Summary
En ny teknikk for rask antigen visning på en bakteriell overflate presenteres, som innebærer overflate biotinylation etterfulgt av eksponering for proteiner interesse sammensmelting med monomerisk avidin. Lasting BCG valgte antigener vellykket forbedrer sin immunogenisitet, antyder at landtransport dekorasjon kan erstatte tradisjonelle genetisk tilnærminger.
Abstract
Tuberkulose (TB) er en alvorlige infeksjonssykdommer og kun tilgjengelig vaksine M. bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) er trygg og effektiv beskyttelse mot barn alvorlig TB hjernehinnebetennelse og noen former for spres TB, men ikke klarer å beskytte mot lunge TB, som er den mest utbredte sykdommen. Lovende strategier for å forbedre BCG nå stole på transformasjonen med gener som koder immunodominant M. tuberkulose (Mtb)-spesifikke antigener og/eller complementation med gener co-faktorer som vil stimulere antigen-koding presentere celler. Store begrensninger på disse inkluderer lav effektivitet, lav stabilitet og usikker nivået av sikkerhet for uttrykket vektorer. I denne studien presenterer vi en alternativ tilnærming til vaksine forbedring, som består av BCG complementation med ytre proteiner rundt på overflaten av bakterier, i stedet for transformasjon med Plasmidene koding tilsvarende gener. Først proteiner av interesse uttrykt i fusion med monomerisk avidin i standard E. coli uttrykk systemer og deretter brukes til å dekorere overflaten av biotinylated BCG. Dyreforsøk bruker BCG overflate dekorert med surrogat ovalbumin antigen viser at endrede bakterien er fullt immunogenic og kan indusere bestemt T celle svar. Dataene som presenteres her sterkt støtte helt, en roman og effektiv metode for omforme den gjeldende BCG-vaksinen som erstatter arbeidskrevende konvensjonell tilnærming til complementation med ytre nukleinsyrer.
Introduction
Ulike strategier har vært foreslått å erstatte gjeldende TB vaksinen BCG, inkludert protein adjuvant systemer, viral vectored teknologier, dempes live M.tb stammer og genmodifiserte BCG stammer, enten for å innføre gener over uttrykke BCG antigener som ikke er tilstrekkelig uttrykt under infeksjon1 eller Mtb-spesifikke antigener ikke finnes i BCG2. Genteknologi, men står overfor mange barrierer inkludert usikker sikkerhet, den tidkrevende prosessen og lav effektivitet av uttrykket vektorer4,5. Når det gjelder å forbedre BCG, er alternativ metode nødvendig for å forbedre immunogenisitet uten behov for usikker genetisk alternations.
I denne studien introduserer vi en ny strategi for visning av rekombinante proteinene rundt på BCG cellens overflate som er basert på den velkjente høy affinity avidin interaksjonen med biotin. Denne fremgangsmåten kan rask og reproduserbar vedlegg av rekombinant avidin fusion protein på overflaten av biotinylated BCG, som muliggjør bred manipulasjoner av BCG å oppnå maksimal forbedring av effekt samtidig opprettholde sin utmerkede sikkerhet registrere, observert over tiår med bruk.
Avidin affinitet for biotin er ekstremt høy (Kd = 10−15 M) og når dannet, biotin-avidin komplekset er meget stabil og kan bare bli forstyrret under denaturing forhold6. Men for denne type samhandling som et gen overføring metoden alternativ, er langsiktig men reversibel visning av rekombinante proteinene nødvendig. Derfor introduserte vi her en lav affinitet monomerisk avidin (Kd = 10−7 M) som fører til reversibel utgivelsen av protein fra overflaten dekorert BCG når inntatt i antigen presentere celler. For å gi et bevis på konseptet, testet vi denne metoden bruker en monomerisk avidin chimeric protein tilsvarer en surrogat antigen avledet fra ovalbumin (OVA)7,8. Resultatene viste at celleoverflaten BCG kan være enkelt og raskt dekorert med monomerisk avidin fusion proteiner og at denne bindingen til BCG overflaten er stabil og reproduserbar uten synlig endringer i bakterievekst og overlevelse. Også vi fant at BCG dekorert med monomerisk avidin smeltet sammen med OVA (AviOVA) kan indusere en immunrespons lik som indusert av BCG genetisk uttrykke samme antigen både i vitro og i vivo. Denne teknologien av reversibel proteiner av interesse på bakteriell overflaten er derfor en effektiv erstatning av tradisjonelle genet overføring og gir en plattform for bred manipulasjoner av BCG og videre søknader i vaksine utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrene ble opprettholdt i henhold til protokoller godkjent av Animal Care og bruk komiteer ved University of British Columbia. Eksperimenter ble godkjent av Animal Care og bruk komiteer og utført i henhold til kanadiske Rådet for dyr omsorg retningslinjer. Velferd er dyr forsikring A11-0247.
1. generasjon monomerisk Avidin Fusion proteiner uttrykke plasmider
- Sub klone monomerisk avidin sekvens12 i pDEST17 plasmider mellom "CTC" og "GAA" områder som tilsvarer 133-134bp. (dvs., mellom 6-histag og pDEST17 Attr1 rekombinasjon området) å få p17-Avi.
Merk: Monomerisk avidin DNA sekvensen nedenfor. Tre mutasjoner i vill-type Avidin å få monomerisk avidin vises i uthevet tegn.
gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
acaaGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga - Utforme primere flankert med AttB1 og AttB2 tilsvarer OVA polypeptid757-1035 (enb- og H-2_Kb-begrenset epitopes) DNA sekvensen. Primer sekvensene er: Attb1-OVA
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT og Attb2-OVA
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 og Attb2 sekvenser er uthevet).- PCR-forsterke OVA polypeptid757-1035 DNA sekvens med primerne ovenfor pUC57-OVA plasmider som en mal.
- Klone PCR-produkter i pDONR-221 gjennom en områdespesifikk i vitro rekombinasjon reaksjon (f.eksBP Clonase) å få pDONR-OVA.
- Overføre genet av interesse i p17-Avi bruke LR Clonase reaksjonen for å oppnå p17-Avi-OVA.
Merk: For detaljer om BP og LR rekombinasjon kloning, se produsentens håndbok.
2. monomerisk Avidin Fusion Protein uttrykk, rensing og Refolding
- Forvandle p17-Avi-OVA plasmider E. coli BL21 og indusere 250 mL av E. coli BL21 kultur med IPTG (0.1 M) for 3t på 37 ° C.
-
Lysis av bakterier og inkludering organer Solubilization
- Pellets til 250 mL indusert BL21 kultur av 30 min av sentrifugering 4000 x g og 4 ° C.
- Samle pellets i 10 mL lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 M Guanidine-HCL, pH 1.5-2.5) og Inkuber i 15 min på 95 ° C. Ruge over natten i romtemperatur på et rotator.
- Sentrifuger 30 min på 15.000 x g og 4 ° C og samle nedbryting.
-
Rense Avi-OVA fra nedbryting (Solubilized inkludering organer brøkdel) med Ni-NTA kolonner.
- Fortynne inkludering kropper 1:2 med lyseringsbuffer.
- Bruk 4 mL av Ni-NTA harpiks per 250 mL av kultur-avledet inkludering organer.
- Vask 3 x med 10 mL lyseringsbuffer (pH 7.0).
- Elute med 10 mL elueringsbufferen (lysis buffer pH 7.0 med 250 mM imidazole).
- Refold elut protein av gradvis fortynning (1:10) og rask vortexing i Tris buffer (pH 7.5) inneholder 1 mM DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0,5 mM Tween 80, 500 mM arginine og 200 mM NaCl i 30 min ved romtemperatur.
- De salt og buffer exchange refolded protein fra Tris buffer i PBS med protein konsentratorer i henhold til produsentens protokoller.
- Fjern oppsamlinger med sentrifugering i 30 min 3500 x g og 4 ° C, og lagre dele løselig protein på 20 ° C.
3. Biotinylation av BCG celleoverflaten
- Vokse BCG i Middlebrook 7T 9 buljong med 10% OADC (oljesyre, albumin og druesukker løsning) og 0,05% Tween 80 på 37 ° C på en shaker plattform på 50 rpm til OD = 0,5-1.
Merk: BCG er en biosafety nivå 2 patogen alle eksperimenter angående BCG bør gjøres i en biosafety kabinett med riktig personlig verneutstyr. - Vask 109 BCG 3 ganger med 500 µL av iskalde endotoxin gratis PBS pluss 0,1% Tween80 (PBST) (pH 8.0). Avbryte BCG pellet sterilt endotoxin gratis PBS.
-
Forberede 1 mL av 10 mM Sulfo-NHS SS biotin i sterilt filtrert vann umiddelbart før bruk.
- Inkuber bakterier med 1 mL av 0,5 mM til Sulfo-NHS SS biotin ved romtemperatur for 30 min.
-
Vask merket bakterier 3 ganger med 500 µL av glasur kald PBST å fjerne ikke-reagert biotinylation reagens.
- Nytt avbryte pellet 1 mL av PBST.
-
For å vurdere biotinylation effektivitet, beis 108 biotinylated BCG med Streptavidin-FITC (1: 100, 25 µL) ved romtemperatur for 20 min.
- Inkuber farget bakterier i 1 mL av 2% PFA for 20 min ved romtemperatur og deretter undersøke nivåer av biotinylation av flyt cytometri analyse.
4. fenotypen av Biotinylated mykobakterier: vekst og overlevelse
-
Vokse BCG stammer i Middlebrook 7T 9 buljong med 10% OADC (oljesyre, albumin og druesukker løsning) og 0,05% Tween 80 på 37 ° C på en shaker plattform på 50 rpm.
- Registrere optisk densitet (OD600) av bakteriell kultur over en 8-dagers periode.
-
Bruk BCG-Luc (beskrevet tidligere9) for å oppdage overlevelse av bakterier i makrofager.
- Infisere RAW264.7 celler med biotinylated BCG-Luc (MOI 10:1) eller ubehandlet BCG-Luc (kontroll) og ruges på 37 ° C over en 48 timer tidsrom.
- Vask cellen monolayers og deretter lyse med 0.025% SDS å løslate inntatt bakterier.
- Måle bioluminescens produksjon med Luciferase analysen og luminometer.
Merk: Luminescence signalet er indikativ av bakteriell levedyktighet. Se produsentens håndbok for detaljer om luciferase analysen.
5. binding av monomerisk Avidin-Fusion Protein Biotinylated BCG overflaten
- Bland 5 x 108 biotinylated BCG med Avi-protein (10 μg/mL endelig i PBS-T) 1t ved romtemperatur på shaker plattform.
- Vask bakterier 3 ganger med 500 µL av glasur kald PBST og beis med kanin anti-avidin antistoff (Ab) (1: 100 fortynning, beskrevet tidligere10) for 20 min ved romtemperatur og deretter med FITC konjugert geit anti-kanin IgG Ab i samme vilkår.
- Vask bakterier 3 ganger med 500 µL av PBST og analysere av flowcytometri å vurdere omfanget av landtransport dekorasjon.
6. lyophilization av mykobakterier
- Biotinylate bakterier etter trinn 3.1-3.4 og pels biotinylated bakterier med Avi-OVA etter trinn 5.1.
- Aliquot biotinylated og belagt bakterier (108), vask med PBS og å suspendere i 0,5 mL lyophilization media (25% Sauton medium, 75% H2O og 1,5% Na-glutamat).
- Overføre bakterier til hetteglass og fryse i et-80 ° C fryseren over natten.
- Lyophilize fylles og frosne hetteglass 24 h med en fryse tørketrommel.
- Lagre tørket prøver ved romtemperatur og gjeninnføre i PBS ved behov.
- Gjenta trinn 3.5 å evaluere biotinylation og overflate belegg stabilitet.
7. fagocytose analysen
- Vokse rå 264.7 macrophage celler i 10 cm diameter kultur retter i DMEM middels med 5% FCS, 1% hver av L-glutamin, HEPES, ikke-essensielle aminosyrer, og penicillin og streptomycin til 70-80% confluency.
- Frø 2 x 106 rå 264.7 macrophage celler i en 6-vel plate. Lar celler å følge over natten på 37 ° C og 5% CO2.
- Generere DsRed BCG (beskrevet tidligere9) innredet med Avi-OVA (DsRed BCG-Avi-OVA) i trinn 3.1-3.4 og 5.1.
- Infisere rå celler med DsRed BCG-Avi-OVA eller ubehandlet DsRed BCG på MOI 20:1 24 h på 37 ° C.
- Vask celler tre ganger og trypsinize bruker 1 mL av 0,25% trypsin ved 37 ° C i 10 min for å fjerne delvis frittliggende bakterier.
- Fikse i 2,5% PFA i PBS for 20 min ved romtemperatur.
- Vask 3 x med PBS og analysere av flowcytometri.
8. intracellulær smugling av OVA dekorert Biotinylated BCG i makrofager
-
Fluorescens mikroskopi
- Frø 3 x 105 rå 264.7 macrophage celler i coverslips i en 24-vel plate. Lar celler å følge over natten på 37 ° C og 5% CO2.
- Infisere macrophage celler med mykobakterier (MOI 10:1) i vedlikehold media uten antibiotika på 37 ° C og 5% CO2 4 24 h.
- Vask celler og trypsinize for å fjerne overflaten festet, ikke svelget bakterier som i trinn 7.5.
- Fastsette infiserte celler i 2,5% PFA i PBS for 20 min ved romtemperatur etterfulgt av 3 vasker med PBS.
- Permeabilize celler i blokkering/permeabilization buffer (0,1% Triton X-100, 3% BSA i PBS) for 20 min ved romtemperatur.
- Bruk spesifikt antistoff av interesse (f.ekskanin anti-avidin Ab) på 10 μg/mL i permeabilization bufferen for 20 min ved romtemperatur etterfulgt av sekundær antistoff (f.eksFITC-geit anti-kanin IgG) for 20 min.
- Vask cellene 3 x med PBS, en gang med vann og montere på lysbilder i 10 μL vandig montering medium å minimere fluorescens photobleaching.
- Undersøke lysbilder av digital AC confocal mikroskopi bruker en epifluorescence mikroskop utstyrt med 63 x / 1.4 Plan-Apochromat mål. Ta bilder med et digitalt kamera koblet til mikroskopet programvaren.
-
Immunogold flekker og elektronmikroskop
- Frø 2 x 106 rå 264.7 macrophage celler i 6-og plater.
- Fastsette BCG infisert makrofager med 4% PFA 4 h i romtemperatur.
- Vask prøver to ganger med PBS.
- Bygge inn eksempler på 4% lavt Smeltepunkt agarose og tørke i 70% etanol.
- Overføre prøver til akryl harpiks og danner på 50 ° C.
- Kuttet ut 60 nm deler med en mikrotom og samle deler på nikkel nett.
- Etiketten prøver med 10 μg/mL avidin antistoff 1t ved romtemperatur eller 4 ° C over natten i inkubasjon løsning (PBS og 0,1% BSA) og deretter vaske med inkubering løsning gull-konjugerte F(ab')2 av ultra liten geit-anti-rabbit IgG (1/20) 1t på rommet temperaturen i inkubasjon løsning.
- Vask inndelinger i destillert vann, stain i 2% glutaraldehyde, vaske igjen lufttørke og undersøke med elektronmikroskop.
9. dyret immunisering og orgel behandling
Merk: Alle trinnene bør gjøres i en biosafety kabinett.
- Pass biotinylated og protein belagt bakterier gjennom 271/2G nål 10 ganger å enkelt celle suspensjon.
-
Ta 1 x 106 bakterier i 100 μL endotoxin-fri PBS og immunize en kvinnelig C57BL/6 mus (enb, H - 2 Kb5-6 uke gamle) subcutaneously i scruff i halsen.
- Injisere kontroll mus med 100 μL PBS alene.
-
Euthanize vaksineres mus 20 dager etter immunisering av CO2 innånding etterfulgt av cervical forvridning.
- Isolere milten og overføre den til RPMI media.
-
MOS milt gjennom en 70 µm celle sil med en 5 mL sprøytestempelet.
- Vask med 5 mL av RPMI. Sentrifuger (800 x g, 3 minutter) for å isolere en enkeltcelle suspensjon.
- Tømme RBC med musen biotin positiv utvalg kit med biotin-Ter119/Erythroid celler Ab.
- Sentrifuger og å suspendere cellene i 10 mL av komplett RPMI (10% FCS 1% L-glutamin, 1% penicillin, 1% streptomycin og 50 μM 2-ME).
10. enb tetramer flekker finne ut frekvenser av Antigen-spesifikke CD4+ T celler og intracellulær cytokin flekker å finne frekvenser av Antigen-spesifikke T celler ut cytokiner i vaksineres dyr
-
Tetramer flekker
- Flekk splenocytes av kontroll og vaksineres mus (~ 20 x 106 celler) med PE-konjugerte enb-OVA323-339 tetramers (1/12,5 fortynning) 1t på 37 ° C i bindingen buffer (PBS med 2% FCS og 0,1% NaN3).
- Legge til AF647 CD4 Ab (1:25) og 7-AAD (å oppdage døde celler) i splenocytes for 20 min ved romtemperatur.
- Analysere prøver av flowcytometri.
- Få 500.000 hendelser i regionen CD4 positivt å bestemme frekvensen av tetramer positive hendelser.
Merk: Totalt splenocytes er definert av SSC/FSC dot blot, levende celler av utelukkelse av 7-AAD positive hendelser og CD4 delsett av gating AF647 positive hendelser.
-
Hyppigheten av Antigen bestemt intracellulær cytokin slippe T celler
- Overføre ca 1 × 107 splenocytes i 4 mL komplett RPMI medium i seks brønnslisser plater med eller uten rekombinant OVA (10 µg/mL) og Inkuber 16 h.
- Behandle celler med Brefeldin A (1:1, 000) for en ekstra 5 h.
- Vask med PBS med intracellulære cytokin flekker som følger:
- Stain celle utvalg med PE-CD8 eller PE-Cy7-CD4 Ab (1:50 i bindingen buffer) i romtemperatur i 30 min.
- Fikse i 4% PFA ved romtemperatur for 20 min.
- Permeabilize bruker permeabilization løsning, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Vask celler og etiketten med AF647-konjugerte IFN-γ Ab (1:50) for 20 min ved romtemperatur.
- Vask celler og underlagt flyt cytometri analyse som beskrevet ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med den generelle prosedyrer beskrevet ovenfor, ble muligheten for BCG overflate biotinylation og dekor med surrogat antigen OVA undersøkt. Immunogenisitet av den endrede BCG var testet i vivo. Bakteriell overflaten var enkelt merket med biotin for rask visning av avidin chimeric antigener uten synlig endringer i bakteriell fenotyper. Den resulterende endret BCG er effektivt ingested av antigen presentasjon celler og kan indusere en egg-spesifikk immunrespons i mus.
Generasjon monomerisk avidin fusion plasmider og proteiner
Et uttrykk plasmider p17-Avi ble generert for å være kompatibel med Gateway metodikk brukes til å produsere monomerisk avidin fusion proteiner. OVA ble klonet i p17-Avi og uttrykt i E. coliog renset og refolded som beskrevet ovenfor (figur 1).
Biotin legger effektivt bakteriell overflaten og påvirker ikke bakterievekst eller overlevelse
Bakterier ble merket med ulike konsentrasjoner (0-1 mM) til biotin og flekker undersøke effektiviteten av overflaten biotinylation ifølge protokoller over. Flyt cytometri analyse viste et totalt skifte av fluorescens histogrammet i bakterier merket med 0,5 mM biotin (figur 2), og denne konsentrasjonen ble brukt gjennom hele denne studien til å generere biotinylated bakterier. Neste, vi undersøkte effekten av bakteriell overflaten endring på bakteriell fenotypen og fant at biotinylated og kontroll ubehandlet BCG vises en lignende vekst profil over en 8-dagers periode (figur 3A). BCG uttrykke luciferase (BCG-Luc)9 ble brukt til å undersøke bakteriell overlevelse i makrofager. Luminescence signaler indikativ av bakteriell levedyktighet ble registrert over 48 h. resultatene viste tilsvarende profiler av gradvis levedyktighet nedgang mellom biotinylated og kontroll bakterier (figur 3B). Avslutningsvis viser disse data klart at bakteriell overflate biotinylation ikke påvirker bakterievekst eller overlevelse i makrofager, som er viktig siden økt overlevelse i makrofager kan bety en økning i bakteriell virulens.
Effektiviteten av bakteriell landtransport dekorasjon
Biotinylated bakterier ble belagt med OVA antigen peptid i fusion med monomerisk avidin, i henhold til protokoller over. Flow cytometri analyse viste minimale nivåer av OVA binding til ikke-biotinylated bakterier (MFI = 8.31 ± 0.42, figur 4A, toppanelet) og betydelige nivåer av OVA bindende for biotinylated bakterier (MFI = 54.67 ± 4,98) sammenlignet med kontrollen bakterier (MFI = 5.92 ± 0.22, figur 4A, lavere panel).
Stabiliteten av BCG landtransport dekorasjon
Siden konvensjonelle live BCG vaksiner er formulert som tørket pulver, var et viktig spørsmål som oppsto under denne studien stabiliteten av endrede BCG etter Frysetørring, rekonstituering og lagring på kjøling eller romtemperatur. Derfor vi undersøkte overflate vise Avi-OVA i lyofilisert BCG Avi-OVA (overflaten dekorert med Avi-OVA) og i innredet nykvernet bakteriell forberedelser. Resultatene (figur 4B) viste at nivåer av Avi-OVA på bakteriell overflaten forble stabilt og sporbar en måned etter lyophilization og lagring i romtemperatur sammenlignet med friske BCG Avi-OVA preparater, som viste at dette overflate dekorasjon metoden er egnet for vaksineutvikling.
Macrophage fenotypen påvirkes ikke av bakteriell landtransport dekorasjon
For å se om denne landtransport dekorasjon metodikken gripe inn med bakteriell inn i verten cellene, brukte vi RAW264.7 celler og DsRed bakterier9 til å utføre en fagocytose analysen beskrevet i protokollen ovenfor. Figur 4C viste bakteriell overflaten dekorert BCG har ikke betydelige forstyrrelser med bakteriell oppføring (22.5 ± 1.57%) sammenlignet med ubestrøket vill type BCG (24.47 ± 1,18%) som angir at landtransport dekorasjon av BCG har ingen innvirkning på macrophage fenotypen.
Avidin fusion proteiner reise intracellulært og co lokalisere med MHC molekyler
For å undersøke Avi-OVA-dekorert BCG er skjebnen i makrofager, var tilhenger rå celler infisert og undersøkt av fluorescens mikroskopi, som beskrevet i protokollen ovenfor. Profilen oppnådd (figur 5A) viste at Avi-OVA var ikke bare på bakteriell overflaten, men også frittliggende og translocated til cytoplasma Fjern til bakterier. For å bekrefte dette resultatet, vi utført en immunogold flekk eksperiment og bilder innhentet tydelig viste at Avi-OVA antigener er ikke bare på BCG overflaten, men kan også koble fra BCG overflaten, krysse phagosomal membranen og reise mot stoffer (figur 5B). For å ytterligere undersøke om Avi-OVA dekorert bakterier var i stand til å levere frakten overflaten protein til antigen presentasjon veien, var makrofager infisert med Avi-OVA BCG, som beskrevet i protokollen, og utsatt for AC confocal analyser. Resultater (figur 6A) viste at det var colocalization av Avi-OVA med en molekyler, antyder at avidin fusion protein frittliggende og translocated til antigen presentasjon rom hvor de ble lastet opp på MHC-II molekyler. Resultatene viste at Avi-OVA peptid co regionaliserer med klasse I molekyler innenfor BCG phagosomes når farget for H-2_kb (figur 6B), som viste at det er potensielle presentasjon av Avi-OVA antigenet CD8+ T-cellene ved den macrophage. Disse data tyder på at når overflaten dekorert bakterier inn makrofager, antigener kan trafikk til antigen presentasjon veier.
Overflaten dekorerte bakterier er fullt immunogenic
Undersøke om overflaten dekorerte BCG er i stand til å indusere en spesifikk immunrespons i vivo, C57BL/6 mus ble vaksinert med PBS alene (kontroll), vill-type BCG, Avi-OVA dekorert BCG, og BCG genetisk forvandlet en plasmider å uttrykke en lignende OVA antigen. Vaksineres mus ble ofret 20 dager senere og frekvenser av OVA-spesifikke CD4+ T celler og OVA-spesifikke T celler ut cytokiner ble oppdaget, i henhold til protokollen. Resultater (figur 7A-B) viste en større andel av OVA-spesifikke CD4+T celle respons i dyr vaksinert med BCG belagt med Avi-OVA sammenlignet med BCG WT. BCG genetisk endret uttrykke OVA viste en lignende immunrespons til BCG AVI-OVA (figur 7). Disse data viste at metoden bakteriell landtransport dekorasjon er i stand til å indusere en betydelig utvidelse av antigen bestemt CD4+ T celler og graden av T celle respons induksjon er sammenlignbare med BCG genetisk konstruert for å uttrykke en lignende OVA antigen.
Siden intracellulær cytokiner er også viktige indikatorer for antigen-spesifikke T celle svar, ble intracellulær cytokiner flekker (ICS) eksperimenter gjennomført for å vurdere videre T celle immunreaksjoner ved å bestemme uttrykk og frekvenser av effektor cytokiner i dyr vaksinert med OVA innredede bakterier og bakterier genetisk forvandlet en OVA uttrykke plasmider. Vi undersøkte nivåer av IFN-γ utgivelse, som er en kjent indikator på beskyttende reaksjon mot intracellulære bakterier11. Vi viste at vi var i stand til å gjenkjenne lignende nivåer av OVA-spesifikke IFN-γ slippe CD4+ celler i dyr vaksinert med bakterier overflate dekorert med OVA (BCG-Avi-OVA og BCG-p19-Avi-OVA) sammenlignet med dyr vaksinert med bakterier genetisk uttrykke OVA (BCG-p19-OVA) (figur 8A). Viktigere, var vi også kunne oppdage betydelig høyere frekvenser av IFN-γ produsere CD8+ T celler i dyr vaksinert med BCG-Avi-OVA sammenlignet med dyr vaksinert med BCG genetisk uttrykke OVA (figur 8B-C) som viser at biotin-avidin mediert overflate visning av antigen metodikk effektivt kan erstatte BCG transformasjon med nucleic syrer.
Figur 1: byggingen av en rekombinasjon kloning plasmider for produksjon av avidin fusion proteiner. (A) et gen segment koding for monomerisk avidin var syntetiserte med begrensning nettsteder NdeI og NotI og subcloned i pDEST17 mellom 6 x histidin og gateway kassetten generere p17-Avi plasmider. OVA peptid252-345 DNA sekvenser avsluttet med attB nettsteder ble klonet i pDONR221. Deretter var OVA gener subcloned i p17-Avi. Bilde redigert og gjengitt med tillatelse fra PLOS ONE12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: effektiviteten av BCG biotinylation. BCG var biotinylated med ulike konsentrasjon av NHS-SS-biotin for 30 min ved romtemperatur, deretter merket med FITC-streptavidin og analysert av flowcytometri. Resultatene presenteres som histogrammer for grønne fluorescens intensitet og sett inn diagrammet representerer den gjennomsnittlig ± SEM av mener fluorescens intensiteter (MFI) trukket fra 3 uavhengige eksperimenter. * P < 0,05; ** P < 0.01; P < 0,001. Bilde redigert og gjengitt med tillatelse fra PLOS ONE12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Biotinylation av BCG overflate ikke påvirke veksten eller overlevelse i macrophage. (A) Biot-BCG og kontroll umerkede vill-type BCG ble dyrket i fullstendig 7T 9 media, og replikering var overvåket over en 8-dagers periode. Resultatene er uttrykt som vekst kurver, dvs, mener absorbans ved 600 nm som funksjon av tiden ± SEM fra 3 uavhengige eksperimenter. (B) makrofager var infisert med Biot-BCG-Luc eller kontrollere umerkede BCG-Luc for angitte tidsperioder og deretter cellen lysates ble utarbeidet og assayed for bioluminescens å oppdage levedyktig bakterier. Resultatene uttrykkes som betyr relative lette enheter (RLU) ± SEM fra 3 uavhengige eksperimenter. Bilde redigert og gjengitt med tillatelse fra PLOS ONE12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Avi-OVA bindende Biot-BCG og dens stabilitet. (A) Biot-dsRed-BCG (bakterier uttrykke røde fluorescens, tidligere beskrevet9) og kontrollen ikke-biotinylated dsRed-BCG ble blandet med Avi-OVA ved romtemperatur for 1 h og omfanget av OVA binding ble evaluert av overflaten farging med kanin anti-avidin antistoffer og FITC-geit anti-kanin IgG (FL1). Prøvene ble vasket og analysert av flowcytometri. Resultatene presenteres som histogrammer av grønne fluorescens verdier er gjennomsnittlig ± SEM av MFI av Biot-BCG-AviOVA binding fra tre uavhengige eksperimenter. (B) lyofiliserte Biot-BCG belagt med Avi-OVA og nystekte Avi-OVA-Biot-BCG ble merket og analysert av flowcytometri som beskrevet i A. Dataene som vises er tre uavhengige eksperimenter, og verdiene er gjennomsnittlig ± SEM av MFI av Avi-OVA-Biot-BCG binding fra tre uavhengige eksperimenter. (C) rå makrofager var infisert med DsRed BCG-Avi-OOVA eller DsRed-BCG 24 h på 37 ° C. Prøvene ble deretter vasket, behandlet med trypsin, fast og analyseres av FACS. Resultatene uttrykkes som røde fluorescens histogrammer, som reflekterer omfanget av fagocytose. Verdiene indikerer gjennomsnittlige prosentandelen ± SEM celleområde inntak BCG fra tre uavhengige eksperimenter. Bilde redigert og gjengitt med tillatelse fra PLOS ONE12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Avi-OVA løsrevet fra BCG overflaten og krysset phagosomal membranen mot stoffer. (A) tilhenger rå celler i dekselet slips var infisert med OVA dekorerte dsRed-BCG 24 h på 37 ° C og deretter fast/permeabilized og farget med kanin anti-avidin antistoffer og FITC-geit anti-kanin IgG. Prøvene ble montert på objektglass og analyseres av digital AC confocal mikroskopi. Røde signaler angir posisjonen til BCG og grønne signaler gjenspeiler lokaliseringen av Avi-OVA. Den stiplede linjen angir macrophage cellegrensen og nederst i høyre panel er en 4 X forstørrelse av sette vises i informasjonsvinduet. (B) av tynne snitt av BCG-AviOVA infisert rå celler var fast med paraformaldehyde og ruges sekvensielt med anti-avidin antistoffer og gull-konjugerte geit anti-kanin IgG visualisere Avi-OVA og undersøkt med et elektronmikroskop. Forstørrelsen av 12.000 X vises. Pilhodene angi Avi-OVA atskilt fra BCG overflate og eksportert utenfor phagosome membranen. Bildene som vises er representanter for to uavhengige eksperimenter. Bilde redigert og gjengitt med tillatelse fra PLOS ONE12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Avidin-fusion antigenet Co lokalisert med MHC klasse II og klasse I molekyler. Tilhenger BMA3.1A7 celler, en mus macrophage cellen linje, var infisert med OVA dekorerte GFP-BCG (uttrykke grønne fluorescerende, beskrevet tidligere9) 4 h og deretter stimulert med IFN-γ for 24 h. celler var fast/permeabilized og farget med kanin anti-avidin antistoff, Alexa 594 anti-kanin IgG og Alexa 647 rotte anti-musen en (A) eller Alexa 647 rotte anti-musen H-2_kb (B). Prøvene ble montert på objektglass og analyseres av digital AC confocal mikroskopi. Grønne signaler angir posisjonen til BCG-GFP og røde signaler gjenspeiler lokaliseringen av Avi-OVA. Blå signaler indikere plasseringen av MHC, klasse II eller klasse I molekyler. Den stiplede linjen angir området av interesse. Pilspisser angi Avi-OVA colocalization med MHC molekyler. Bilder vist er representanter for to uavhengige eksperimenter. Bilde redigert og gjengitt med tillatelse fra PLOS ONE12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: I vivo CD4+ T celle respons på OVA innredede BCG. C57BL/6 musene ble injisert subcutaneously med BCG overflaten dekorert med egg, uforandret BCG vill-type, PBS (kontroll), BCG genetisk forvandlet for å uttrykke OVA (BCG-p19-OVA) eller omdanne med kontroll plasmider og overflate dekorert med Avi-OVA ( BCG-p19-AviOVA). Etter en 20-dagers periode, splenocytes var forberedt fra spleens euthanized dyr og farget med PE-konjugerte enb-OVA323-339 tetramers (A) etterfulgt av AF647-CD4 antistoff og 7-AAD. Prøvene ble deretter analysert av flowcytometri. Resultatene uttrykkes som to-parameteren dot tomter som viser gjennomsnittlig frekvenser ± SEM av tetramer positive hendelser i CD4+ befolkningen fra to dyr/gruppe. Dataene som vises er tre uavhengige eksperimenter (totalt seks mus ble undersøkt med cellen prøver fra hver musen i tre eksemplarer). Dataene i grafer (B) er uttrykt som betyr verdien ± SEM av absolutte antallet (i totalt 500.000 hendelser) OVA tetramer bestemt CD4+ celler i to dyr/gruppe og tre uavhengige eksperimenter. * P < 0,05; ** P < 0.01; P < 0,001. Bilde redigert og gjengitt med tillatelse fra PLOS ONE12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: frekvenser av T-celler ut cytokiner som svar på Avi-OVA belagt BCG-immunisering. Splenocytes fra vaksineres mus med PBS, BCG vill-type, BCG WT overflaten dekorert med Avi-OVA, BCG-p19-OVA og BCG-p19-AviOVA ble stimulert med rekombinant OVA protein for 16 h etterfulgt av 5 h-perioden behandling med Brefeldin A. Cells ble deretter vasket og farget først med PE-Cy7 anti-CD4 (A) eller PE anti-CD8 antistoff (B) så AF647 anti-IFN-γ antistoff. Cellene ble deretter vasket og analysert av flowcytometri. Resultatene uttrykkes som to-parameteren dot tomter å vise gjennomsnittlig frekvenser ± SEM av IFN-γ produserer celle undergrupper i CD4+ og CD8+ bestander fra to dyr/gruppe. Dataene som vises er tre uavhengige eksperimenter (totalt seks mus ble undersøkt med cellen prøver fra hver musen i tre eksemplarer). Dataene i grafer (C) er uttrykt som den absolutte tall ± SEM av IFN-γ slippe CD4+ T celler (venstre diagram) eller IFN-γ slippe CD8+ T celler (høyre grafen) fra to dyr/gruppe og tre uavhengige eksperimenter. * P < 0,05; ** P < 0.01; P < 0,001. Bilde redigert og gjengitt med tillatelse fra PLOS ONE12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi rapporterte i denne studien en ikke-genetiske tilnærming for rask og effektiv visning av eksogene proteiner på BCG overflaten til bestemte antigener eller bestemte funksjonelle egenskaper forventes å effektivt forbedre den bakterien immunogenisitet. Vi viste at celleoverflaten BCG kan være lett biotinylated for øyeblikkelig landtransport dekorasjon med avidin fusion proteiner. Totalt prosedyren kan utføres innen 2 timer, mens genetisk transformasjon og utvalg av positiv kloner krever 2 til 3 måneder av tidsforsinkelsen. Overflaten endringen påvirker ikke bakterievekst og overlevelse. Bakterier dekorert med surrogat antigen OVA kunne levere antigen i antigen presentasjon veien og indusert spesifikk immunrespons i vivo, som ble vurdert av flowcytometri analyser inkludert MHC tetramer flekker og intracellulær cytokin flekker (ICS). Enda viktigere, viste i vivo studier tydelig at overflaten innredede bakterier kunne få lignende nivåer av immunrespons sammenlignet med BCG genmodifiserte å uttrykke lignende antigener.
Avidin biotin samspillet er sterkeste ikke-kovalente samspillet i naturen med en Kd 10−15 M13. Det er ikke bare et nyttig verktøy som vanligvis brukes i biologiske14, men også nylig vist gjelder i kreft terapi15,16. I denne studien, en trippel mutasjon (N54A, W110K og N17I) ble brukt til vill-type avidin konvertere tetramerisk avidin til en monomerisk avidin som har betydelig redusert avidin-biotin affinitet (Kd= 10−7 M) og binder reversibel til biotin. Denne monomerisk avidin ble brukt til å utvikle en p17-Avi plasmider som er kompatibel med Gateway rekombinasjon kloning (Invitrogen) for en ettrinns rask uttrykk for et protein av interesse. Denne nye versjonen av monomerisk avidin har flere fordeler inkludert å hindre store bakteriell klump aggregering og forbigående/reversibel bakteriell overflaten visning av proteiner av interesse. Derfor når svelget av verten cellen kan Avi-fusion proteiner løsne fra overflaten av biotinylated bakterier og trafikk intracellulært. Til slutt, mutasjoner konverterer avidin til et ikke-glycosylated skjema som kan være aktuelt i gjær eller transgene planter17,18 for produksjon av store mengder avidin fusion proteiner i eukaryote systemer. Denne formen for monomerisk avidin ble valgt i stedet for en versjon av monomerisk streptavidin (mSA)19, som har både streptavidin og rhizavidin sekvenser og hadde en høyere forpliktende tilhørighet (Kd 10−9 M) sammenlignet med mAvidin. Foreløpige tester, hadde mSA chimera protein en mye lavere bindende effektivitet for biotinylated bakterier sammenlignet mAvidin chimera protein. Denne studien, derfor var basert på mAvidin, men monomerisk streptavidin eller andre former for streptavidin/avidin vil også være en mulighet for andre programmer.
Vellykket implementering av beskrevet protokoller avhenger av kvaliteten på den genererte fusion og effektiviteten av den bakterielle overflaten biotinylation. Elut Avi-merket protein skal de saltet og buffer vekslet til PBS med riktig molekylvekt protein konsentrator. Nedbør kan oppstå på høy konsentrasjon faktorer for noen proteiner, derfor konsentrasjon bør testes og bestemmes ved hjelp av små mengder elut protein på først, f.eks0,5 til 1 mL av solubilized inkludering kroppen fortynnet i 20 mL PBS og deretter konsentrert. Det er også viktig å opprettholde temperaturen i protein rundt 4 ° C i løpet av hele prosessen å unngå nedbør.
For å forbedre effektiviteten av bakteriell overflate biotinylation, skal Sulfo-NHS SS biotin lagres i beholderen opprinnelige i mørket på 4 ° C. Reagensen er ekstremt fukt følsom; Derfor bør ampuller med reagensen være equilibrated til romtemperatur før åpningen. Biotin lagerløsning (10 mM) bør også gjøres umiddelbart før bruk som NHS-ester moiety hydrolyzes og blir ikke-reaktive svært raskt. Biotin lagerløsning kan ikke lagres og igjen; en ny biotin medisinglass kreves for hver biotinylation eksperimentet. For best resultat anbefales frisk kulturer av BCG, frisk media, samt ferske buffere. Som nevnt i protokollen, biotinylated og belagt BCG kan være lyofiliserte og bevart i minst 30 dager uten å påvirke kvaliteten på overflatebehandlingen. Dette er spesielt nyttig når sende eller overføre prøver fra ett sted til et annet eller når utføre langbane eksperimenter.
Denne BCG landtransport dekorasjon metoden tilbyr også andre spennende muligheter for å analysere og evaluere immunogenisitet nyutviklet vaksine kandidater på en rask og nøyaktig måte. Hovedmålet med romanen TB vaksiner er å indusere TH1 type celler som CD4+ og CD8+ T celler som spille viktige roller i beskyttelse mot TB. Avidin-biotin systemet utviklet i denne studien tilbyr et veldig nyttig verktøy for å vurdere disse T celler svar. Denne romanen teknologien raskt vise rekombinante proteiner/antigener på BCG overflaten representerer en stor verktøyet for raskt å evaluere og nøyaktig beskyttende effekten av mange immunogenic proteiner (f.eksutskilles bestemte M.tb proteiner), og dermed kan oversettes til utvikling av effektive vaksiner.
Ved å justere og varierende konsentrasjonen av Avi-fusion proteiner på bakteriell overflate, kan en annen fordel med denne metoden være samtidig vise forskjellige antigener rundt på bakteriell overflaten for å maksimere effektiviteten av vaksine. Siden studier har vist at BCG forstyrrer viktig macrophage funksjoner som phagosome modning20,21 og antigen presentasjon21, kan en mulighet til å forbedre BCG dekorere BCG overflaten med en kombinasjon av faktorer kalt å akselerere phagosome modning samt antigener rundt.
Noen begrensninger av denne teknologien inkludere krav om Storskalaproduksjon av rekombinante proteiner, som kan være utfordrende og dyrt i lav inntekt områder. Også ville produsere hardt å rense proteiner kreve feilsøking og optimalisering. Imidlertid kan disse begrensningene omgås med forbedring av rekombinant protein teknologi. En annen begrensning inkluderer muligheten at naturlig forekommende anti-avidin antistoffer vanlig i laboratoriet dyr og mennesker22 kan hemme bruk av avidin for terapeutiske formål. Men andre laboratorier har testet sikkerhet og effekt av avidin terapi og har vist at avidin's sikkerhet og effekt ikke var betydelig påvirket av sin immunogenisitet23. Interessant, redusert konvertere det vill-type tetramerisk avidin til en monomerisk form betydelig sin immunogenisitet24.
For å oppsummere, kan denne romanen teknologien bruker en avidin-biotin system for å forbedre BCG er immunogenisitet via en rask og reproduserbar ikke-bakteriell overflaten genmodifisering med proteiner rundt kunne erstatte tradisjonelle transformasjon av BCG med antigen-koding plasmider. Videre denne romanen metoden kan ikke bare Letter forbedring av den gjeldende BCG-vaksinen, men gir også en ny plattform for rask evaluering av praktisk talt alle potensielle antigen eller proteiner normalt vanskelig å uttrykke genetisk med BCG, med bred programmer i TB vaksineutvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. R Stokes for BCG Pasteur belastningen og A. Talal kundestøtte. Vi har også takke GenScript for hjelp med Gen syntese.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin-free RPMI 1640 | StemCell Technologies | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS biotin | Thermo Fisher | 21328 | |
| FITC-conjugated streptavidin | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL International | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON polyhistidine-Tag purification resin | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| AF647 rat anti-mouse IFN-g | BD Bioscience | 557735 | |
| AF647 rat anti-mouse I-A/I-E | BD Bioscience | 562367 | |
| PeCy7 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 552775 | |
| PE rat anti-mouse CD8 Ab | BD Bioscience | 561095 | |
| AF 647 rat anti-mouse H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC-conjugated goat anti rabbit antibody | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG | Electron Microscopy Sciences | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Diagnostic Systems | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 murine macrophage cell lines | American Type Culture Collection | ||
| pDEST17 plasmid | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA plasmid | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 plasmid | Invitrogen | 12536017 | |
| Ni-NTA columns | Qiagen | 31014 | |
| Pierce protein concentrators | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II epifluorescence microscope | Carl Zeiss Inc | ||
| CCD digital camera | Retiga EX, QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV electron microscope | FEI Company | G2 200Kv | |
| 70μm Falcon cell strainer | Thermo Fisher | 87712 | |
| EasyStep mouse biotin positive selection kit | StemCell | 18556 | |
| biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Pharmingen | 554714 | |
| Bright-Glo Luciferase assay system | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 microtome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 freeze dryer | Savant Instruments | NL 50 | |
| Wheaton boroscilicate glass vials | Wheaton | VWR 66011-675 |
References
- Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
- Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
- Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A.
- Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
- Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
- Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
- Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
- Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
- Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).
- Green, N. M.
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S.
- Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M.
- Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
- Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
- Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
- Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
- Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
- Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
- Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
- Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).
