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Biology

无透镜视频显微术在黏附细胞培养动态定量分析中的研究

Published: February 23, 2018 doi: 10.3791/56580
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 3,4, 3, 1, 1, 1, 5, 5, 4,6, 1
1CEA, LETI, DTBS, LISA, Université Grenoble Alpes, 2CEA, LETI, DTBS, LBAM, Université Grenoble Alpes, 3CEA, INSERM, BIG, Université Grenoble Alpes, 4CNRS, FR CNRS 3425, 5CNRS, UMR 144, Molecular Mechanisms of Intracellular Transport, PSL Research University, Institut Curie, 6TIMC-IMAG

Summary

无透镜的视频显微镜使我们能够在孵化器内直接监测细胞培养。在这里, 我们描述了用于获取和分析2.7 天长时间获取培养的 HeLa 细胞的完整协议, 导致一个数据集 2.2 x 106测量单个细胞形态学和10584细胞周期轨道。

Abstract

在这里, 我们表明, 无透镜的视频显微镜, 使我们能够同时捕获数以千计的细胞的动力学, 直接在孵化器内, 并有可能监测和量化的单个细胞沿几个细胞周期。我们描述了用于监视和量化 HeLa 细胞培养2.7 天的完整协议。首先, 用无透镜的视频显微镜进行细胞培养, 然后在四步过程中分析数据: 多波长全息重建、细胞跟踪、细胞分割和细胞分裂检测算法.因此, 我们表明, 有可能收集具有超过1万个细胞周期轨道和超过 2 x 106细胞形态学测量的数据集。

Introduction

在几个细胞周期内监测培养的哺乳动物细胞, 准确测量细胞大小和细胞干质量是一项具有挑战性的任务。几个无标签的光学技术能够执行此任务1,2: 移相干涉测量3, 数字全息显微镜 (DHM)4,5,6,7, quadriwave 横向剪切干涉测量8,9和定量相断层扫描10,11。这些方法使人们对哺乳动物细胞周期的认识有了许多新的见解。然而他们很少加上自动细胞追踪算法, 并且他们的吞吐量仍然是有限的, 当测量细胞质量轨道1 (N < 20 分别在3,4,5,6). 因此, 需要用一种新的光学方法来测量大统计量 (N > 1000) 的细胞质量轨迹。

在本文中, 我们展示了无透镜视频显微镜的能力, 同时在孵化室内直接图像数以千计的细胞, 然后量化单个细胞指标沿数以千计的单个细胞周期轨道。无透镜显微镜是一种定量的相位成像技术, 它允许在一个非常大的视野 (通常数十毫米2, 这里29.4 毫米2)12,13 中获取密被包装细胞的相位图像. ,14,15。在单个单元格级别确定了几个度量值,例如、单元格区域、单元格的干质量、单元格粗细、单元格主轴长度和单元格长宽比12、15、每个图像。然后, 通过应用单元跟踪算法, 可以将这些功能绘制为每个单元格, 作为实验时间14、15的函数。此外, 通过检测细胞内的细胞分裂的发生, 有可能提取其他重要信息, 如初始细胞干质量 (刚刚细胞分裂), 最终细胞干质量 (刚刚细胞分裂) 和细胞周期持续时间,即, 两个连续的分区15之间的间隔。所有这些测量都可以计算出非常好的统计数据 (N > 1000), 因为大的视野通常允许分析200到1万细胞在一个单一的无透镜获取。

为了解释这种基于无透镜视频显微镜的方法, 我们描述了2.7 天内对 HeLa 细胞培养进行监测和量化的协议。数据分析是基于多波长全息重建、细胞跟踪、细胞分割和细胞分裂算法的四步过程。这里表明, 空间分辨率和相对较快的帧速率 (每10分钟一次采集) 获得与此无透镜视频显微镜设置兼容标准的细胞跟踪算法。对这个数据集的完整分析结果是在整个细胞周期内测量10584个细胞轨道。

总之, 无透镜视频显微镜是一个强大的工具, 自动监测数以千计的未标记, 不同步, 和未修改的细胞, 每个实验;在多个单元周期中跟踪每个单元格。因此, 我们的测量提供了几个细胞参数的平均值, 但更重要的是, 细胞间的变异超过了大量的细胞。

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Protocol

1. 细胞培养监测采集

  1. 在 DMEM + 谷氨酰胺 (例如, GlutaMAX) 中生长 HeLa 细胞, 辅以 10% (v/v) 热灭活胎小牛血清和1% 青霉素和链霉素。
  2. 涂层6井玻璃底部培养板与纤维连接蛋白 (25 µg/毫升) 为 1 h。然后每个井种子 2 x 104单元格。
  3. 在购置期间, 每3天更换一次培养基。
  4. 对于延时采集, 使用视频无透镜显微镜 (商用)。
    注: 这是基于无透镜的计算成像技术, 如欧兹坎et . 所述。16 , 它被修改为在孵化器中以37摄氏度12、15的控制温度执行连续监视。它具有一个互补的金属氧化物半导体 (CMOS) 图像传感器, 像素间距为1.67 µm, 成像面积为 6.4 x 4.6 毫米2。多波长照明由一个多芯片组件发光二极管 (led) 装置提供, 它提供红色、绿色和蓝色照明。波长分别为636、521和 452 nm, 其光谱带宽分别为25、45和 25 nm。红绿蓝 (RGB) 发光二极管位于150µm 针孔的上方, 距离细胞约5厘米。测量接近 LED 的光功率低至10µW 在每个波长和照明时间仅一秒每承购。因此, 在无透镜的视镜下观察细胞培养时, 不会出现光毒性问题。
  5. 将单元格区域性容器与 CMOS 传感器 (图 1) 联系在一起。在底部使用带有玻璃盖玻片的容器, 这对无透镜采集的质量很重要。还可以使用塑料容器, 但由于这些容器的光学质量较差, 无透镜采集将被降级。
  6. 使用采集软件 (商用) 控制视频无透镜显微镜, 既可实现定时采集, 又可进行全息重建。用户在软件界面中需要输入的参数包括帧速率、实验持续时间和细胞培养类型, 即黏附细胞或漂浮细胞。
  7. 设置采集软件的输入参数。每10分钟将帧速率设置为一次获取, 并将单元格区域性类型设置为 "粘附"。
    注意: 每10分钟一次获取帧速率是一个很好的折衷, 因为它确保了可靠的单元跟踪, 而结果数据集的大小仍然是合理的。最快的帧速率可实现与这种无透镜显微镜设置是每5分钟一次获得。进一步增加帧率导致 CMOS 传感器过度加热, 这会影响细胞在培养中的生存能力。
  8. 启动延时采集, 全息重建算法 (商用) 将自动处理无透镜采集, 获得细胞培养的相位图像。全息重建算法是基于多波长相位检索算法17 , 并提供一个 RGB 重建相图像的范围内的每一个单一的单元格 (π, + π) 在一个大视野的29.4 毫米2。无透镜在线全息术的原理是在 z=0 上用平面波 (在正常化后的振幅 1) 来照亮一个稀薄的样本, 并在 CMOS 传感器上检测随后的衍射强度图像在短距离 z = z, 通常为1毫米后,示例.在我们的设置中, 光照按顺序切换到3波长 (λ1= 0.450 µm, λ2= 0.540 µm, λ3= 0.647 µm) 来测量同一样本的三衍射模式。

2. 细胞培养数据分析

  1. 对于单元跟踪, 使用 Trackmate 算法, 一个开源斐济插件, 用于自动跟踪单个粒子18。首先, 将全部的时间推移捕获加载到斐济 (加载图像序列命令)。由于数据集的大小很大, 通常 400 RGB 帧为 29.7 Mb, 因此以8位格式加载它们会更快。接下来, Trackmate 斐济插件引导用户通过细胞跟踪算法的几个阶段, 即单元检测阶段、单元跟踪阶段以及用于单元检测和计算轨道的几个滤镜。在每个阶段, 配置算法并立即显示结果, 以便在必要时可以轻松地来回导航以重新调整设置。Trackmate 接口的各种菜单显示在图 2中, 其中的实际设置用于 HeLa 单元实验。
  2. 将采集软件的输入参数设置为如下 (请参见图 2)。将估计的 blob 直径设置为15像素, 探测器阈值为 0.25, 链接最大距离为15像素, 间隙闭合最大距离为15像素, 轨道中的点数为3.5。
    注意: 这些设置明显不同于一个实验, 特别是与单元格大小对应的 "估计 blob 直径" (这里给出的像素为1.67 µm)。同样的评论也适用于 "链接最大距离", 它解释了在两个连续帧 (这里给出的像素为1.67 µm) 的最大距离。它的最佳值取决于细胞的运动, 也依赖于细胞密度。
  3. 在单元格跟踪过程的末尾, 以三个文本文件 ("分析" 按钮) 的形式生成结果, 请参见图 2)。最有用的文件, 名为 "轨道统计" 中的 "点", 由一个表列出所有检测到的单元格, 它们各自 (x、y) 位置在获取、帧号和跟踪编号中。根据这些数据, 使用专用算法执行单元格分割和检测单元划分 (请参阅辅助代码文件)。另外两个文件被命名为 "跟踪统计信息" 和 "跟踪统计信息" 中的 "链接", 包括处理轨道的所有结果,例如跟踪工期、检测到的间隙数、跟踪初始帧等。
  4. 使用单元格分割算法 (见补充码文件), 自动提取几个描述细胞形态学从重建阶段图像的指标。这些指标是细胞表面积, 细胞主轴长度 (l), 细胞小轴长度 (l) 和细胞长宽比 (l/升)。从无透镜显微镜中恢复的相位与前述15所讨论的试样层的密度和厚度成正比。
  5. 除了细胞的形态学特征外, 从重建阶段13,19,20提取定量细胞干质量 (CDM) 测量结果
    Equation 1情商 (1)
    其中φ (x, y) 是重构的相移19, λ波长和α = 1.8 x 10-4 m3/千克与折射率变化有关的特定折射率1, 19。
  6. 用估计细胞折射率与培养基的差异来评估细胞厚度。20给出了单元格厚度h(x、y) 和测量的相移之间的关系:
    Equation 2情商 (2.1)
    Equation 3情商 (2.2)
    使用Δn(x,y) = n单元格(x,y)- n中 (x,y), 单元格和区域性媒体之间的折射率差。在下面, 假定Δn = 0.025的常量值, 这是从在 HeLa 细胞核 (n = 1.35511) 和磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 培养基 (n = 1.33) 中测量的折射率估计出来的。虽然细胞厚度值只是指示性的, 因为它是基于一个假设, 它的相对变化是有意义的, 可以利用来检测分裂细胞。
  7. 使用专用算法 (请参阅辅助代码文件) 检测细胞分裂的发生, 然后提取与检测到的细胞分裂相关联的单元轨道, 以检测细胞分裂, 测量厚度大于8µm 的单元格。首先确定, 然后检查一个新的细胞是否在空间和时间紧密地出现。这样, 细胞分裂的检测依赖于两个健壮的标准。可替代的和更精细的细胞分裂检测方法可以应用到 lensfree 时间推移获取21,22,23。

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Representative Results

对于全息重建过程, 光场由标量字段a Equation 4描述 (其中是从样本到距离z的平面上的a的复数值, 以及侧面位置和波长λ). Equation 5光传播是由惠更斯-菲涅尔理论建模的, 它提供了一个传递者内核. Equation 6 因此, 探测器平面上的场振幅, Az 与光振幅0 的关系如下:
Equation 7即Equation 8
使用, 其中Equation 9 i是复数 (i2=-1)

强度测量仅由建模. Equation 10 重建算法的目的是找到一个 "好" 字段a0, 与观察到的样本相关, 衍射将与测量的强度I相匹配。该策略是考虑探测器平面φz中的振幅场相位, 以确定问题的未知, 并优化对象的多光谱总变异准则. 更明确地, 考虑到字段
Equation 11

Equation 12即Equation 13
对于任何相域φz, 与之后的数据完全匹配. Equation 14 Equation 15 因此, 给定所观察到的强度图像, 后续字段是样本平面中可能的振幅场. Equation 16这就是为什么a0 上的条件用于在所有数据匹配可能性之间指定唯一解决方案的原因。选择最小化的标准为:
Equation 17
其中 x 和 y 是平面的坐标, 即. Equation 18 使用这样的标准, 可以在所有可能的字段中选择一个示例字段, 在所有波长的同一位置显示锐边, 这在物理上是有意义的。此方法减少了重建字段A0中 "双映像" 的出现。"双图" 是在采集过程中缺乏相位信息而产生的一种重要的文物。

在实际计算中, 积分被离散为与探测器分辨率相对应的空间抽样, 导数由索贝尔算子代替, 回旋由惠更斯-菲涅尔传播器执行. Equation 19为具有简单表达式的傅立叶空间:. Equation 20 Equation 21 对 (实数) 集变量的 (实数) 判据的最小化使用非线性共轭梯度法处理, 这要求对每个探测器像素关联的任何相位计算ε的梯度. Equation 22波长.

细胞重建/相位展开
图 3显示了在文化中对 HeLa 细胞进行时间推移捕获的一个帧的全息重建结果。图 3a显示了 29.4 mm2区域中蓝色通道中原始获取的完整视图字段。根据该图像和在红色和绿色通道中获取的数据, 全息重建会产生单元格的 RGB 相位图像, 如图 3b和3c所示。重建相图像展示了与诱导相移超过 + π的细胞相对应的局部包裹的相位文物。为了进行一个简单的相位展开, 我们实现了一个启发式的平均值, 即我们检测到值为的像素超过 0.3, 并将这些像素设置为 + π. Equation 23这种简单的方法是基于 RGB 重建相图像的性质。理论上, 在每个像素, 我们应该测量一个比率等于. Equation 24 Equation 25 但是, 在有丝分裂细胞的情况下, 当相位环绕发生时, 这种关系不再维持在 RGB 重建相图像 (图 3f) 中。上述启发式方法利用了该属性, 使一个简单的阈值可用于检测呈现相位环绕的像素。展开前后重建的相位图像的结果分别显示在图 3f和3g中。然后将这些解开的相位图像送入细胞跟踪算法中。如果没有这个展开步骤, 细胞跟踪算法就无法检测出大厚度分裂和细胞中的细胞, 这将损害最终的结果。重建的相位图像的分辨率估计约为5µm15 (全音调空间分辨率), 这是相对粗糙的。不过, 可以观察诸如 lamellipodia 和胞浆 (图 3f 和 3g) 等细节。最重要的是, 无透镜显微镜获得的图像显示出较大的对比度, 并免除光晕文物。这有助于自动进行细胞检测和细胞追踪。

细胞培养数据分析
为了提取细胞周期轨道, 数据分析依赖一系列不同的算法, 即使用 Trackmate 斐济插件执行的单元跟踪, 检测分裂, 最终提取细胞周期轨道,即序列在两个细胞分裂之间。在下面我们讨论了这些算法输出的质量与人工测量的比较。

图 4显示了对单元格跟踪结果的不同屏幕捕获、单元检测算法的结果和单元跟踪分析结果。检测无透镜采集中的细胞 (图 4a-4c) 是单元跟踪算法的第一步。为了验证细胞检测算法, 我们手工标注了一小部分的时间失效无透镜采集 (214 帧 663 x 663 µm2)。我们手动选择了总共5365个单元格位置, 并将这些结果与 Trackmate 斐济插件获得的数据进行了比较。图 5显示了真实检测、误报和假阴性等方面的结果。产生的灵敏度约为 96%, 正预测值为99.7%。这些高值反映了良好的质量的重建相图像获得的无透镜视频显微镜设置。在单元格检测之后, 单元格分割算法允许对每个单元进行测量--几种不同的度量标准,例如单元格区域、细胞干质量和细胞厚度。图 6a描述了分割算法的原理,图 6f显示了 663 x 663 µm2的感兴趣区域的时间序列中的分段图像 (与图 5中相同)。算法通过对相位图像进行阈值来启动分割 (请参见图 6b), 然后应用播种过程 (请参见图 6c)。即检测到的单元格中心的像素被设置为相应曲目的值。单元格的 X Y 位置及其对应的轨道数由单元跟踪后获得的 "轨道统计" 文件中的 "点" 提供。然后, 实现了一个迭代填充过程, 它将种子扩展到单元格的边界 (图 6c-e), 由初始阈值 (图 6b) 确定。这种填充过程依赖于数学形态学的基本操作,例如, 如膨胀和侵蚀。从分割的结果, 可以计算在单细胞水平上的几个指标,即形态学特征, 如细胞长度, 细胞面积和细胞长宽比, 而且, 更重要的是, 细胞干质量根据情商1。为了评估细胞干质量的无透镜显微镜测量的可靠性, 我们将固定 HeLa 细胞 (图 6g) 的无透镜重建相图像与用数字全息方法获得的同一区域进行了比较。具有5X 目标的显微镜 (图 6h)。图 6i显示了用无透镜显微镜测量的细胞干质量, 它是用 DHM 测量302段 HeLa 细胞的干质量的函数。两种测量 (确定系数 R2为 0.86, 斜率 = 0.9, 偏移 =-17 pg) 之间有很好的相关性。从图 6i, 我们可以估计通过无透镜显微镜获得的细胞干质量测量的精度。在无透镜数据和线性拟合之间, 测量为均方误差的精度约为16页。

当编译所有单单元测量的全时间推移获取, 然后可以获得 scatterplots 的几个指标作为时间的函数, 如图 7所示。这些 scatterplots 提供了关于培养细胞在非常大的人口的动力学的信息。视图字段中的单元格数从2000增加到 1.5万 (图 7a)。乘以时间点的数量, 这就导致了一个大数据集 2.2 x 106检测到的单元格, 它们各自的特征是其坐标和形态学特征,即单元格干质量 (图 7b), 单元格区域 (图 7c)、单元格平均厚度 (图 7d)、主轴长度 (图 7e) 和纵横比 (图 7f)。

重要的是, 细胞跟踪和细胞分割算法的结合使我们能够测量单个细胞水平的动力学。例如,图 8显示了一个持续约66小时的单元格轨道的分析, 在 T0 + 4.1 h、T0 + 20.5 h、T0 + 36.7 h 和 T0 + 53.3 h 上展示了四个细胞分裂.图 8a显示了自动单元格分割算法的结果, 允许我们要有效地描绘这个细胞的表面。使用单元格分割, 可以计算几个度量值作为时间的函数,例如单元格表面区域 (图 8b)、单元格干质量 (图 8c)、单元格平均厚度 (图 8d) 和单元格运动 (图 8e)。从这些图中, 人们可以清楚地测量细胞分裂之间的这些细胞尺度的动力学。特别是你可能观察细胞区域的增量和干燥质量在细胞周期期间。此外, 利用细胞分裂的自动检测, 可以从这条轨道提取三个不同的细胞周期轨道, 细胞周期持续时间, 即两个分裂之间的周期, 可以估计。在图 8中显示的单个单元格轨道上, 我们测量了三个单元周期持续时间, 即16.4 小时、16.2 小时和16.7 小时. 从2.7 天的延时采集结果分析到16725个细胞分裂的检测, 并对其进行了统计, 并10584细胞周期轨道的描述。然后可以用声音统计来测量细胞周期持续时间的平均值和变异性。我们发现, 细胞周期持续时间的分布接近高斯分布 (图 9a), 平均值为 16.5 h, 相对标准偏差为 12.4% (在高斯峰值上测量的标准偏差除以分布平均值).16.5 小时的平均加倍时间与在图 8上显示的轨道上手动测量的单元周期长度是一致的。然而它在发布的价值的更低的范围说谎为 HeLa 加倍的时间通常在20和 30 h 之间24,25,26,27。但是, 在引用28中, 还提到了 16.2 @ 1.7 h 的短加倍时间。为了进一步验证我们的细胞周期长度的测量, 并确认我们的无透镜显微镜技术的可靠性, 我们已经完成了100细胞周期轨道 (10148 细胞位置) 的手动跟踪。在人工获得的细胞周期轨道上 (n = 100) 测量的细胞周期长度为 16.7±1.9 h (n = 100,图 9b)。这是非常接近的测量 16.5±2.1 h (N = 10584) 获得的自动细胞跟踪, 证明了整体分析的有效性。当将细胞周期轨迹的人工跟踪与自动确定的目标进行比较时, 我们发现67% 的细胞周期轨迹被成功地检测到, 并且自动测量的周期长度与测量的结果有很好的相关性。手动 (图 9b)。实验的前32小时测量了细胞周期轨迹的检测效率, 密度低于150细胞/毫米2。随着细胞密度增加 ~ 500 细胞/毫米2, 这种检测率明显随时间而减少。在 T0+32 h (图 9c) 中, 检测到的单元周期轨道数达到了一个高原, 而单元格的数量仍在 T0+32 h 和 T0+72 h 之间 (图 7a) 之间增加了三倍。考虑到假阳性和阴性检测的速率,图 9b提供了5个异常点: 4 是由于假阴性检测 (周期长度 > 25 小时) 和1到假阳性检测 (周期长度 < 10 h)。为了获得这一结果, 我们在细胞分裂检测算法中使用了高阈值 (8 µm), 以利于低假阳性率。此外, 显示不一致的轨道已被过滤出来,即细胞周期, 其持续时间低于6小时, 轨道上的干质量轨道不会随着时间的推移而线性增加。它们仅仅是细胞周期轨道总数的3%。因此, 自动获得的细胞周期长度的分布由高斯 (图 9a) 很好地逼近, 而短轨道的数量较少 (细胞周期长度 < 10 小时, 轨道总数的 5.1%), 这将导致假正除法检测。同样, 显示长细胞周期的轨道, 这将部分地由假阴性分裂检测结果, 也是罕见的 (细胞周期长度 > 25 小时, 总数量的轨道的 2.4%)。人工跟踪细胞周期轨迹也被用来进一步评估与插件执行的细胞跟踪。我们测量了6693个细胞的整体本地化精度为1.6 µm 在匹配点, 这是在一个像素间距 (1.67 µm)。

其他参数可以检查, 如细胞初始干质量 (刚刚分裂后), 最终的干质量 (在细胞分裂之前), 以及平均生长速率在细胞周期。图 9d将初始和最终单元格的干燥质量作为时间的函数进行绘制。结果表明, 初始和终细胞干质量随着时间的推移而减少。初始细胞干质量的中值从 223 pg 降低到 130 pg, 最后细胞干质量从 460 pg 降到 220 pg。在整个实验过程中, 两者的比值保持在1.89 到0.12 的稳定状态 (图 9d-e).最后,图 9f显示了细胞干质量增长率作为时间在10584细胞周期轨道上的作用的演变, 我们发现细胞生长速率的下降是这个特定实验中整个细胞种群的一个普遍趋势。

Figure 1
图 1: 无透镜显微镜.(a) 无透镜显微镜采集设置示意图。(b) 6 井无透镜视频显微镜的图片。它使用 CMOS 图像传感器, 其像素间距为1.67 µm, 成像区域为6.4 毫米 x 4.6 毫米 = 29.4 毫米2。照明是由一个多色 RGB led 和一个针孔放置在距离约5厘米的样品。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: Trackmate 接口.主菜单的插件显示与实际设置用于 HeLa 细胞实验。估计 blob 直径设置为15像素, 探测器阈值设置为 0.25, 连接最大距离设置为15像素, 间隙闭合最大距离设置为15像素, 轨道中的斑点数设置为3.5。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 全息重建过程.(a) 通过无透镜显微镜 (全视场29.4 毫米2) 在培养中对 HeLa 细胞进行原始获取。(b) (a) 的详细信息。(c) (b) 的详细信息。(d) RGB 重构相图 (29.4 毫米2的全视场)。(e) (d) 的详细信息。(f) 详细信息 (e)。(g) 相位解缠后获得的相位图像与 (f) 进行比较, 然后再展开。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 使用 Trackmate 斐济插件执行的单元跟踪结果的屏幕捕获.(a) 基于高斯 (LoG) 探测器拉普拉斯的单元检测算法的结果。图中显示了 T0+16h40min 中无透镜采集的全视野, 其中检测到2451个细胞。后者周围有一个紫色圆圈。(b) 单元格跟踪算法的结果。所有细胞轨道显示超过50帧 (~ 8 小时), 颜色代码对应的中值速度。(c、d)(a) 和 (b) 的详细图像 (黄色矩形)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 验证单元格跟踪算法的单元检测阶段.(a) 在区域性 (663 x 663 µm2) 中裁剪的 HeLa 单元格的图像, 其中手工选择的单元标记为蓝色十字, 而检测到的单元格跟踪算法用红色交叉标记。这可以确定假阳性检测 (红色圆圈) 和假阴性检测 (橙色圆圈)。(b) 将真实检测 (绿线)、假阳性 (红线) 和假阴性 (橙色) 检测的速率绘制为实验时间的函数。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 单元格分割的结果.(a) 在 T0+7 h (663 x 663 µm2) 上进行时间推移捕获的感兴趣区域的重建相图。(b) 算法通过对相位图像进行阈值来初始化分割 (c) 分割开始于一个播种过程,即, 检测到的单元格中心的像素被设置为相应轨道的值。(d e)接下来和迭代的填充过程被实现, 将初始播种扩展到由初始阈值 (b) 确定的单元格的边界。(f) 分割算法的结果显示为 663 x 663 µm2区域上的时间序列 (与图 5中相同)。分割显示为覆盖在重建相图像顶部的彩色表面。请注意, 无透镜信号主要来自核区域, 而分段区域接近原子核。(g) 经固定的 HeLa 细胞无透镜显微镜获得的重建阶段。这是 29.4 mm2的整个视图字段的裁剪图像。(h) 显示在 (g) 中的区域的相位图像, 其数字全息显微镜具有5X 目标 (NA 0.12), 激光照射在 647 nm 上。(i) 通过无透镜显微镜获得的细胞干质量的图象是用 DHM 测量的干质量的函数。散点图编译302细胞测量。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 对 HeLa 细胞进行2.7 天无透镜定时捕获的数据分析.(a) 在 29.4 mm2的完全视图字段中计数的单元格总数作为时间函数。(b) 散点图细胞干质量作为时间的函数。在每个框上, 对应于6小时的 bin, 红色的中央标记表示中间, 并且箱子的底部和上部边缘分别表明第二十五和第七十五百分点。胡须延伸到最极端的数据点, 而不被认为是异常值。(-f)Scatterplots 细胞分段面积 (c)、细胞平均厚度 (d)、细胞主轴长度 (e) 和细胞长宽比 (f) 作为时间的函数。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 8
图 8: 数据分析2.7 天的单元轨迹 (10 分钟帧间隔).(a) 单元格分割执行的单元轨道的时间推移获取持续约66小时。感兴趣的单元格显示为蓝色叠加。每个裁剪的图像都是 53 x 53 µm2。细胞分裂显示与黄色圈子。(b) 将单元格区域作为时间函数绘制。(c) 根据 Eq 对分段单元格区域中的相位积分计算的细胞干质量的时间演化. (1)。(d) 按 Eq 计算作为时间函数的平均单元厚度的图. (2)。细胞厚度呈现出与细胞分裂 (a) 和红线 (b-e) 相对应的尖峰。(e) 单元格运动的绘制作为时间的函数。(f) 当单元密度约为475个单元格/毫米2时, 与 T0+66h20min 的最后一个帧相对应的分割结果。图像是 200 x 200 µm2 , 以感兴趣的单元格为中心。白色补丁 (红色星号) 对应于一天后出现的细胞碎片, 细胞培养。(g) 800 x 800 µm2裁剪了此单元格轨道最后一帧的重建阶段图像。感兴趣的单元格周围有一个黄色圆圈。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 9
图 9: 单元周期分析.(a) 分配细胞周期持续时间2.7 天观察培养的 HeLa 细胞 (N=10,584 细胞周期)。细胞周期持续时间的分布接近高斯, 平均为16.5 小时, 相对标准偏差为 12.3% (在高斯峰上测量的标准偏差除以平均分布的平均值)。(b) 在确定细胞周期长度时, 手动和自动细胞跟踪之间的比较。手动跟踪功能100细胞周期轨迹 (10148 细胞位置)。(c) 自动检测到的单元周期轨迹的起始时间分布。(d) 测量的初始细胞干质量 (刚好在细胞分裂、黑点) 和最终细胞干质量 (在细胞分裂、红点之前) 的绘制作为时间的函数。在每个框中, 对应于 6 h 的 bin, 红色的中心标记表示中值, 框的底边和上边缘分别表示第二十五和第七十五百分点。胡须延伸到最极端的数据点, 而不被认为是异常值。(e) 散点图最终细胞干质量作为初始干质量的函数。(f) 细胞干质生长速率的演化作为实验时间的函数。请单击此处查看此图的较大版本.

补充文件 1: 代码 "segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove".此 Matlab 代码使用 "trackmate" 数据集执行完整的时间推移捕获的单元格分割, 重建的相位图像保存在文件夹 "folder_out" 中。请单击此处下载此文件.

补充文件 2: 代码 "lineage_Version_Jove".此代码使用单元格分割算法 (segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove) 处理的数组 "trackmate", 提取单元周期轨迹并确定感兴趣的不同参数, e. g. 细胞循环持续时间, 初始细胞干质量和最终细胞干质量。该编码分为两部分, 第一部分讨论了分单元的检测, 第二部分对细胞周期轨迹进行了分析。请单击此处下载此文件.

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Discussion

在本文中, 我们表明, 无透镜的视频显微镜可以在孵化器内使用, 以捕获数以千计的细胞的动力学。为了描述整个方法, 我们解释了如何用标准的细胞跟踪算法来分析2.7 天的 HeLa 细胞在培养中的时间推移获取。结果是一个具有 2.2 x 106单元格测量和10584个单元周期轨道的数据集。这项收购是对 Hela 细胞的一种文化进行的, 细胞间距离相对较大 (细胞密度 < 500 细胞/毫米2), 细胞形态学可以与圆盘近似。这两项功能便于应用自动单元跟踪分析, 从而可以收集如此大的数据集。其他细胞系较小的细胞间距离或更复杂的形貌将更难以跟踪和后续数据集将更小。

我们认为, 这种方法是有趣的许多研究, 例如细胞增殖和细胞大小的研究。后者是基础生物学研究的一个重要领域, 许多问题仍未得到解答, 如 Ginzberg et . 所述的很好的讨论。29. 在这项工作中提出的议定书因而提供了一种手段来衡量细胞增殖研究所需的重要指标, 即细胞周期持续时间、细胞干质量、末端与周期开始和细胞之间的细胞干质量比值。干质生长速率。除了对细胞增殖的研究外, 这种方法对细胞迁移的研究也很有兴趣, 因为它可以产生大量的轨道, 每一个持续数小时。本协议超越了艺术14、30的状态, 第一次演示了在10小时内获取数以千计的单元格轨道。

最后, 我们开发了一种易于使用的无透镜技术, 允许在数天的文化中同时跟踪数以千计的无标签细胞。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者没有什么可承认的。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytonote lens-free video microscope  Iprasense
Horus acquisition software Iprasense
6-well glass bottom culture plates MatTek corporation Part No: P06G-0-14-F 
DMEM + GlutaMAX medium  Gibco
heat-inactivated fetal calf serum  Eurobio
penicillin and streptomycin  Gibco
Fibronectin  Sigma Aldrich
Matlab, image processing toolbox  Mathworks

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细胞生物学 问题 132 无透镜显微镜 视频细胞术 密集细胞培养 定量显微学
无透镜视频显微术在黏附细胞培养动态定量分析中的研究
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Allier, C., Vincent, R., Navarro,… More

Allier, C., Vincent, R., Navarro, F., Menneteau, M., Ghenim, L., Gidrol, X., Bordy, T., Hervé, L., Cioni, O., Bardin, S., Bornens, M., Usson, Y., Morales, S. Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture. J. Vis. Exp. (132), e56580, doi:10.3791/56580 (2018).

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