الفيديو خالية من عدسة مجهرية للدينامية والتحليل الكمي للثقافة الخلية ملتصقة

Summary

مجهرية خالية من عدسة الفيديو تمكننا من رصد الثقافات الخلية مباشرة داخل الحاضنة. هنا يمكننا وصف كامل البروتوكول المستخدمة لاكتساب وتحليل عملية شراء 2.7 يوم طويل من خلايا هيلا مثقف، مما يؤدي إلى dataset من 2.2 x 10⁶ قياسات مورفولوجيا الخلايا الفردية ودورة الخلية 10584 المسارات.

Abstract

هنا، علينا أن نبرهن أن الفيديو خالية من عدسة مجهرية تمكننا من التقاط حركية الآلاف من الخلايا مباشرة داخل الحاضنة في وقت واحد، وأنه من الممكن لرصد وتحديد خلايا مفردة على طول عدة دورات الخلية. يصف لنا كامل البروتوكول المستخدمة لرصد وقياس ثقافة خلية هيلا لأيام 2.7. أولاً، يتم تنفيذ اكتساب ثقافة الخلية مجهر خالية من عدسة فيديو، وثم يتم تحليل البيانات بعد عملية من أربع خطوات: التعمير المجسم متعدد الطول الموجي، تتبع الخلية، الخلية تجزئة وانقسام الخلية الكشف خوارزميات. نتيجة لذلك نحن تظهر أنه من الممكن جمع من dataset يضم أكثر من المسارات دورة الخلية 10,000 وأكثر من 2 × 10⁶ خلية القياسات المورفولوجية.

Introduction

رصد خلايا الثدييات مثقف طوال عدة دورات الخلية وقياس دقة الخلية خلية وحجم الكتلة الجافة مهمة صعبة. العديد من التقنيات البصرية خالية من التسمية قادرة على أداء هذه المهمة^1،2: التحول من مرحلة قياس التداخل³، الميكروسكوب المجسم الرقمي (DHM)^4،،من^{56، 7}، كوادريوافي الجانبي القص التداخلي^8،9 والكمية المرحلة التصوير المقطعي^10،11. وأدت هذه الأساليب إلى العديد من الأفكار الجديدة في فهم دورة خلية من خلايا الثدييات. لكن نادراً ما كانت تقترن بالتلقائية خلية تتبع خوارزميات والإنتاجية بهم لا يزال محدودا عند قياس الخلية مسارات الشامل¹ (N < 20 على التوالي^3،،من^{45 , 6}). وبالتالي مطلوب طريقة بصرية جديدة لقياس مسارات الخلية الجماعية مع إحصاءات كبيرة (N > 1000).

في هذه الورقة، ونظهر قدرة مجهرية خالية من عدسة الفيديو الصورة في الوقت نفسه آلاف خلايا مباشرة داخل الحاضنة، وثم تحديد المقاييس خلية واحدة على طول آلاف مسارات الفردية دورة الخلية. خالية من عدسة مجهرية هو مرحلة كمية التصوير الأسلوب الذي يتيح الحصول على صورة المرحلة من كثافة الخلايا عبر مجال رؤية كبير جداً (عادة عدة عشرات من مم²، هنا 29.4 مم²)^{12،13 ،،}من¹⁴¹⁵. يتم تحديد المقاييس عدة على مستوى الخلية الواحدة، مثلاً، خلية المنطقة وخلية الكتلة الجافة، وسمك الخلية، طول المحور الرئيسية الخلية والخلية نسبة العرض إلى الارتفاع^12،15عاماً من كل صورة. ثم قم بتطبيق خوارزمية تتبع الخلية، يمكن رسم هذه الميزات لكل خلية واحدة كدالة لل^14،وقت التجربة¹⁵. وعلاوة على ذلك، عن طريق الكشف عن حدوث انقسامات الخلية في مسارات الخلية، فمن الممكن لاستخراج معلومات هامة أخرى مثل الخلية الأولى الجماهيري (فقط بعد انقسام الخلية)، والكتلة الجافة الخلية الأخيرة (قبل انقسام الخلية) والخلية الجافة دورة مدتها، أي، والفترة الزمنية بين شعبتين على التوالي¹⁵. يمكن أن تحسب جميع هذه القياسات مع إحصاءات جيدة جداً (N > 1000) نظراً لمجال الرؤية الكبيرة عادة ما يسمح تحليل الخلايا 200 إلى 10,000 في عملية شراء واحدة خالية من العدسة.

من أجل شرح هذه المنهجية استناداً إلى الفحص المجهري خالية من عدسة الفيديو، يصف لنا بروتوكول رصد وقياس ثقافة خلية هيلا لأيام 2.7. تحليل البيانات من أربع خطوات عملية تقوم على التعمير المجسم متعدد الطول الموجي وتقسيم الخلية وخلية تتبع خوارزميات انقسام الخلية. ويتضح هنا أن القرار المكانية ومعدل الإطار سريع نسبيا (شراء واحدة كل 10 دقائق) التي تم الحصول عليها مع هذا الإعداد مجهرية خالية من عدسة الفيديو متوافق مع معيار خلية تتبع خوارزميات. تحليل كامل لمجموعة البيانات هذه النتائج في قياس 10,584 خلية المسارات عبر دورات خلية كاملة.

وباختصار، مجهرية خالية من عدسة الفيديو أداة قوية لرصد تلقائياً الآلاف من غير مسمى، وغير المتزامنة، وخلايا غير معدلة كل تجربة؛ كل خلية يتم تعقب على مدى عدة دورات الخلية. وهكذا توفر لدينا قياسات متوسط قيمة العديد من المعلمات في الخلية، ولكن الأهم من ذلك، تباين بين الخلية على عدد كبير من الخلايا.

Protocol

1-خلية ثقافة رصد اكتساب

1. تنمو خلايا هيلا في دميم + الجلوتامين (مثلاً، جلوتاماكس) المتوسطة تستكمل مع 10% (v/v) إبطال الحرارة العجل الجنين المصل و 1% البنسلين ووالستربتوميسين.
2. معطف لوحات الثقافة أسفل الزجاج 6-جيدا مع فيبرونيكتين (25 ميكروغرام/مل) ح 1. ثم البذور 2 × 10⁴ خلايا كل بئر.
3. خلال اقتناء، تغيير في المتوسط كل 3 أيام.
4. للحصول على مرور الزمن، استخدام المجهر خالية من عدسة الفيديو (المتاحة تجارياً).
   ملاحظة: يستند هذا تقنية التصوير عدسة خالية الحسابية كما وصفها أوزكان et al. ¹⁶ الذي عدل لإجراء الرصد المستمر في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية^12،15التي تسيطر عليها. ويتميز جهاز استشعار صورة متمم (CMOS) أكسيد معدن المتمم مع الملعب بكسل من 1.67 ميكرومتر ومنطقة تصوير من 6.4 x 4.6 مم². فتوفرها متعددة الطول الموجي الإضاءة multichip خفيفة التي ينبعث منها قدر صمام ثنائي (المصابيح) جهاز، التي توفر إضاءة الأحمر والأخضر والأزرق. يتم توسيط في أطوال موجية، في 636 و 521 و 452 نانومتر على التوالي، مع عرض النطاق الترددي طيفية من 25 و 45 و 25 نانومتر على التوالي. أحمر-أخضر-أزرق (RGB) المصابيح تقع فوق ثقب ميكرومتر 150 على مسافة 5 سم تقريبا من الخلايا. قوة الضوء المقاسة قريبة من الصمام منخفضة قدر µW 10 في كل طول موجي والوقت الإضاءة ثانية واحدة فقط للحصول على. ومن ثم فمن المتوقع أي مشاكل صور-سمية عند ملاحظة الثقافات الخلية تحت المجهر خالية من عدسة الفيديو.
5. وضع الحاوية ثقافة الخلية وضعت في اتصال مع جهاز استشعار CMOS (الشكل 1). استخدام حاوية مع ساترة زجاجية في الجزء السفلي، ومهم للنوعية لاقتناء عدسة خالية. يمكن أيضا استخدام الحاويات البلاستيكية ولكنها ستنخفض الحصول على عدسة مجاناً نظراً لرداءة نوعية هذه الحاويات الضوئية.
6. التحكم بالمجهر خالية من عدسة الفيديو مع اقتناء البرمجيات (متاح تجارياً)، الذي يقوم بالحصول على مرور الزمن وإعادة بناء المجسم. المعلمات التي يتم إدخالها بواسطة المستخدم في واجهة البرنامج هي معدل الإطار، مدة التجربة، ونوع الثقافة الخلية، أي ملتصقة الخلايا أو الخلايا العائمة.
7. تعيين معلمات الإدخال من اقتناء البرمجيات. تعيين معدل الإطار تعيين إلى اقتناء واحد كل 10 دقائق، وتعيين نوع الثقافة الخلية إلى 'ملتصقة'.
   ملاحظة: معدل إطار لاقتناء واحد كل 10 دقائق حلاً وسطا جيدا كما أنه يضمن موثوق خلية تتبع بينما لا تزال معقولة حجم مجموعة البيانات الناتجة إلى تحليل. أسرع معدل الإطار يمكن تحقيقه مع هذا الإعداد خالية من عدسة مجهرية من اقتناء واحدة كل 5 دقائق. زيادة في معدل الإطارات يؤدي التسخين المفرط للاستشعار CMOS التي يمكن أن تؤثر على بقاء الخلايا في الثقافة.
8. بدء اكتساب الوقت الفاصل بين، وخوارزميه إعادة البناء الثلاثية الأبعاد (متاح تجارياً) سوف تلقائياً عملية اقتناء خالية من العدسة للحصول على صورة المرحلة ثقافة الخلية. خوارزمية إعادة البناء الثلاثية الأبعاد استناداً إلى خوارزمية استرداد متعددة الطول موجي مرحلة¹⁷ ويقدم صورة RGB مرحلة أعيد بناؤها في النطاق [-π، + π] لكل خلية واحدة عبر مجال رؤية كبير من 29.4 مم². مبدأ التجسيدي خالية من العدسة في خط هو تسليط الضوء على عينة رقيقة (في z = 0) مع موجه طائرة (من السعة 1 بعد تطبيع) والكشف عن الصورة كثافة حيود اللاحقة في z مسافة قصيرة على جهاز استشعار CMOS = Z، عادة 1 ملم بعد عينة. في الإعداد لدينا، يتم تبديل الإضاءة تسلسلياً إلى أطوال موجية 3 (λ₁= 0.450 ميكرومتر، λ₂= 0.540 ميكرومتر، λ₃= 0.647 ميكرومتر) لقياس أنماط الحيود ثلاثة من نفس العينة.

2-خلية ثقافة تحليل البيانات

1. لتتبع خلية، استخدام خوارزمية تراكماتي، المساعد فيجي مفتوحة مصدر التتبع الآلي من جزيئات مفردة¹⁸. أولاً، تحميل في الحصول على كامل الوقت الفاصل بين في فيجي (تحميل صورة تسلسل الأوامر). ونظرا للحجم الكبير لمجموعات البيانات، الذي يضم عادة 400 إطارات RGB 29.7 ميغا بايت، أنها أسرع تحميلها في الشكل 8-بت. التالية المساعد فيجي تراكماتي إرشاد المستخدم من خلال عدة مراحل من خوارزمية تتبع الخلية، إلا وهي مرحلة الكشف عن خلية ومرحلة تعقب خلية عدة عوامل التصفية المطبقة إلى اكتشافات الخلية والمسارات المحسوبة. في كل مرحلة، تكوين الخوارزميات وعرض النتائج فورا وذلك إذا لزم الأمر، واحد يمكن بسهولة التنقل ذهابا وإيابا إعادة ضبط الإعدادات. القوائم المختلفة لواجهة تراكماتي مبينة في الشكل 2 مع الإعدادات الفعلية المستخدمة في التجربة خلايا هيلا.
2. تعيين معلمات الإدخال للبرنامج الحصول على النحو التالي (انظر الشكل 2). تعيين قطر النقطة المقدرة إلى 15 بكسل، عتبة الكاشف إلى 0.25، المسافة القصوى الربط إلى 15 بكسل، وسد فجوة المسافة كحد أقصى إلى 15 بكسل، والعدد من المواقع في المسارات إلى 3.5.
   ملاحظة: تختلف هذه الإعدادات من الواضح من تجربة واحدة إلى آخر، ولا سيما 'النقطة المقدرة القطر' الذي يتوافق مع حجم الخلية (نظراً لهنا في بكسل 1.67 ميكرومتر). بهذا التصريح نفسه ينطبق على 'ربط ماكس المسافة' التي تمثل المسافة القصوى لخلية ضمن إطارين متتاليين (نظراً لهنا في بكسل 1.67 ميكرومتر). وسيتوقف قيمته المثلى على حركية الخلية ولكن أيضا على كثافة الخلية.
3. في نهاية عملية تتبع الخلية، تولد النتائج في شكل ثلاثة ملفات نصية ('تحليل' زر، انظر الشكل 2). الملف الأكثر فائدة، المسمى 'البقع في إحصاءات المسارات'، يتكون من قائمة بالكشف عن جميع الخلايا مع مواقف كل منهما (x, y) في اقتناء وعددهم الإطار وعددهم المسار. واستنادا إلى هذه البيانات، إجراء تقسيم الخلية والكشف عن انقسامات الخلية استخدام خوارزميات مخصصة (انظر ملفات التعليمات البرمجية التكميلية). يتم تسمية الملفات الأخرى 'الروابط في إحصاءات المسارات' و 'تعقب إحصائيات' وتشمل جميع النتائج التي تتعامل مع المسارات، مثل تعقب المدد، وعدد من الثغرات المكتشفة، وتتبع الإطار الأولى، إلخ.
4. استخدام خوارزمية تجزئة الخلية (انظر ملف التعليمات البرمجية التكميلية) استخراج عدة مقاييس تصف مورفولوجيا الخلايا من مرحلة إعادة بناء الصورة تلقائياً. هذه المقاييس هي مساحة الخلية (S) وطول المحور الرئيسية الخلية (L)، وطول المحور طفيفة الخلية (l) وخلية نسبة العرض إلى الارتفاع (L/l). مرحلة تعافي من مجهرية خالية من عدسة تتناسب مع كثافة وسمك طبقة العينة كما نوقش سابقا من¹⁵.
5. بالإضافة إلى السمات المورفولوجية للخلية، استخراج الكمية الخلية الجافة الشامل (إليه التنمية النظيفة) قياسات من^19،،من¹³مرحلة أعيد بناؤها²⁰
   (1) مكافئ.
   حيث φ(x,y) هو المرحلة أعيد بناؤها تحول¹⁹، λ الطول الموجي و α = 1.8 × 10^-4 م³/كغ الانكسار المحددة التي تتعلق بتفاوت الانكسار الجافة الشامل^{1، 19}.
6. تقييم سمك الخلية باستخدام تقدير الفرق بين الخلية الانكسار، وأن وسائل الإعلام الثقافة. ونظرا للعلاقة بين سمك الخلية h(x,y) ومرحلة قياس التحول هو قبل²⁰:
   (2.1) مكافئ.
   (2.2) مكافئ.
   مع Δn(x,y) = n_خلية (x,y)- ن_{المتوسطة} (x,y)، الانكسار الفرق بين الخلية وثقافة الإعلام. في ما يلي، تحمل قيمة ثابتة من Δn = 0.025، الذي يقدر من الانكسار المقاسة في نواة الخلية هيلا (n = 1.355¹¹) ووسائط الثقافة مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) (n = 1.33). على الرغم من أن قيمة سمك الخلية فقط الإرشادية كما أنه يقوم على افتراض، الاختلافات النسبية هي ذات مغزى ويمكن استغلالها للكشف عن تقسيم الخلايا.
7. استخدام خوارزمية مخصصة الخلايا (انظر ملف التعليمات البرمجية التكميلية) الكشف عن حدوث انقسامات الخلية ومن ثم استخراج المسارات الخلية المرتبطة إلى انقسامات الخلية المكتشفة، بغية الكشف عن انقسام الخلية، مع قياس سمك أكبر من 8 ميكرومتر يتم أولاً تحديد، ثم تحقق ما إذا كانت خلية جديدة تظهر عن كثب في الفضاء والوقت. وبهذه الطريقة، الكشف عن انقسامات الخلية يعتمد على معيارين قوية. يمكن تطبيق البديل وطرق أكثر تفصيلاً للكشف عن انقسام الخلية لاكتساب الوقت الفاصل بين لينسفري^21،،من²²²³.

Representative Results

لعملية إعادة البناء الثلاثية الأبعاد، يتم وصف الحقل الخفيفة بحقل القيم مفردة (حيث هي قيمة A معقدة على متن الطائرة على مسافة ض من الموقف عينة، والأفقي وفي الطول الموجي λ). وعلى غرار نشر الضوء بنظرية فريسنل هيغنز الذي يوفر نواة ناشر . ولذلك الحقل السعة في الطائرة كاشف، يرتبط _z إلى السعة الخفيفة ₀ بالعلاقة التالية:
أي
مع ، حيث الأول هو الرقم المركب (أنا²=-1)

قياس كثافة ببساطة على غرار قبل . وغرض خوارزمية إعادة الإعمار هو العثور على حقل 'جيدة' أ₀، تتصل بالعينة الملاحظ، أن تتطابق مع أي حيود قياس كثافة أنا_زي. وتهدف الاستراتيجية إلى النظر في المرحلة الميدانية السعة في φ الطائرة كاشف_z غير معروف مشكلة وتحسين معيار تباين الكلي متعددة الأطياف للكائن. أكثر صراحة، النظر في الحقول

أي
لأي المرحلة الميدانية φ_z، يطابق تماما البيانات منذ . حيث أن الحقل اللاحقة حقل سعة ممكنة في الطائرة عينة، نظراً لكثافة لاحظ الصورة. وهذا هو السبب لماذا يستخدم معيار على أ₀ لتحديد حلاً فريداً بين كافة إمكانيات مطابقة البيانات. واختير كالمعيار التقليل إلى أدنى حد:

حيث x و y هي إحداثيات للطائرة، أي . يتيح استخدام هذا معيار لتحديد حقل نموذج عرض حواف حادة في نفس الموقف لجميع الأطوال الموجية، التي ذات معنى جسديا، فيما بين جميع المجالات الممكنة،. هذا الأسلوب يقلل من حدوث 'التوأم-صور' في ميدان أعيد بناؤها ₀. 'التوأم-الصورة' هو الحرفية هامة الذي ينتج من نقص في المعلومات المرحلة أثناء عملية الاقتناء.

لحساب العملية، هي ديسكريتيزيد التكاملات مع أخذ عينات مكانية المقابلة للقرار الكاشف، المشتقات هي محلها ناشر فريسنل هيغنز مشغلي سوبيل وتلافيف يتم تنفيذها عن طريق الذهاب إلى الفضاء فورييه حيث بتعبير بسيط: . التقليل إلى أدنى حد اليورو (الحقيقي) المعيار فيما يتعلق بالمتغيرات المحددة (ريال مدريد) يتم معالجتها باستخدام أسلوب التدرج مترافق غير الخطية، الأمر الذي يتطلب تدرج اليورو حسابها لأي مرحلة المقترنة مع كل بكسل كاشف لكل الطول الموجي.

خلية مرحلة التعمير/إزالة التغليف
ويبين الشكل 3 نتائج إعادة الثلاثية الأبعاد في إطار واحد لعملية شراء الوقت الفاصل بين خلايا هيلا في الثقافة. ويبين الشكل 3 ألف مجال الرؤية الكاملة لعملية شراء الخام في القناة الزرقاء على مساحة² مم 29.4. وبناء على هذه الصورة، وتلك التي حصلت في قنوات الأحمر والأخضر، إعادة بناء المجسم تنتج صورة مرحلة RGB الخلايا كما هو موضح في الأرقام 3 وج 3. صورة المرحلة أعيد بناؤها معارض التحف المرحلة محلياً ملفوفة المقابلة للخلايا التي تحفز مرحلة التحول تتجاوز + π. بغية تنفيذ المرحلة بسيطة إزالة التغليف، نفذنا يعني الكشف عن مجريات الأمور، إلا وهي أننا كشف بكسل بالقيمة يتجاوز 0.3 وتعيين بكسل على هذه + π. هذا أسلوب بسيط يستند إلى خاصية الصور RGB أعيد بناء المرحلة. من الناحية النظرية في كل بكسل يجب أن نقيس نسبة تساوي . ولكن في حالة الخلية الانقسامية، عندما يحدث التفاف المرحلة، هذا هو لم يعد الحفاظ على العلاقة في صورة المرحلة أعيد بناؤها RGB (الرقم 3f). طريقة الكشف عن مجريات الأمور المذكورة أعلاه تستفيد من هذه الخاصية، حيث أنه يمكن استخدامها مستوى عتبة بسيطة للكشف عن بكسل عرض التفاف المرحلة. أظهرت نتائج مرحلة إعادة بناء الصورة قبل وبعد إزالة التغليف في 3f الأرقام و الجيل الثالث 3g، على التوالي. ثم يتم تغذية هذه الصور المرحلة ملفوف إلى الخوارزمية تتبع الخلية. دون هذه الخطوة إزالة التغليف، سوف تفشل الخوارزمية خلية تتبع للكشف عن الخلايا في الخلايا من سمك كبير، مما يخل بالنتائج النهائية وشعبة. دقة الصورة المرحلة أعيد بناؤها قدرت بحوالي 5 ميكرومتر¹⁵ (القرار المكانية كاملة في الملعب)، وخشن نسبيا. ومع ذلك فمن الممكن لمراقبة التفاصيل مثل لاميليبوديا والخلية السيتوبلازم (الأرقام 3f و 3g). الأهم من ذلك، يعرض وجود تباين كبير الصورة التي حصل عليها خالية من عدسة مجهرية ومعفى من المصنوعات اليدوية هالو. وهذا يسهل الكشف التلقائي الخلية وتتبع الخلية.

خلية ثقافة تحليل البيانات
لاستخراج دورة الخلية المسارات، وتحليل البيانات تعتمد على سلسلة من خوارزميات مختلفة، هي الخلية تتبع أداء مع البرنامج المساعد تراكماتي فيجي، الكشف عن الشعب، وفي نهاية المطاف استخراج الخلية دورة المسارات، أي التسلسل بين شعبتين الخلية. فيما يلي نناقش نوعية نواتج هذه الخوارزميات بالمقارنة مع قياسات اليدوي.

ويبين الشكل 4 يلتقط الشاشة مختلفة الخلية-تتبع النتائج والنتائج خوارزمية الكشف عن الخلية ونتائج تحليل تتبع الخلية. الكشف عن الخلايا في اقتناء عدسة خالية (4a الأرقامج-4) هو الخطوة الأولى من خوارزمية خلية تتبع. من أجل التحقق من صحة خوارزمية الكشف عن الخلية، ونحن المشروح يدوياً جزء صغير من الوقت الفاصل بين شراء خالية من العدسة (إطارات 214 من 663 × 663 ميكرومتر²). نحن يدوياً تحديد إجمالي 5365 خلية المواقف ومقارنة هذه النتائج مع تلك التي حصل عليها البرنامج المساعد تراكماتي فيجي. ويبين الشكل 5 النتائج فيما يتعلق بكشف الحقيقية، كاذبة إيجابيات وسلبيات كاذبة. الحساسية الناتجة من حوالي 96%، والقيمة التنبؤية الإيجابية كبيرة مثل 99.7 في المائة. وتعكس هذه القيم العالية النوعية الجيدة لمرحلة أعيد بناؤها الصور التي تم الحصول عليها في إعداد الفيديو خالية من عدسة مجهرية. بعد الكشف عن الخلية، خوارزمية تجزئة خلية يسمح بقياس — لكل خلية – عدة مقاييس مختلفة، مثلاً مجال الخلية، الخلية الجافة الجماهيري وسمك الخلية. يصور الشكل 6a مبدأ خوارزمية تجزئة و الرقم 6f يظهر صور مجزأة في تسلسل زمني لمنطقة الاهتمام من 663 × 663 ميكرومتر² (نفسها كما في الشكل 5). يبدأ الخوارزمية التجزئة بالعتبة صورة المرحلة (انظر الشكل 6b) ثم أنه يطبق إجراء بذر (انظر الشكل 6 ج). إلا وهي ترد بكسل لمركز الكشف عن الخلايا إلى قيمة المسار المطابق. س-ص ومواقف الخلايا وعددها المسار المطابق تقدم الملف 'البقع في إحصاءات المسارات' التي تم الحصول عليها بعد تتبع الخلية. ثم ينفذ إجراء ملء تكرارية يمتد البذور إلى حدود الخلية (6 أرقام ج-ه) تحدد العتبة الأولى (الشكل 6b). هذا الإجراء ملء يعتمد على العمليات الأساسية في مورفولوجيا الرياضي، مثلاً، تمدد وتآكل. من نتيجة تجزئة، ثم من الممكن لحساب قياسات عدة على مستوى خلية مفردة، أي الميزات المورفولوجية مثل طول الخلية، ومنطقة الخلية ونسبة العرض إلى الارتفاع الخلية، ولكن أيضا، والأهم، الخلية الجافة الجماهيري وفقا مكافئ. 1. من أجل تقييم مدى موثوقية مجهرية خالية من عدسة قياس الخلية وزن جاف، قد قارنا صورة المرحلة أعيد بناؤها خالية من العدسة الثابتة هيلا الخلايا (الشكل 6 ز) مع نفس المنطقة المكتسبة عن طريق رقمي المجسم مجهرية ذات هدف X 5 (ح الشكل 6). يظهر الرقم 6i الجاف للخلية تقاس كتلة يعني خالية من عدسة مجهرية كدالة للكتلة الجافة قياس مع اضعا 302 مجزأة خلايا هيلا. هناك علاقة جيدة بين القياسات اثنين (معامل العزم R² هو 0.86، المنحدر = 0.9، الإزاحة = pg-17). من 6i الشكل، يمكن أن نقدر دقة قياس كتلة جافة الخلية التي تم الحصول عليها عن طريق الفحص المجهري خالية من العدسة. الدقة، تقاس كمتوسط مربع الخطأ بين البيانات خالية من العدسة وتناسب الخطية، هو pg حوالي 16.

عند تجميع كل خلية مفردة القياسات على الحصول على كامل الوقت الفاصل، ثم فمن الممكن الحصول على سكاتيربلوتس مقاييس عدة كدالة للزمن كما هو موضح في الشكل 7. هذه سكاتيربلوتس معلومات عن حركية الخلايا المزروعة على مدى عدد كبير جداً من سكان. يزيد عدد الخلايا في مجال الرؤية من 000 2 حتى 15,000 (الشكل 7 أ). مضروباً في العدد النقاط الزمنية، هذا يؤدي إلى مجموعة كبيرة من 2.2 x 10⁶ الكشف عن الخلايا، كل واحدة منها تتميز بإحداثياته والمورفولوجية الميزات، أي خلية الكتلة الجافة (الشكل 7)، منطقة الخلية (الشكل 7 ج) ، خلية متوسط سمك (الشكل 7 د) وطول محورها الرئيسي (7e الشكل)، ونسبة العرض إلى الارتفاع (7f الشكل).

الأهم من ذلك، المزيج من تتبع الخلية والخلية خوارزميات التجزئة تمكننا من قياس حركية على مستوى الخلية الواحدة. كمثال على ذلك، يبين الشكل 8 تحليل لخلية تتبع دائم نحو 66 ساعة ونستعرض أربعة أقسام الخلية في T0 + ح 4.1، T0 + ح 20.5، T0 + ح 36.7 و T0 + 53.3 h. الرقم 8 (أ) إظهار النتائج خوارزمية تجزئة الخلية التلقائي التي تسمح لنا لتحديد كفاءة سطح هذه الخلية. استخدام تجزئة الخلية، ثم من الممكن لحساب مقاييس عدة كدالة للزمن، مثل مساحة الخلية (الشكل 8b)، الخلية الجافة الكتلة (الشكل 8 ج)، وسمك متوسط الخلية (الشكل 8 د) والخلية حركية (8e الشكل). من هذه الرسوم البيانية، أحد وضوح قياس الحركية من هذه القياسات الخلوية بين انقسامات الخلية. خاصة يستطيع المرء أن يلاحظ زيادة مساحة الخلية، ووزن جاف خلال دورة الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام الكشف التلقائي عن انقسامات الخلية، دورة الخلية مختلف المسارات الثلاثة يمكن أن تستخلص من هذا المسار، ومدة دورة الخلية، أي الفترة ما بين شعبتين، يمكن تقدير. على المسار وحيد الخلية هو مبين في الشكل 8، قمنا بقياس المدد دورة الخلية الثلاثة، إلا وهي ح 16.4، ح 16.2 وحاء 16.7 تجميع كل دورة الخلية المسارات من تحليل لأيام 2.7 اكتساب الوقت الفاصل بين النتائج في الكشف عن انقسامات الخلية 16725 و وصف 10,584 دورة الخلية المسارات. ثم أن من الممكن لقياس المتوسط وتباين مدة دورة الخلية مع الإحصاءات السليمة. وجدنا أن توزيع مدة دورة الخلية على وشك توزيع غاوسي (الشكل 9 ألف) مع متوسط 16.5 ح، وانحراف معياري نسبي من 12.4% (الانحراف المعياري يقاس في ذروة غاوسي مقسوماً على متوسط توزيع ). متوسط مضاعفة الوقت ح 16.5 يتسق مع أطوال دورة الخلية تقاس يدوياً على المسار المعروضة في الشكل 8. تقع إلا في نطاق أقل من القيم المنشورة هيلا مضاعفة الوقت الذي يتم عادة ما بين 20 و 30 ح^24،25،،من²⁶²⁷. ومع ذلك، في²⁸من الإشارة، أيضا ذكر مضاعفة بوقت قصير من 16.2 ± 1.7 ح. من أجل المزيد من التحقق من صحة لدينا قياسات أطوال دورة الخلية وتأكيد موثوقية تقنية خالية من عدسة مجهرية لدينا، نحن أدوا تعقب يدوي 100 دورة الخلية المسارات (وظائف الخلية 10,148). في الخلية دورة المسارات التي تم الحصول عليها يدوياً (N = 100) طول دورة الخلية يقاس ح 16.7±1.9 (N = 100، الرقم 9b). هذا قريب جداً من قياس ح 16.5±2.1 (N = 10,584) التي تم الحصول عليها مع الخلية التلقائي تعقب، ومما يدل على صحة التحليل الشامل. ترتبط جيدا لتلك التي تقاس عند مقارنة تتبع الخط لتحديد المسارات إلى واحد تلقائياً، وجدنا أن 67% المسارات دورة الخلية واكتشفت بنجاح وأن تقاس أطوال دورة تلقائياً دورة الخلية يدوياً (9b الشكل). وتم قياس كفاءة الكشف عن مسارات دورة الخلية في الساعات ال 32 الأولى من هذه التجربة، في كثافة أقل من 150 خلايا/مم². ومن الواضح أن يقلل معدل اكتشاف هذا مع مرور الوقت، كالخلية يزيد كثافة ~ 500 خلايا/مم². يصل عدد المسارات دورة الخلية المكتشفة إلى هضبة في T0 + h 32 (الشكل 9 ج) بينما لا يزال يزيد عدد الخلايا بمعامل قدرة ثلاثة بين T0 + ح 32 و T0 + ح 72 (الشكل 7 أ). نظراً لمعدل المكتشفة الإيجابية والسلبية الكاذبة، 9b الشكل يعرض القيم المتطرفة 5 نقاط: 4 منهم بسبب الكشف عن سلبية كاذبة (دورة طول > ح 25) و 1 إلى الكشف عن إيجابية كاذبة (دورة طول < ح 10). للحصول على هذه النتائج، وقد استخدمنا عتبة عالية على السمك (8 ميكرومتر) في خوارزمية الكشف عن انقسام الخلية، لصالح انخفاض معدل إيجابية كاذبة. وبالإضافة إلى ذلك، قد تم تصفية المسارات عرض التناقض بها، أي دورة الخلية التي مدتها أقل من 6 ح والمسارات مع مسار شامل جافة التي لا تزيد خطيا كدالة للزمن. وهي 3 في المائة فقط من العدد الإجمالي لمسارات دورة الخلية. نتيجة لذلك توزيع طول دورة الخلية التي تم الحصول عليها تلقائياً التقريبي جيدا قبل ضبابي (الشكل 9 ألف) مع عدد قليل من المسارات القصيرة (طول دورة الخلية < ح 10، 5، 1% العدد الإجمالي لمسارات) التي ستنجم عن خطأ شعبة الإيجابية المكتشفة. وبالمثل، المسارات عرض دورة الخلية طويلة، الذي سيكون جزئيا النتائج من اكتشافات شعبة سلبية زائفة، أيضا نادرة (طول دورة الخلية > 25 ح، 2.4 في المائة من إجمالي عدد المسارات). كما استخدمت التتبع اليدوي للمسارات دورة الخلية مواصلة تقييم خلية تتبع تنفيذها مع البرنامج المساعد. ونحن قد تقاس على خلايا 6693 دقة التعريب عموما من 1.6 ميكرون النقاط المطابقة، وداخل الملعب بكسل واحد (1.67 ميكرومتر).

يمكن فحص معلمات أخرى، مثل كتلة الخلايا الجافة الأولية (فقط بعد تقسيم)، وكتلة جافة النهائي (قبل انقسام الخلية)، فضلا عن متوسط معدل النمو دورة الخلية. يرسم الشكل 9 د الجماهير الجافة الخلية الأولية والنهائية كدالة للزمن. وهو يبين أن كلا الجماهير الجافة الخلية الأولية والنهائية تنخفض مع مرور الوقت. متوسط قيمة الخلية الأولى الجافة الجماهيري يقلل من pg 223 وصولاً إلى 130 جزء من الغرام والخلية النهائية جافة كتلة من 460 pg وصولاً إلى 220 pg. النسبة بين البلدين لا يزال مستقرا عند 1.89 ± 0.12 خلال التجربة بأكملها (الشكل 9 د-e)- وأخيراً، 9f الشكل يوضح تطور معدل النمو الشامل الجافة الخلية كدالة للزمن عبر المسارات دورة الخلية 10,584 ووجدنا أن الانخفاض في معدل نمو الخلايا اتجاه عام للسكان الخلية بأكملها في هذه التجربة الخاصة.

رقم 1: خالية من عدسة مجهرية. () تخطيطي الإعداد اقتناء مجهرية خالية من العدسة. (ب) صورة الفيديو خالية من العدسة 6-آبار المجهر. ويستخدم جهاز استشعار CMOS صورة مع الملعب بكسل من 1.67 ميكرومتر ومنطقة تصوير 6.4 مم × 4.6 = 29.4 مم². تقدم الإضاءة المصابيح RGB ملونة متعددة جنبا إلى جنب مع ثقب صغير يوضع على مسافة 5 سم تقريبا من العينة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: واجهة تراكماتي. تجربة القوائم الرئيسية للبرنامج المساعد سيظهر مع الإعدادات الفعلية المستخدمة في الخلية هيلا. تم تعيين قطر النقطة المقدرة إلى 15 بكسل، تم تعيين عتبة الكاشف إلى 0.25، تم تعيين المسافة القصوى الربط إلى 15 بكسل، تم تعيين المسافة ماكس سد الفجوة إلى 15 بكسل، وتم تعيين عدد المواقع في المسارات إلى 3.5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: عملية إعادة الإعمار المجسم. () شراء الخام من خلايا هيلا في الثقافة عن طريق الفحص المجهري خالية من العدسة (مجال الرؤية الكاملة من 29.4 مم²). (ب) التفاصيل من (أ). (ج) تفصيل من (ب). (د) RGB مرحلة إعادة بناء الصورة (مجال الرؤية الكاملة من 29.4 مم²). التفاصيل (ه) (د). التفاصيل (و) (ه). (ز) مرحلة الصورة التي تم الحصول عليها بعد مرحلة إزالة التغليف بالمقارنة إلى (و) من قبل إزالة التغليف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: يلتقط الشاشة خلية تتبع نتائج إجراء باستخدام البرنامج المساعد فيجي تراكماتي. () نتائج خوارزمية الكشف عن الخلية التي تستند إلى Laplacian الضبابي (سجل) للكشف عن. وتظهر الصورة في مجال الرؤية الكاملة لاقتناء عدسة خالية في T0 + 16h40min التي يتم الكشف عن الخلايا 2,451. هذه الأخيرة محاطة بدائرة أرجواني. (ب) نتائج الخوارزمية تتبع الخلية. ويرد كل خلية المسارات ما يزيد على 50 الإطارات (~ 8 ساعات) مع رمز لون المقابل لمتوسط السرعة. (ج، د) تفاصيل الصورة من (أ) و (ب) على التوالي (المستطيل الأصفر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 5: التحقق من صحة المرحلة الكشف عن خلية من خوارزمية تتبع الخلية. يتم وضع علامة () صورة المحصولية هيلا الخلايا في الثقافة (663 × 663 ميكرومتر²) حيث تحديد الخلية باليد مع الصلبان الأزرق وتلك التي اكتشفت مع خوارزمية خلية تتبع تتسم بصلبان حمراء. وهذا يتيح تحديد الكشف إيجابية كاذبة (دائرة حمراء) واكتشافات سلبية كاذبة (دائرة أورانج). (ب) معدل الكشف الحقيقي (الخط الأخضر)، كاذبة إيجابية (خط أحمر) والكشف عن سلبية زائفة (برتقالي) يتم رسمها كدالة للزمن التجربة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 6: نتائج من تجزئة الخلية. () صورة المرحلة Reconstructed من منطقة الاهتمام باكتساب الوقت الفاصل بين T0 + 7 ح (663 × 663 ميكرومتر²). (ب) يبدأ الخوارزمية التجزئة بالعتبة صورة المرحلة (ج) التجزئة يبدأ مع إجراء بذر، أي بكسل للمركز للكشف عن خلايا تم تعيينها إلى قيمة المسار المطابق. (د-ه) المقبل وتكراري هو تنفيذ إجراء تعبئة الذي يمتد البذور الأولى لحدود الخلية يحدده مستوى العتبة الأولى (ب). (و) يتم عرض النتيجة خوارزمية تجزئة لتسلسل زمني على منطقة² ميكرومتر 663 × 663 (نفسها كما في الشكل 5). ويرد التجزئة كسطح ملونة فوق فوق الصورة المرحلة أعيد بناؤها. ملاحظة أن إشارة خالية من العدسة أساسا قادم من منطقة نووية، وتقع المناطق المقسمة قريب من النواة. (ز) ريكونستروكتيد المرحلة التي حصل عليها خالية من عدسة مجهرية في إصلاح خلايا هيلا. هذه صورة تم اقتصاصها من مجال الرؤية الكاملة من 29.4 مم². (ح) المرحلة صورة المنطقة المبينة في (ز) التي حصل عليها مجهرية المجسم الرقمية ذات هدف X 5 (نا 0.12) مضيئة مع ليزر في 647 شمال البحر الأبيض المتوسط. (أنا) ارسم الخلية الجافة الحصول على الشامل عن طريق خال من عدسة مجهرية كدالة للكتلة الجافة يقاس عن طريق اضعا. ويجمع سكاتيربلوت 302 الخلايا القياسات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 7: تحليل البيانات لعملية شراء 2.7 أيام خالية من عدسة الوقت الفاصل بين خلايا هيلا. () مجموع عدد الخلايا التي تحسب في مجال الرؤية الكاملة من 29.4 مم² كدالة للزمن. (ب) سكاتيربلوت للخلية الجافة الجماهيري كدالة للوقت. في كل مربع، المقابلة لسلة من 6 ساعات، علامة وسط الأحمر يشير إلى الوسيط، والحواف السفلي والعلوي من المربع تشير إلى مقاييس النسبة المئوية الخامسة والعشرين والخامسة والسبعين، على التوالي. شعيرات تمتد إلى نقاط البيانات الأكثر تطرفاً لا تعتبر القيم المتطرفة. (ج-f) سكاتيربلوتس الخلية مجزأة المنطقة (ج) وسمك متوسط الخلايا (د)، وطول المحور الرئيسية الخلية (e) وخلية نسبة العرض إلى الارتفاع (f) كدالة للزمن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 8: تحليل البيانات لمسار الخلية اليوم 2.7 (الفاصل الزمني للإطار 10 دقيقة)- () خلية تجزئة يقوم على اكتساب الوقت الفاصل بين مسار خلية دائمة حوالي 66 ح. يظهر خلية اهتمام بتراكب أزرق. كل الصورة المقتصة من 53 x 53 ميكرومتر². ويرد الشعب خلية مع الدوائر الصفراء. (ب) الأرض منطقة الخلية كدالة للزمن. (ج) الوقت تطور الخلية الجافة الجماعي المحسوب من التكامل للمرحلة فوق منطقة الخلايا المقسمة حسب مكافئ. (1). (د) ارسم متوسط سمك خلية محسوبة كدالة للزمن وفقا لمكافئ. (2). سمك الخلية المعارض قمم حادة المقابلة لانقسامات الخلية (الأصفر دوائر الخطوط في (أ) والحمراء في (ب-ج-د-ه)). (ﻫ) الأرض حركية الخلية كدالة للزمن. (و) تجزئة نتائج المقابلة إلى آخر إطار المسار في T0 + 66h20min عند كثافة الخلية من الخلايا حوالي 475/مم². أن الصورة هي 200 × 200 ميكرومتر² تتمحور حول الخلية للفائدة. وتتوافق مع بقع بيضاء (النجمة الحمراء) الحطام الخلية التي تظهر بعد يوم واحد من الخلية والثقافة. (ز) 800 × 800 ميكرون² اقتصاص الصورة المرحلة أعيد بناؤها من الإطار الأخير في هذا المسار الخلية. الخلية التي تهم محاط بدائرة صفراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 9: تحليل دورة الخلية- () توزيع دورة الخلية مدة ملاحظة اليوم 2.7 من هيلا مثقف خلايا (N = 10, 584 خلية دورات). توزيع مدة دورة الخلية بالقرب من ضبابي مع متوسط ساعات 16.5 وانحراف المعياري نسبي من 12.3% (الانحراف المعياري يقاس في ذروة غاوسي مقسوماً على متوسط التوزيع). (ب) مقارنة بين يدوي وتلقائي خلية تتبع لتحديد طول دورة الخلية. تتبع دليل يضم 100 دورة الخلية المسارات (وظائف الخلية 10,148). (ج) توزيع بدء الوقت للمسارات تلقائياً الكشف عن دورة الخلية. (د) ارسم الخلية الأولى قياس الجافة الكتلة (فقط بعد انقسام الخلية، الأسود النقط) وكتلة جافة الخلية النهائي (قبل انقسام الخلية، الأحمر النقاط) كدالة للوقت. في كل مربع، الموافق بن لح 6، علامة وسط الأحمر يشير إلى الوسيط، والحواف السفلي والعلوي من المربع تشير إلى مقاييس النسبة المئوية الخامسة والعشرين والخامسة والسبعين، على التوالي. شعيرات تمتد إلى نقاط البيانات الأكثر تطرفاً لا تعتبر القيم المتطرفة. (ﻫ) سكاتيربلوت النهائي الخلية الجافة الجماهيري كدالة من الكتلة الجافة الأولية. (و) تطور معدل النمو الشامل الجافة الخلية كدالة وقت التجربة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تكميلية ملف 1: رمز 'segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m'- يستخدم هذا الرمز Matlab dataset 'تراكماتي' القيام بتجزئة الخلية لاكتساب الوقت الفاصل بين الكامل الذي يتم حفظ الصور المرحلة أعيد بناؤها في المجلد 'folder_out'. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

تكميلية ملف 2: رمز 'lineage_Version_Jove.m'- يستخدم هذا الرمز الصفيف 'تراكماتي' المجهزة مع خوارزمية تجزئة الخلية (segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m)، لاستخراج مسارات دورة الخلية وتحديد المعلمات المختلفة ذات الاهتمام، على سبيل المثال-، الخلية مدة دورة، وزن جاف الخلية الأولى والخلية نهائي وزن جاف. هذا الرمز في جزأين، الجزء الأول يتناول الكشف عن تقسيم الخلايا، والجزء الثاني مع تحليل مسارات دورة الخلية. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

في هذه الورقة، ونظهر أن الفحص المجهري خالية من عدسة الفيديو يمكن استخدامها داخل حاضنة لالتقاط حركية الآلاف من الخلايا. من أجل وصف المنهجية الشاملة التي شرحنا كيف يمكن تحليلها يوم 2.7 اكتساب الوقت الفاصل بين خلايا هيلا في الثقافة مع معيار خلية تتبع خوارزميات. والنتيجة هي إحدى وحدات dataset يضم 2.2 × 10⁶ خلية القياسات والمسارات دورة الخلية 10,584. وأجريت عمليات الشراء على ثقافة خلايا هيلا بمسافة كبيرة نسبيا من خلية إلى خلية (خلية كثافة < 500 خلايا/مم²) وخلية مورفولوجيا التي يمكن الاقتراب منها مع قرص. هاتان السمتان تيسير تطبيق تحليل تتبع الخلية التلقائية التي تجعل من الممكن جمع مجموعة كبيرة. سيكون أكثر صعوبة لتعقب خطوط الخلايا الأخرى مع أصغر خلية إلى المسافة أو مع مورفولوجيس أكثر تعقيداً ومجموعات البيانات اللاحقة ستكون أصغر حجماً.

ونحن نعتقد أن هذا النهج مثيرة للاهتمام للعديد من الدراسات، على سبيل المثال لتكاثر الخلايا والدراسات حجم الخلية. هذه الأخيرة مجال هام للبحوث في مجال البيولوجيا الأساسية والعديد من الأسئلة لا تزال دون إجابة ناقش شكل جيد في استعراض جينزبيرج et al. ²⁹-وينص البروتوكول المقترح في هذا العمل وبالتالي وسيلة لقياس المقاييس الهامة اللازمة للدراسات المتعلقة بالانتشار الخليوي، أي مدة دورة الخلية، كتلة الخلايا الجافة، نسبة كتلة جافة خلية بين النهاية وبداية الدورة والخلية معدل النمو الشامل الجافة. وإلى جانب دراسة تكاثر الخلايا، سيكون هذا الأسلوب من الاهتمام لدراسة الهجرة الخلية، نظراً لأنها يمكن أن تنتج عددا كبيرا من المسارات، كل واحدة تدوم عدة ساعات. هذا البروتوكول يتجاوز ال^14،الدولة من الفن³⁰ بإثبات الحصول على آلاف مسارات الخلية خلال أكثر من 10 ح للمرة الأولى.

وفي الختام، قمنا بتطوير أسلوب خال من العدسة سهلة الاستخدام التي تسمح بتتبع في وقت واحد من آلاف خلايا خالية من التسمية على مدى عدة أيام للثقافة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytonote lens-free video microscope	Iprasense
Horus acquisition software	Iprasense
6-well glass bottom culture plates	MatTek corporation	Part No: P06G-0-14-F
DMEM + GlutaMAX medium	Gibco
heat-inactivated fetal calf serum	Eurobio
penicillin and streptomycin	Gibco
Fibronectin	Sigma Aldrich
Matlab, image processing toolbox	Mathworks