Summary
Lente-libero video microscopia permette di monitorare le colture cellulari direttamente all'interno dell'incubatrice. Qui descriviamo il protocollo completo utilizzato per acquisire e analizzare un'acquisizione di 2,7 giorni lunghi delle cellule coltivate di HeLa, che conduce a un dataset di 2.2 x 106 misurazioni della morfologia delle cellule individuali e ciclo cellulare 10584 tracce.
Abstract
Qui, dimostriamo che lente-libero video microscopia permette di catturare simultaneamente la cinetica di migliaia di cellule direttamente all'interno dell'incubatrice e che è possibile monitorare e quantificare singole cellule lungo diversi cicli cellulari. Descriviamo il protocollo completo utilizzato per monitorare e quantificare una coltura delle cellule HeLa per 2,7 giorni. In primo luogo, acquisizione di cultura cellulare viene eseguita con un microscopio obiettivo-libero video, e quindi i dati vengono analizzati seguendo un processo in quattro fasi: rilevazione delle cellule segmentazione e la divisione cellulare delle cellule-rilevamento, ricostruzione olografica di multi-lunghezza d'onda, algoritmi. Di conseguenza, mostriamo che è possibile raccogliere un dataset con più di 10.000 brani del ciclo cellulare e più di 2 x 106 cella misurazioni morfologiche.
Introduction
Cellule di mammiferi coltivate nel corso di diversi cicli cellulari di monitoraggio e misurazione con precisione dimensioni delle celle e celle massa secca è un compito impegnativo. Diverse tecniche ottiche privo di etichetta sono in grado di eseguire questo compito1,2: uno spostamento di fase interferometria3, microscopia digitale oleografica (DHM)4,5,6, 7, quadriwave laterale taglio interferometria8,9 e fase quantitativa tomografia10,11. Questi metodi hanno portato a molte nuove idee per la comprensione del ciclo cellulare delle cellule di mammiferi. Tuttavia raramente sono accoppiati con cella automatica algoritmi di rilevamento e loro velocità effettiva resta limitato durante la misurazione delle cellule traiettorie massa1 (N < 20 rispettivamente3,4,5 , 6). quindi un nuovo metodo ottico è necessario misurare il traiettorie massa cellulare con grandi statistiche (N > 1000).
In questa carta, dimostriamo la capacità della lente-libero video microscopia di immagine contemporaneamente migliaia di cellule direttamente all'interno dell'incubatrice e quindi quantificare metriche di singola cellula lungo migliaia di tracce individuali ciclo cellulare. Privo di lente la microscopia è una fase quantitativa, tecnica che consente l'acquisizione dell'immagine di fase delle cellule densamente imballate su un campo visivo molto ampio di imaging (in genere diverse decine di mm2, qui 29,4 mm2)12,13 ,14,15. Diversi criteri di misurazione a livello di singola cellula sono determinati, ad es., zona di cella, cellulare massa secca, spessore della cella, lunghezza asse maggiore delle cellule e delle cellule di proporzioni12,15, da ogni immagine. Quindi, applicando un algoritmo di rilevamento delle cellule, queste caratteristiche possono essere tracciate per ogni singola cella come una funzione dell'esperimento tempo14,15. Inoltre, rilevando la presenza di divisioni cellulari nelle tracce delle cellule, è possibile estrarre altre informazioni importanti come la cella iniziale a secco massa (appena dopo la divisione delle cellule), la massa secca di cella finale (appena prima la divisione delle cellule) e la cella ciclo di durata, cioè, il tempo tra due divisioni consecutive15. Tutte queste misure possono essere computate con statistiche molto buone (N > 1000) perché l'ampio campo visivo in genere consentirebbe l'analisi di 200 a 10.000 cellule in una singola acquisizione privo di lente.
Per spiegare questa metodologia basata sulla lente-libero video microscopia, descriviamo il protocollo per monitorare e quantificare una coltura delle cellule HeLa per 2,7 giorni. Analisi dei dati è un processo in quattro fasi basato sulla ricostruzione olografica multi-lunghezza d'onda, cella-rilevamento, segmentazione delle cellule e algoritmi di divisione cellulare. Qui è indicato che la risoluzione spaziale e la frequenza di fotogrammi relativamente veloce (uno acquisizione ogni 10 minuti) ottenuti con questa configurazione obiettivo-libero video microscopia è compatibile con algoritmi di rilevamento delle cellule standard. L'analisi completa di questo dataset deriva nella misurazione di 10.584 cella tracce sopra cicli completi di cella.
Per riassumere, privo di lente video microscopia è un potente strumento per monitorare automaticamente migliaia di senza etichetta, non sincronizzato e le cellule non modificate ogni esperimento; ogni cella monitorata nel corso di diversi cicli cellulari. Le nostre misurazioni forniscono così il valore medio dei diversi parametri di cella, ma ancora più importante, la variabilità inter-cella sopra una grande popolazione di cellule.
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Protocol
1. cella cultura monitoraggio acquisizione
- Crescere le cellule HeLa in DMEM + glutammina (ad es., GlutaMAX) supplementato con 10% (v/v) fetale di vitello inattivato per calore del siero e l'1% penicillina e streptomicina.
- Cappotto lastre di cultura di fondo 6 pozzetti vetro con fibronectina (25 µ g/mL) per 1 h. Allora seed 2 x 104 cellule per pozzetto.
- Durante l'acquisizione, cambiare il mezzo ogni 3 giorni.
- Per l'acquisizione di time-lapse, utilizzare il video microscopio obiettivo-gratuita (disponibile in commercio).
Nota: Questo si basa la tecnica di imaging privo di lente computazionale come descritto da Ozcan et al. 16 che è stato modificato per eseguire il monitoraggio continuo in un incubatore a temperatura controllata di 37 ° C12,15. È dotato di un sensore di immagine del semiconductor (CMOS) di ossido di metallo complementare con un pixel pitch di 1,67 µm e un'area di imaging di 6.4 x 4.6 mm2. Più lunghezza d'onda illuminazione è fornita da un multichip luce che emettono diodo (LED) dispositivo che fornisce illuminazione rossa, verde e blu. Le lunghezze d'onda sono centrate, 636, 521 e 452 nm rispettivamente, con una larghezza di banda spettrale di 25, 45 e 25 nm rispettivamente. I LED (RGB) rosso, verde e blu si trovano sopra un pinhole 150 µm ad una distanza di circa 5 cm dalle cellule. Il potere della luce misurato vicino il LED è basso quanto 10 µW a ogni lunghezza d'onda e il tempo di illuminazione è solo un secondo per acquisizione. Quindi, non foto-tossicità sono previsti problemi quando colture cellulari sono osservati al microscopio video senza lente. - Mettere il contenitore di cultura cellulare messo in contatto con il sensore CMOS (Figura 1). Utilizzare un contenitore con un coprioggetto in vetro nella parte inferiore, che è importante per la qualità dell'acquisizione senza lente. Contenitori di plastica possono anche essere usati, ma l'acquisizione senza lente sarà degradata a causa della scarsa qualità ottica di questi contenitori.
- Controllare il lente senza microscopio video con il software di acquisizione (disponibile in commercio), che esegue sia l'acquisizione di time-lapse e la ricostruzione olografica. I parametri che devono essere immesse dall'utente nell'interfaccia del software sono il frame rate, la durata dell'esperimento e il tipo di coltura cellulare, cioè aderente celle o galleggiante.
- Impostare i parametri di input del software di acquisizione. Impostare il frame rate impostato su un'acquisizione ogni 10 minuti e impostare il tipo di coltura cellulare di 'seguace'.
Nota: Un frame rate di uno acquisizione ogni 10 minuti è un buon compromesso in quanto assicura una cella affidabile rilevamento mentre la dimensione del dataset risultante da analizzare è ancora ragionevole. Il più veloce frame rate ottenibile con questa configurazione di microscopia privo di lente è un'acquisizione ogni 5 minuti. Aumentando ulteriormente il framerate provoca eccessivo riscaldamento del sensore CMOS che possa influenzare la vitalità delle cellule in coltura. - Avviare l'acquisizione di time-lapse e l'algoritmo di ricostruzione olografica (disponibile in commercio) elaborerà automaticamente l'acquisizione senza lente per ottenere l'immagine di fase della coltura delle cellule. L'algoritmo di ricostruzione olografica si basa su un algoritmo di recupero multi-lunghezza d'onda fase17 e fornisce un'immagine ricostruita fase RGB nell'intervallo [-π, + π] per ogni singola cella sopra un grande campo di vista di 29,4 mm2. Il principio della lente-gratuita in linea olografia è quello di illuminare un campione sottile (z = 0) con un'onda piana (di ampiezza 1 dopo normalizzazione) e di rilevare su un sensore CMOS l'immagine di intensità di diffrazione successive a una breve distanza z = Z, in genere 1 mm dopo la campione. Nel nostro setup, l'illuminazione è passato in sequenza a 3 lunghezze d'onda (λ1= 0,450 µm, λ2= 0.540 µm, λ3= 0.647 µm) per misurare tre modelli di diffrazione del campione stesso.
2. cellula cultura dati analisi
- Per cella-tracking, è possibile utilizzare l'algoritmo di Trackmate, un plugin di Fiji open source per il rilevamento automatizzato delle singole particelle18. At in primo luogo, caricare l'acquisizione completa Time-lapse in Fiji (comando di sequenza di immagine di carico). A causa delle grandi dimensioni del set di dati, che presenta in genere 400 fotogrammi RGB di 29,7 Mb, è più veloce di caricarle in formato 8-bit. Successivamente il plugin Trackmate Fiji guida l'utente attraverso diverse fasi dell'algoritmo di rilevamento delle cellule, vale a dire una fase di rilevamento delle cellule, una fase di tracking cellulare e diversi filtri applicati per i rilevamenti di cella e le tracce computate. In ogni fase, gli algoritmi di configurare e visualizzare i risultati immediatamente in modo che, se necessario, si può facilmente navigare avanti e indietro per regolare le impostazioni. I vari menù dell'interfaccia Trackmate sono mostrati in Figura 2 con le impostazioni effettive utilizzate per l'esperimento di cellule HeLa.
- Impostare i parametri di input del software di acquisizione come segue (Vedi Figura 2). Impostare il diametro stimato blob di 15 pixel, la soglia di rivelatore a 0,25, la distanza massima di collegamento di 15 pixel, la distanza massima di gap-chiusura a 15 pixel e il numero di punti nelle tracce a 3.5.
Nota: Queste impostazioni variano ovviamente da un esperimento a altro, soprattutto il 'blob stimato diametro' che corrisponde alle dimensioni delle cellule (qui data in pixel di 1,67 µm). La stessa osservazione vale per la 'distanza max collegamento' che rappresentano la distanza massima percorsa da una cella all'interno di due fotogrammi consecutivi (qui dato in pixel di 1,67 µm). Il valore ottimo dipenderebbe sulla motilità cellulare ma anche sulla densità delle cellule. - Alla fine del processo di rilevamento delle cellule, generare i risultati sotto forma di tre file di testo ('Analisi' pulsante, Vedi Figura 2). Il file più utile, denominato 'Punti nelle statistiche di tracce', è costituito da una tabella che elenca rilevate tutte le celle con le loro posizioni rispettive (x, y) nell'acquisizione, il numero di telaio e il loro numero di traccia. Sulla base di questi dati, eseguire la segmentazione delle cellule e rilevare divisioni cellulari utilizzando algoritmi dedicati (vedere file di codice supplementare). Gli altri due file sono denominati 'Links nelle statistiche di tracce' e 'Tenere traccia delle statistiche' e includere tutti i risultati a che fare con le tracce, ad esempio traccia durate, numero di lacune rilevate, traccia fotogramma iniziale, ecc.
- Utilizzare l'algoritmo di segmentazione delle cellule (Vedi codice supplementare file) per estrarre automaticamente diversi parametri che descrivono la morfologia delle cellule dall'immagine ricostruita fase. Queste metriche sono l'area della superficie delle cellule (S), la lunghezza di asse maggiore della cella (L), la lunghezza di asse minore di cella (l) e le proporzioni di cella (L/l). La fase ha recuperata da microscopia privo di lente è proporzionale alla densità e spessore dello strato esemplare come discusso in precedenza15.
- Oltre alle caratteristiche morfologiche della cellula, estrarre misure (CDM) della massa secche quantitativa delle cellule dalla fase ricostruito13,19,20
EQ. (1)
dove φ(x,y) è la fase ricostruito MAIUSC19, λ la lunghezza d'onda e α = 1,8 x 10-4 m3/kg l'indice di rifrazione specifico che riguarda la variazione dell'indice di rifrazione per asciugare la massa1, 19. - Valutare lo spessore di cella utilizzando una stima della differenza tra l'indice di rifrazione delle cellule e quella del terreno di coltura. La relazione tra la cella spessore h(x,y) e lo sfasamento misurato è dato da20:
EQ. (2.1)
EQ. (2,2)
con Δn(x,y) = ncella (x,y) - nmedia (x,y), la differenza di indice di rifrazione tra la cella e i terreni di coltura. In seguito, assumono un valore costante di Δn = 0.025, che è stimato dall'indice di rifrazione misurato nei nuclei delle cellule HeLa (n = 1.35511) e quella dei terreni di coltura di tampone fosfato salino (PBS) (n = 1.33). Anche se il valore di spessore di cella è solo indicativo in quanto si basa su un presupposto, sue relative variazioni sono significative e possono essere sfruttate per rilevare le cellule in divisione. - Utilizzare l'algoritmo dedicato (Vedi codice supplementare file) per rilevare la presenza di divisioni cellulari e quindi estrarre le tracce delle cellule che sono associate alle divisioni cellulari rilevate, al fine di rilevare una divisione cellulare, le cellule con un più grande di 8 µm di spessore misurato sono in primo luogo identificato, quindi verificare se una nuova cella apparirà strettamente in spazio e tempo. In questo modo, la rilevazione di divisioni cellulari si basa su due criteri robusti. Alternativa e più elaborati metodi per il rilevamento di divisione cellulare possono essere applicati al lensfree time-lapse acquisizione21,22,23.
EQ. (1)
EQ. (2.1)
EQ. (2,2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Per il processo di ricostruzione olografica, il campo di luce è descritta da un campo scalare A (dove 
è il valore complesso di A sull'aereo a distanza z dalla posizione del campione e laterale 
e a lunghezza d'onda λ). Propagazione della luce è modellato con la teoria di Huygens-Fresnel che fornisce un kernel propagatore 
. Di conseguenza, l'ampiezza di campo presso l'aereo del rivelatore, unaz è relativo all'ampiezza di luce un0 dalla seguente relazione:
vale a dire
con 
, dove i è il numero complesso (ho2=-1)
La misura di intensità è semplicemente modellata da 
. Lo scopo dell'algoritmo di ricostruzione è quello di trovare un campo 'buono' A0, imparentato con il campione osservato, quali diffrazione sarebbe partita l'intensità misurata Iz. La strategia è quello di considerare la fase di campo di ampiezza presso il rivelatore piano φz come sconosciuto del problema e ottimizzare un criterio multispettrali variazione totale dell'oggetto. Considerando più esplicitamente, i campi
vale a dire
per qualsiasi fase campo φz, 
si abbina perfettamente i dati dal 
. Modo che il campo successivo 
è un campo di ampiezza possibile sul piano del campione, dato l'immagine di intensità osservata. Questo è il motivo perché un criterio relativo A0 viene utilizzato per specificare una soluzione unica tra tutte le possibilità di corrispondenza di dati. Il criterio per ridurre al minimo è stato scelto come:
dove x e y sono le coordinate per l'aereo, vale a dire 
. Utilizzando tale criterio permette di selezionare, tra tutti i campi possibili, un campo di esempio visualizzati da spigoli vivi nella stessa posizione per tutte le lunghezze d'onda, che è fisicamente significativa. Questo metodo riduce l'insorgenza di 'twin-immagini' nel campo ricostruito un0. Il 'gemello-image' è un manufatto importante che deriva da una mancanza di informazioni di fase durante il processo di acquisizione.
Per il calcolo pratico, gli integrali vengono discretizzati con un campionamento spaziale corrispondente per la risoluzione del sensore, i derivati sono sostituiti dagli operatori di Sobel e circonvoluzioni dal propagatore di Huygens-Fresnel 
vengono eseguite passando nello spazio di Fourier dove 
ha un'espressione semplice: 
. Minimizzazione del ε di criterio (reale) rispetto alle variabili (reale) set 
viene affrontato utilizzando il metodo del gradiente coniugato non lineare, che richiede il gradiente di ε essere calcolati per qualsiasi fase associato con ogni pixel detector per ogni lunghezza d'onda.
Cella ricostruzione/Phase unwrapping
Figura 3 Mostra i risultati della ricostruzione olografica di un fotogramma di un time-lapse acquisizione delle cellule HeLa in cultura. Figura 3a Mostra il campo visivo completo di un'acquisizione raw nel canale blu su un'area di2 29,4 mm. Basandosi su questa immagine e quelle acquisite nei canali rossi e verdi, la ricostruzione olografica produce un'immagine di fase RGB delle cellule come mostrato nelle figure 3b e 3C. L'immagine ricostruita fase ospita reperti localmente avvolto fase corrispondente a cellule che inducono un cambiamento di fase superiore a + π. Al fine di eseguire una semplice fase di scartare, abbiamo implementato una media euristica, vale a dire rileviamo i pixel con il valore 
superiore a 0,3 e impostare questi pixel a + π. Questo semplice metodo è basato su una proprietà delle immagini RGB ricostruito fase. In teoria ogni pixel dovremmo misurare un rapporto 
uguale a 
. Ma nel caso delle cellule mitotiche, in caso di spostamento di fase, questa relazione non è più mantenuta nell'immagine ricostruita fase RGB (Figura 3f). Il metodo euristico di cui sopra si avvale di questa proprietà, così che un semplice valore di soglia può essere utilizzato per rilevare i pixel che presentano avvolgimento di fase. I risultati dell'immagine ricostruita fase prima e dopo la rimozione del wrapping è mostrato nelle figure 3f e 3G, rispettivamente. Queste immagini di fase non confezionati vengono poi inserite nell'algoritmo di rilevamento delle cellule. Senza questo passaggio unwrapping, l'algoritmo di rilevamento delle cellule non riuscirebbe a individuare le cellule in divisione e cellule di grande spessore, che comprometterebbe i risultati finali. La risoluzione dell'immagine ricostruita fase è stata stimata essere circa 5 µm15 (pieno-passo risoluzione spaziale), che è relativamente grossolana. È comunque possibile osservare dettagli come lamellipodi e cella citoplasma (figure 3f e 3G). La cosa più importante, l'immagine ottenuta da microscopia privo di lente consente di visualizzare un grande contrasto ed è esente di manufatti di halo. Questo facilita il rilevamento automatico delle cellule e cellula-tracking.
Analisi dei dati di cella cultura
Per estrarre il ciclo cellulare i brani, l'analisi dei dati si basa su una serie di algoritmi diversi, vale a dire la cellula monitoraggio effettuato con il plugin Trackmate Fiji, la rilevazione delle divisioni e, in ultima analisi, l'estrazione della cella piste ciclabili, cioè la sequenza tra due divisioni cellulari. In seguito discutiamo la qualità delle uscite di questi algoritmi rispetto alle misurazioni manuali.
La figura 4 Mostra diverse schermate dei risultati cella-tracking, i risultati dell'algoritmo di rilevamento di cella e i risultati dell'analisi delle cellule-rilevamento. La rilevazione delle cellule nell'acquisizione privo di lente (figure 4a-4 c) è il primo passo dell'algoritmo di rilevamento delle cellule. Al fine di convalidare l'algoritmo di rilevamento delle cellule, abbiamo annotato manualmente una piccola porzione dell'acquisizione lente-free time-lapse (214 fotogrammi di 663 x 663 µm2). Abbiamo selezionato un totale di 5365 posizioni di cella e paragonato questi risultati con quelli ottenuti dal plugin Trackmate Fiji manualmente. La figura 5 Mostra i risultati in termini di rilevamento reale, falsi positivi e falsi negativi. La sensibilità risultante è di circa il 96% e il valore predittivo positivo grande come 99,7%. Questi valori elevati riflettono la buona qualità delle immagini ricostruite fase ottenute con l'installazione di lenti-libero video microscopia. Dopo la rilevazione delle cellule, un algoritmo di segmentazione delle cellule permette di misurare — per ogni cella — diverse metriche diverse, ad es. l'area di celle, la cella a secco massa e lo spessore delle cellule. Figura 6a raffigura il principio dell'algoritmo di segmentazione e Figura 6f Mostra immagini segmentate in una sequenza temporale per una regione di interesse di 663 x 663 µm2 (lo stesso come nella Figura 5). L'algoritmo inizia la segmentazione di soglia l'immagine di fase (Vedi Figura 6b) e poi si applica una procedura di semina (Vedi Figura 6C). Vale a dire i pixel del centro delle cellule rilevate sono impostati al valore di traccia corrispondente. Le posizioni di X-Y delle cellule e il corrispondente numero di traccia sono fornite dal file 'Punti nelle statistiche di tracce' ottenuto dopo il monitoraggio cellulare. Quindi, una procedura iterativa di riempimento viene implementata che estende il seme per i confini della cella (figure 6 c-e) determinato dalla soglia iniziale (Figura 6b). Questa procedura di riempimento si basa sulle operazioni di base in morfologia matematica, ad esempio, dilatazione ed erosione. Dal risultato della segmentazione, è quindi possibile calcolare metriche diverse a livello di singola cellula, cioè le caratteristiche morfologiche come la lunghezza della cella, l'area di cella e le proporzioni delle cellule, ma anche, cosa ancora più importante, la cella a secco massa secondo EQ. 1. Al fine di valutare l'affidabilità della microscopia lente senza misurazione della cella massa secca, abbiamo confrontato l'immagine di fase ricostruito senza la lente delle cellule HeLa fisse (Figura 6 g) con la stessa regione acquisite per mezzo di un digitale olografico microscopia con un obiettivo X 5 (Figura 6 h). Figura 6i spettacoli la cella a secco massa misurate da dire di microscopia privo di lente come una funzione della massa secca misurata con DHM per 302 segmentati cellule HeLa. C'è una buona correlazione tra le due misure (coefficiente di determinazione R2 è 0,86, pendenza = 0,9, offset = pg-17). Da Figura 6i, possiamo stimare la precisione della misurazione massa secca delle cellule ottenuta mediante microscopia privo di lente. La precisione, misurata come l'errore quadratico medio tra i dati privo di lente e la vestibilità lineare, è circa 16 pg.
Durante la compilazione di tutte le misurazioni di singola cellula sopra l'aquisizione full time-lapse, è quindi possibile ottenere scatterplot dei diversi parametri in funzione del tempo, come mostrato nella Figura 7. Questi scatterplot fornire informazioni sulla cinetica delle cellule coltivate su una popolazione molto numerosa. Aumenta il numero di cellule nel campo visivo da 2.000 fino a 15.000 (Figura 7a). Moltiplicato per il numero di intervalli di tempo, questo porta ad un dataset di grandi dimensioni di 2.2 x 106 rilevato cellule, ciascuno di essi caratterizzato dalle relative coordinate e le caratteristiche morfologiche, cioè massa secca di cella (Figura 7b), area di cella (Figura 7 c) , spessore medio (Figura 7 d), lunghezza asse maggiore (Figura 7e) e rapporto di aspetto (Figura 7f) celle.
Soprattutto, la combinazione di rilevamento delle cellule e gli algoritmi di segmentazione delle cellule consente di misurare la cinetica a livello di singola cellula. Ad esempio, la figura 8 Mostra l'analisi di una cella tenere traccia della durata di circa 66 ore e che esibisce quattro divisioni cellulari a T0 + 4,1 h, T0 + 20,5 h, T0 + h 36,7 e T0 + h. 53,3 Figura 8a mostrano i risultati dell'algoritmo di segmentazione di cella automatica che permette Noi di delineare in modo efficiente la superficie di questa cella. Utilizza la segmentazione della cellula, è quindi possibile calcolare metriche diverse in funzione del tempo, ad esempio l'area della superficie delle cellule (figura 8b), la cella a secco massa (Figura 8c), lo spessore medio delle cellule (Figura 8 d) e la cella motilità (Figura 8e). Da questi grafici, uno può misurare chiaramente la cinetica di queste metriche cellulare tra divisioni cellulari. In particolare si può osservare l'aumento della superficie cellulare e massa secca durante un ciclo cellulare. Inoltre, utilizzando il rilevamento automatico di divisioni cellulari, tre piste di diverso ciclo cellulare possono essere estratta da questo brano e la durata del ciclo cellulare, cioè il periodo che intercorre tra due divisioni, può essere stimato. Sulla pista singola cella illustrata nella Figura 8, abbiamo misurato tre durate del ciclo cellulare, vale a dire 16,4 h, 16,2 h e h. 16,7 compilazione di tutto il ciclo cellulare le tracce dall'analisi di un 2,7 giorni risultati di time-lapse acquisizione nella rilevazione di 16725 divisioni cellulari e la descrizione di 10.584 tracce del ciclo cellulare. È quindi possibile misurare la media e la variabilità della durata ciclo cellulare con statistiche di suono. Abbiamo trovato che la distribuzione della durata ciclo cellulare è vicino a distribuzione gaussiana (figura 9a) con una media di 16,5 h e una deviazione standard relativa del 12,4% (deviazione standard misurato sulla cima della gaussiana divisa per la media della distribuzione ). La media di 16,5 h il tempo di raddoppiamento è coerenza con le lunghezze di ciclo cellulare misurate manualmente sulla pista presentata in Figura 8. Si trova tuttavia nella gamma più bassa dei valori pubblicati per HeLa raddoppio tempo che sono solitamente fra 20 e 30 h24,25,26,27. Tuttavia, nel riferimento28, viene citato anche un breve tempo di raddoppiamento di 16,2 ± 1,7 h. Al fine di convalidare le nostre misurazioni di lunghezze di ciclo cellulare e confermare l'affidabilità della nostra tecnica di microscopia privo di lente ulteriormente, abbiamo effettuato un rilevamento manuale di 100 tracce del ciclo cellulare (10.148 posizioni di cella). Sulla cella ciclabili ottenuti manualmente (N = 100) è la lunghezza del ciclo cellulare misurato 16.7±1.9 h (N = 100, Figura 9b). Questo è molto vicino alla misura di 16.5±2.1 h (N = 10.584) ottenuti con la cella automatica di rilevamento, dimostrando la validità dell'analisi complessiva. Quando confrontando il rilevamento manuale del ciclo cellulare traiettorie a quella determinata automaticamente, abbiamo trovato che 67% delle piste ciclo cellulare sono stati rilevati correttamente e che le lunghezze di ciclo misurata automaticamente sono ben correlati a quelli misurati manualmente (Figura 9b). L'efficienza di rivelazione delle traiettorie ciclo cellulare è stata misurata nelle prime ore 32 dell'esperimento, con una densità inferiore a 150 cellule/mm2. Questo tasso di rilevamento ovviamente diminuisce con il tempo, come la cellula aumenta la densità ~ 500 cellule/mm2. Il numero di tracce rilevate ciclo cellulare raggiunge un plateau in T0 + 32 h (Figura 9C) mentre il numero delle cellule aumenta ancora di un fattore tre tra T0, T0 + 32 h e 72 h (Figura 7a). Considerando il tasso di falsi positivi e negativi rilevamenti, Figura 9b presenta valori 5 erratici punti: 4 di loro sono a causa del rilevamento del falso negativo (lunghezza di ciclo > 25 h) e 1 al rilevamento di un falso positivo (lunghezza di ciclo < 10 h). Per ottenere questo risultato, abbiamo usato una soglia elevata sullo spessore (8 µm) nell'algoritmo di rilevamento di divisione delle cellule, al fine di favorire un basso tasso di falsi positivi. Inoltre, le tracce che presenta incoerenza sono state filtrate fuori, cioè ciclo cellulare cui durata è inferiore a 6 h e tracce con una traiettoria di massa secca che non aumenta linearmente in funzione del tempo. Sono solo il 3% del numero totale di tracce del ciclo cellulare. Di conseguenza, la distribuzione della lunghezza di ciclo cellulare ottenuto automaticamente è ben approssimata da una gaussiana (figura 9a) con un basso numero di brevi brani (durata del ciclo cellulare < 10 h, 5,1% del numero totale di tracce) che risulterebbe da false rilevamenti di divisione positivo. Allo stesso modo, brani visualizzati da un lungo ciclo cellulare, che sarebbe parzialmente i risultati di rilevamenti di falsi negativi divisione, sono rari (durata del ciclo cellulare > 25 h, 2,4% del numero totale dei brani). Manuale rilevamento delle traiettorie ciclo cellulare è stato utilizzato anche per valutare ulteriormente la tracciabilità delle cellule eseguita con il plugin. Abbiamo misurato sulle 6693 cellule un'accuratezza di localizzazione globale di 1,6 µm su punti corrispondenti, che è all'interno di un passo del pixel (1.67 µm).
Altri parametri possono essere esaminati, come la massa secca iniziale delle cellule (solo dopo una divisione), la massa finale secca (poco prima di una divisione cellulare), nonché il tasso di crescita medio durante il ciclo cellulare. Figura 9d trame le masse secche di cella iniziale e finale in funzione del tempo. Si vede che entrambe le masse secche di cella iniziale e finale diminuiscono con il tempo. Il valore mediano della cellula iniziale secchezza massa diminuisce da 223 pg giù per 130 pg e la cella finale massa da 460 pg giù per 220 pg. Il rapporto tra i due rimane stabile a 1.89 ± 0,12 durante l'intero esperimento (Figura 9d-e). Infine, Figura 9f Mostra l'evoluzione del tasso di crescita di massa secca di cella in funzione del tempo sopra le piste ciclo cellulare 10.584 e abbiamo scoperto che la diminuzione nel tasso di crescita delle cellule è una tendenza comune per la popolazione intera cella in questo particolare esperimento.
Figura 1: microscopia privo di lente. (un) disegno schematico dell'apparato di acquisizione di microscopia privo di lente. (b) foto del video 6-wells privo di lente del microscopio. Utilizza un sensore di immagine CMOS con un pixel pitch di 1,67 µm e un'area di imaging di 6,4 x 4,6 mm = 29,4 mm2. Illuminazione è fornita da un multi-colored LED RGB con un foro stenopeico posizionato ad una distanza di circa 5 cm dal campione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: interfaccia Trackmate. Menu principali del plugin mostrato con le impostazioni effettive utilizzate per la cella di HeLa esperimento. Il diametro stimato blob è stato impostato su 15 pixel, la soglia del rivelatore è stata impostata su 0,25, la distanza massima di collegamento è stata impostata su 15 pixel, la distanza massima di gap-chiusura è stata impostata su 15 pixel e il numero di spot in tracce è stato impostato su 3.5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: processo di ricostruzione olografica. (a) acquisizione Raw delle cellule HeLa in coltura mediante microscopia privo di lente (campo visivo completo di 29,4 mm2). (b) dettaglio di (a). (c) dettaglio di (b). (d), RGB ricostruita immagine di fase (campo visivo completo di 29,4 mm2). (e) particolare (d). (f) dettaglio della (e). (g) fase immagine ottenuta dopo fase scartare per essere paragonato a (f), prima di scartare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: catture di schermo dei risultati delle cellule-rilevamento eseguiti utilizzando il plugin di Trackmate Fiji. (un) risultati dell'algoritmo di rilevamento di cellulare che si basa su un laplaciano del rivelatore gaussiana (LoG). L'immagine mostra il campo visivo completo dell'acquisizione senza lente a T0 + 16h40min in cui vengono rilevate 2.451 cellule. Quest'ultimo è circondato da un cerchio viola. (b) risultati dell'algoritmo di rilevamento delle cellule. Tutte le canzoni di cella sono contraddistinti da un codice colore corrispondente alla velocità mediana oltre 50 fotogrammi (~ 8 ore). (c, d) Dettagliate immagini di (a) e (b) rispettivamente (rettangolo giallo). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: convalida della fase di rilevamento delle cellule dell'algoritmo di rilevamento delle cellule. (a) immagine ritagliata di HeLa cellule in coltura (663 x 663 µm2) dove la cella selezionata a mano vengono contrassegnati con traverse blu e quelle rilevate con l'algoritmo di rilevamento delle cellule sono contrassegnate con croci rosse. Ciò consente la determinazione del rilevamento del falso positivo (cerchio rosso) e rilevamenti di falsi negativi (cerchio arancione). (b) il tasso di rilevamento reale (linea verde), falso positivo (linea rossa) e la rilevazione di falsi negativi (arancione) vengono tracciate come funzione del tempo esperimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: risultati della segmentazione cell. (un'un) Reconstructed fase immagine di una regione di interesse dell'acquisizione Time-lapse in T0 + 7 h (663 x 663 µm2). (b) l'algoritmo avvia la segmentazione soglia che l'immagine di fase (c), la segmentazione inizia con una procedura di semina, cioè i pixel del centro delle cellule rilevate sono impostati al valore di traccia corrispondente. (d-e) Successivamente e in modo iterativo viene implementata una procedura di riempimento che estende il seeding iniziale per i confini della cella determinata dalla soglia iniziale (b). (f) il risultato dell'algoritmo di segmentazione è indicato per una sequenza temporale su una regione di2 µm 663 x 663 (lo stesso come nella Figura 5). La segmentazione è mostrata come una superficie colorata sovrapposta nella parte superiore dell'immagine ricostruita fase. Si noti che il segnale privo di lente è provenienti prevalentemente dalla regione nucleare, e le aree segmentate cadono vicino al nucleo. (g), Reconstructed fase ottenute da microscopia privo di lente in fissa cellule HeLa. Si tratta di un'immagine ritagliata del campo di vista completo di 29,4 mm2. immagine (h) fase della regione mostrata in (g) ottenuta da microscopia digitale oleografica con un obiettivo X 5 (NA 0,12) illuminata con un laser a 647 nm. (io) trama della cella asciutta massa ottenuta mediante microscopia privo di lente in funzione della massa secca misurata mediante DHM. Il scatterplot compila 302 misure di celle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: analisi dei dati di un'acquisizione lente-free time-lapse di 2,7-giorno delle cellule HeLa. (a) totale numero di cellule contate in pieno campo visivo di 29,4 mm2 come funzione del tempo. (b), Scatterplot della cella asciutta messa in funzione del tempo. Su ogni scatola, corrispondente a un bidone di 6 ore, il segno centrale rosso indica la mediana e i bordi superiore e inferiore della finestra di indicano i percentili 25 e 75 °, rispettivamente. I baffi si estendono per i punti dati più estremi non considerato outlier. (c-f) Scatterplot della cella segmentato zona (c), lo spessore medio delle cellule (d), la lunghezza di asse maggiore delle cellule (e) e le proporzioni delle cellule (f) in funzione del tempo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: analisi dei dati di una traiettoria di cella giorno 2,7 (intervallo di fotogrammi di 10 min). (un) cella segmentazione eseguita sull'acquisizione di una traccia di cella durano circa 66 h time-lapse. La cella di interesse viene visualizzata con una sovrapposizione di blu. Ogni immagine ritagliata è 53x53 µm2. Le divisioni delle cellule sono indicate con cerchi gialli. (b) terreno della superficie delle cellule in funzione del tempo. (c) evoluzione nel tempo della cella a secco massa calcolata dall'integrale della fase sopra l'area di cella segmentato secondo EQ. (1). spessore della cella (d) trama della media calcolata in funzione del tempo secondo EQ. (2). Lo spessore delle cellule presenta picchi aguzzi, corrispondenti alle divisioni cellulari (giallo cerchi linee in (a) e rosse (b-c-d-e)). (e) trama della motilità cellulare in funzione del tempo. risultati (f) segmentazione corrispondente all'ultimo fotogramma della pista a T0 + 66h20min quando la densità delle cellule è di circa 475 cellule/mm2. L'immagine è 200 x 200 µm2 centrato sulla cellula di interesse. Le macchie bianche (asterischi rossi) corrispondono ai detriti cellulari che compaiono dopo un giorno di coltura cellulare. (g), 800 x 800 µm2 ritagliata immagine ricostruita fase dell'ultimo fotogramma di questa pista della cella. La cella di interesse è circondata da un cerchio giallo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: analisi del ciclo cellulare. (a) distribuzione della durata ciclo cellulare per un'osservazione di 2,7-giorno di HeLa coltivata cellule (N = 10, 584 cicli cellulari). La distribuzione della durata ciclo cellulare è vicino una gaussiana con una media di 16,5 ore e una deviazione standard relativa del 12,3% (deviazione standard misurato sulla cima della gaussiana divisa per la media della distribuzione). cella (b) confronto tra il manuale e automatico di rilevamento per la determinazione della lunghezza del ciclo cellulare. Il tracciamento manuale dispone di 100 ciclo cellulare traiettorie (10.148 posizioni di cella). (c) distribuzione di partenza tempo delle traiettorie automaticamente rilevato ciclo cellulare. massa (d) trama della cellula iniziale misurata a secco (appena dopo la divisione cellulare, nero punti) e massa cella finale secca (poco prima della divisione cellulare, rosso punti) in funzione del tempo. Su ogni scatola, corrispondente a un bidone di 6 h, l'interrogativo centrale rosso indica la mediana e i bordi superiore e inferiore della finestra di indicano i percentili 25 e 75 °, rispettivamente. I baffi si estendono per i punti dati più estremi non considerato outlier. (e), Scatterplot della cella finale secca messa in funzione della massa secca iniziale. (f) evoluzione del tasso di crescita della massa secca di cella in funzione del tempo di esperimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplementare File 1: codice 'segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m'. Questo codice Matlab utilizza il set di dati 'trackmate' per eseguire la segmentazione delle cellule della completa acquisizione di time-lapse di cui le immagini ricostruite fase vengono salvate nella cartella 'folder_out'. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Supplementare File 2: codice 'lineage_Version_Jove.m'. Questo codice utilizza la matrice 'trackmate' elaborato con l'algoritmo di segmentazione delle cellule (segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m), per estrarre le traiettorie del ciclo cellulare e di determinare i diversi parametri di interesse, ad es., la cella durata del ciclo, la cella iniziale massa secca e la cella finale massa secca. Questo codice è in due parti, la prima parte si occupa con la rilevazione della divisione delle cellule e la seconda parte con l'analisi delle traiettorie ciclo cellulare. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
In questa carta, indichiamo che lente-libero video microscopia può essere utilizzato all'interno di un'incubatrice per catturare la cinetica di migliaia di celle. Al fine di descrivere la metodologia globale che abbiamo spiegato come un'acquisizione di time-lapse 2,7 giorno delle cellule HeLa in cultura possa essere analizzati con algoritmi di rilevamento delle cellule standard. Il risultato è un set di dati con 2.2 x 106 cella misure e 10.584 tracce del ciclo cellulare. Le acquisizioni sono state effettuate su una cultura di cellule Hela con una distanza relativamente grande cellula--cellula (densità di cella < 500 cellule/mm2) e delle cellule morfologia che può essere approssimato con un disco. Queste due caratteristiche facilitano l'applicazione di un'analisi delle cellule-rilevamento automatica che permette di raccogliere un ampio set di dati. Altre linee cellulari con la più piccola cellula--cellula distanza o con morfologie più complesse sarebbe più difficile tenere traccia e set di dati successivo sarebbe più piccolo.
Crediamo che questo approccio è interessante per molti studi, per esempio per gli studi di dimensione delle cellule e proliferazione delle cellule. Questi ultimi sono un'importante area di ricerca in biologia fondamentale e molte domande rimangono senza risposta come ben discusso in una revisione di Ginzberg et al. 29. il protocollo proposto in questo lavoro fornisce così un mezzo per misurare parametri fondamentali necessari per gli studi di proliferazione cellulare, cioè la durata del ciclo cellulare, la massa secca di cella, il rapporto massa secca di cella tra la fine e l'inizio del ciclo e la cella tasso di crescita della massa secca. Oltre allo studio della proliferazione cellulare, questo metodo sarà di interesse per lo studio della migrazione cellulare, poiché può produrre un gran numero di brani, ciascuno della durata di diverse ore. Il presente protocollo va oltre l'avanguardia14,30 dimostrando per la prima volta l'acquisizione di migliaia di brani di cella durante più di 10 h.
In conclusione, abbiamo sviluppato una tecnica di lente-gratuita facile da usare che permette di monitorare simultaneamente migliaia di cellule privo di etichetta sopra parecchi giorni di cultura.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori non hanno nulla a riconoscere.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
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