présentées sont représentatifs des trois expériences indépendantes (un total de six souris ont été examinés avec les échantillons de cellules de chaque souris évalués en trois exemplaires). Les données dans les graphiques (C) sont exprimées sous forme de moyenne de ± nombre absolu et d’IFN-γ libérant CD4+ T cells (graphe de gauche) ou IFN-γ libérant CD8+ T (graphique de droit) des cellules de deux animaux/groupe et trois expériences indépendantes. * P < 0,05 ; ** P < 0,01 ; P < 0,001. Image édité et réimprimé avec la permission de PLOS ONE12. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Nous avons rapporté dans cette étude une approche non génétiques pour un affichage rapide et efficace des protéines exogènes sur surface de BCG pour ajouter des antigènes spécifiques ou des propriétés fonctionnelles spécifiques censées améliorer efficacement l’immunogénicité de la bactérie. Nous avons démontré que la surface des cellules BCG pourrait être facilement biotinylé pour la décoration de surface instantanée avec des protéines de fusion de l’avidine. La procédure totale peut être effectuée dans les 2 h, tandis que la transformation génétique et la sélection de clones positifs nécessite 2 à 3 mois de décalage dans le temps. Modification de surface n’affecte pas la survie et la croissance bactérienne. Bactéries orné d’antigène de substitution ovules ont été en mesure de livrer l’antigène dans la voie de présentation de l’antigène et induit la réponse immune spécifique in vivo, qui a été évaluée par des essais de cytométrie en flux-y compris MHC tétramère coloration et cytokine intracellulaire coloration (ICS). Plus important encore, des études in vivo montrent clairement que les bactéries décorés en surface étaient capables d’induire des niveaux similaires de la réponse immunitaire par rapport au BCG génétiquement modifiées aux antigènes express similaires.

L’avidine biotine interaction est l’interaction non covalentes plus forte connue dans la nature avec un Kd de 10−15 M13. Il n’est pas seulement un outil utile, couramment utilisé dans la recherche biologique14, mais a récemment été démontré s’appliquer au cancer therapy15,16. Dans cette étude, une triple mutation (N54A, W110K et N17I) a été appliquée à avidine sauvage pour convertir une forme de monomère avidine qui a réduit significativement l’affinité de l’avidine-biotine de tétramère avidine (Kd= 10−7 M) et le lie réversible à la biotine. Ce monomère avidine a servi à élaborer un plasmide p17-Avi qui est compatible avec la recombinaison Gateway clonage (Invitrogen) pour une expression rapide en une seule étape d’une protéine d’intérêt. Cette nouvelle version de monomère avidine présente plusieurs avantages, y compris prévention grand bouquet bactérienne agrégation transitoire/réversible bactérienne surface affichage et des protéines d’intérêt. Donc, une fois ingéré par la cellule hôte, protéines Avi-fusion peuvent détacher de la surface des bactéries biotinylé et trafic intracellulaire. Enfin, les mutations convertissent avidine dans un formulaire non glycosylée qui pourrait s’appliquer dans les levures ou plantes transgéniques17,18 , pour la production de grandes quantités de protéines de fusion avidine dans systèmes eucaryotes. Cette forme de monomère avidine a été choisie au lieu d’une version de streptavidine monomère (mSA)19, qui a des séquences de la Streptavidine et rhizavidin et a une affinité plus élevée (Kd de 10−9 M) par rapport à mAvidin. Des essais préliminaires, protéine chimère mSA avait une efficacité de liaison beaucoup plus faible aux bactéries biotinylé par rapport à la protéine chimère mAvidin. Cette étude, reposait donc sur mAvidin, mais streptavidine monomère ou autres formes de streptavidine/avidine serait également une possibilité pour d’autres applications.

Mise en œuvre réussie des protocoles décrits dépend de la qualité de la protéine de fusion généré et l’efficacité de la biotinylation surface bactérienne. Protéine éluée de Avi-étiquetée devrait être hors salé et tampon échangés en PBS à l’aide du concentrateur de protéine de poids moléculaire. Précipitations peuvent se produire à des facteurs de concentration élevée de certaines protéines, donc facteur de concentration doit être testé et déterminée à l’aide de petites quantités de protéine éluée au premier, par exemple, 0,5 à 1 mL de corps d’inclusion solubilisée dilués dans 20 mL de PBS et puis concentré. Il est également important de maintenir la température de la protéine autour de 4 ° C durant tout le processus pour éviter la précipitation.

Afin d’améliorer l’efficacité du biotinylation surface bactérienne, biotine Sulfo-NHS SS doit être stocké dans son emballage d’origine dans l’obscurité à 4 ° C. Le réactif est extrêmement humidité sensible ; par conséquent, les flacons contenant le réactif doivent être équilibrés à température ambiante avant ouverture. Aussi, solution mère de biotine (10 mM) doit être faite immédiatement avant utilisation, car la portion de la NHS-ester hydrolyse et deviennent non réactif très rapidement. Solution mère de biotine ne peut pas être stockée et réutilisée ; un nouveau flacon biotine est nécessaire pour chaque expérience biotinylation. Pour de meilleurs résultats, des cultures fraîches de BCG, les supports neufs, ainsi que des tampons fraîches sont recommandés. Comme mentionné dans le protocole, biotinylé enduit BCG pourrait être lyophilisés et conservés pendant au moins 30 jours sans affecter la qualité du revêtement de la surface. Ceci est particulièrement utile lors de l’envoi ou le transfert des échantillons d’un endroit à un autre ou lorsque vous effectuez des expériences de longue durée.

Cette méthode de décoration de surfaces de BCG offre également d’autres possibilités passionnantes pour analyser et évaluer l’immunogénicité des vaccins nouvellement développé de façon rapide et précise. L’objectif principal de nouveaux vaccins contre la tuberculose est d’induire les cellules de type TH1 telles que CD4+ et CD8+ T des cellules qui jouent un rôle important dans la protection contre la tuberculose. Le système de l’avidine-biotine développé dans cette étude offre un outil très utile pour évaluer les réponses de ces cellules T. Cette nouvelle technologie d’afficher rapidement les protéines/antigènes recombinants sur surface BCG représente un excellent outil pour évaluer rapidement et avec précision l’efficacité protectrice de nombreuses protéines immunogènes (p. ex., sécrétée spécifiques tuberculosis les protéines) et peuvent donc être traduits dans le développement de vaccins efficaces.

En ajustant et en variant la concentration de protéines Avi-fusion sur la surface bactérienne, un autre avantage de cette méthode consisterait à afficher simultanément les antigènes différents d’intérêt sur la surface bactérienne pour maximiser l’efficacité du vaccin. Puisque des études ont montré que le BCG interfère avec fonctions de macrophage importantes telles que phagosome maturation20,21 et de présentation de l’antigène21, une possibilité d’améliorer encore le BCG pourrait être décoration surface BCG avec une combinaison de facteurs connus pour accélérer la maturation du phagosome ainsi que des antigènes d’intérêt.

Certaines limitations de cette technologie comprennent l’exigence de la production à grande échelle des protéines recombinantes, ce qui pourrait être difficile et coûteux dans les zones à faible revenu. En outre, produisant dur pour purifier les protéines nécessiterait dépannage et optimisation. Toutefois, ces limitations peuvent être contournées par l’amélioration des technologies de production de protéines recombinantes. Une autre limitation inclut la possibilité que naturellement naturels anticorps anti-avidine communes en laboratoire animaux et les humains22 susceptibles d’entraver l’utilisation de l’avidine à des fins thérapeutiques. Cependant, d’autres laboratoires ont testé l’innocuité et l’efficacité de la thérapie de l’avidine et ont montré que sécurité et l’efficacité de l’avidine n’étaient pas significativement affectés par son immunogénicité23. Fait intéressant, convertissant l’avidine tétramère sauvage en une forme monomérique significativement diminué son immunogénicité24.

Pour résumer, cette nouvelle technologie utilisant un système avidine-biotine afin d’améliorer l’immunogénicité de BCG via une rapide et reproductible non génétique bactérienne modification de surface avec des protéines d’intérêt peut remplacer avec succès de transformation traditionnelle du BCG avec des plasmides codant l’antigène. En outre, cette nouvelle méthode peut non seulement faciliter l’amélioration du vaccin BCG actuel, mais peut aussi fournir une nouvelle plate-forme pour une évaluation rapide de pratiquement n’importe quel potentiel antigène ou protéines normalement difficiles à exprimer génétiquement au BCG, au large applications dans le développement de vaccins TB.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions le Dr R Stokes pour la souche de BCG Pasteur et A. Talal pour le support technique. Nous remercions également GenScript pour aide à la synthèse de gènes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endotoxin-free RPMI 1640 StemCell Technologies  36750
Sulfo-NHS SS biotin Thermo Fisher  21328
FITC-conjugated streptavidin Sigma-Aldrich S3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer  MBL International  TS-M710-1
7-AAD BD Pharmingen 559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin  Clontech 635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
AF647 rat anti-mouse IFN-g BD Bioscience  557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-E BD Bioscience  562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  552775
PE rat anti-mouse CD8 Ab BD Bioscience  561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kb BD Bioscience 562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibody Thermo Fisher 31635
AF 647 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG Electron Microscopy Sciences 25100
Middlebrook 7H9 broth BD Diagnostic Systems 271310
OADC BD Diagnostic Systems B11886
Tween 80 Sigma-Aldrich P1379
RAW 264.7 murine macrophage cell lines American Type Culture Collection
pDEST17 plasmid  Invitrogen 11803012
pUC57-OVA plasmid  GenScript SD1176
BP clonase  Invitrogen 11789020
LR clonase  Invitrogen 11791043
pDONR221 plasmid Invitrogen 12536017
Ni-NTA columns  Qiagen 31014
Pierce protein concentrators  Thermo Fisher  88527
Flurosave Calbiochem-Novabiochem 345789
Axioplan II epifluorescence microscope Carl Zeiss Inc
CCD digital camera  Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope  FEI Company G2 200Kv 
70μm Falcon cell strainer  Thermo Fisher  87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit  StemCell 18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody BioLegend 116203
Brefeldin A BD Pharmingen 555029
Cytofix/Cytoperm kit  BD Pharmingen 554714
Bright-Glo Luciferase assay system Promega e2620
Turner Biosystem luminometer  Promega TD-20/20
Leica EM UC6 microtome  Leica Microsystems UC6
Novalyphe NL 500 freeze dryer Savant Instruments  NL 50
Wheaton boroscilicate glass vials Wheaton  VWR 66011-675

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References

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Expression des antigènes exogènes dans le <em>Mycobacterium bovis</em> BCG par l’intermédiaire de décoration de Surface Non génétiques avec le système avidine-biotine
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