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Biology

La microscopie vidéo sans lentille pour la dynamique et l’analyse Quantitative de la Culture de cellules adhérentes

Published: February 23, 2018 doi: 10.3791/56580
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 3,4, 3, 1, 1, 1, 5, 5, 4,6, 1
1CEA, LETI, DTBS, LISA, Université Grenoble Alpes, 2CEA, LETI, DTBS, LBAM, Université Grenoble Alpes, 3CEA, INSERM, BIG, Université Grenoble Alpes, 4CNRS, FR CNRS 3425, 5CNRS, UMR 144, Molecular Mechanisms of Intracellular Transport, PSL Research University, Institut Curie, 6TIMC-IMAG

Summary

La microscopie vidéo sans lentille permet de surveiller les cultures de cellules directement à l’intérieur de l’incubateur. Ici, les auteurs décrivent le protocole complet utilisé pour acquérir et analyser une acquisition 2,7 journée des cellules HeLa cultivées, conduisant à un ensemble de données 2.2 x 106 mesures de la morphologie des cellules individuelles et 10584 cycle cellulaire titres.

Abstract

Ici, nous démontrons que la lentille-gratuit vidéo microscopie permet de capturer simultanément la cinétique de milliers de cellules directement à l’intérieur de l’incubateur et qu’il est possible de surveiller et de quantifier les cellules isolées le long de plusieurs cycles cellulaires. Les auteurs décrivent le protocole complet permettant de surveiller et de quantifier une culture de cellules HeLa pour 2,7 jours. Tout d’abord, acquisition de la culture cellulaire est réalisée avec un microscope vidéo sans lentille, et puis les données sont analysées à la suite d’un processus en quatre étapes : reconstruction holographique de longueurs d’onde multiples, cellule-tracking, segmentation et la division cellulaire détection des cellules algorithmes. Ainsi, nous montrons qu’il est possible de rassembler un ensemble de données comportant plus de 10 000 titres du cycle cellulaire et de mesures morphologiques de plus de 2 x 106 cellules.

Introduction

Suivi tout au long de plusieurs cycles cellulaires des cellules de mammifères et de mesurer avec exactitude cell taille et cell masse sèche est une tâche difficile. Plusieurs techniques d’optiques sans étiquette sont capables d’accomplir cette tâche1,2: déphaseurs interférométrie3, microscopie holographique numérique (DHM)4,5,6, 7, quadriwave8,de l’interférométrie cisaillement latéral9 et volet quantitatif tomographie10,11. Ces méthodes ont abouti à nombreuses nouvelles perspectives sur la compréhension du cycle cellulaire des cellules de mammifères. Cependant, ils sont rarement associés à cellule automatique suivi des algorithmes et leur débit reste limitée lors de la mesure cellule trajectoires masse1 (N < 20 respectivement3,,4,5 , 6). c’est pourquoi une nouvelle méthode optique est nécessaire pour mesurer les trajectoires masse cellulaire avec statistiques grand (N > 1000).

Dans cet article, nous démontrent la capacité de la microscopie vidéo sans lentille image simultanément des milliers de cellules directement à l’intérieur de l’incubateur, et ensuite quantifier métriques de cellule unique le long des milliers de pistes cyclables de cellules individuelles. La microscopie exempte d’objectif est une phase quantitative imaging technique qui permet l’acquisition d’images de cellules sur un très grand champ de vision (typiquement plusieurs dizaines de mm2, ici 29,4 mm2)12,13 ,14,15. Plusieurs mesures au niveau de la cellule sont déterminées, par exemple, zone de cellules, cellules masse sèche, épaisseur de la cellule, la longueur axe majeur des cellules et rapport l / h12,15, de chaque image de cellule. Puis, en appliquant un algorithme de suivi des cellules, ces fonctionnalités peuvent être tracées pour chaque cellule en fonction de l’expérience de temps14,15. En outre, en détectant la présence de divisions cellulaires dans les traces de la cellule, il est possible d’extraire d’autres informations importantes telles que la cellule initiale poids sec (juste après la division cellulaire), la masse sèche de cellule final (juste avant la division cellulaire) et la cellule cycle de durée, c'est-à-dire, le temps entre deux divisions consécutives15. Toutes ces mesures peuvent être calculés avec de très bonnes statistiques (N > 1000) le grand champ de vision permettant généralement l’analyse de 200 à 10 000 cellules en une seule acquisition exempt de lentille.

Pour expliquer cette méthodologie basée sur la microscopie vidéo sans lentille, les auteurs décrivent le protocole pour surveiller et mesurer une culture de cellules HeLa pour 2,7 jours. Analyse des données est un processus en quatre étapes basé sur multi-longueur d’onde reconstruction holographique, suivi des cellules, segmentation de la cellule et des algorithmes de division cellulaire. Ici, on montre que la résolution spatiale et la fréquence d’images relativement rapide (une acquisition toutes les 10 minutes) obtenus avec cette configuration de microscopie vidéo sans lentille est compatible avec des algorithmes de suivi de cellule standard. L’analyse complète de ce jeu de données entraîne la mesure de 10 584 cellule titres plus complète des cycles cellulaires.

Pour résumer, la microscopie vidéo sans objectif est un outil puissant pour surveiller automatiquement des milliers de sans étiquette, non synchronisé et des cellules non modifiés par l’expérience ; chaque cellule étant suivie pendant plusieurs cycles cellulaires. Nos mesures fournissent ainsi la valeur moyenne de plusieurs paramètres des cellules, mais plus important encore, la variabilité inter cellulaire sur une large population de cellules.

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Protocol

1. Culture cellulaire Acquisition de surveillance

  1. La croissance de cellules HeLa DMEM + glutamine (p. ex., GlutaMAX) additionné de 10 % (v/v) veau foetal inactivés par la chaleur de sérum et de 1 % la pénicilline et de streptomycine.
  2. Enduire les plaques de culture à fond de verre 6 puits avec la fibronectine (25 µg/mL) pendant 1 h. Les semences puis 2 x 104 cellules par puits.
  3. Lors de l’acquisition, changer le support tous les 3 jours.
  4. Pour l’acquisition de Time-lapse, utiliser le microscope objectif-free video (disponible dans le commerce).
    NOTE : Ceci est basé sur la technique d’imagerie exempte d’objectif calcul, tel que décrit par Ozcan et al. 16 qui a été modifiée pour effectuer une surveillance continue dans un incubateur à une température de 37 ° C12,15. Il dispose d’un capteur d’image CMOS (semiconductor) oxyde de métal complémentaire avec un terrain de pixel de 1,67 µm et une zone d’imagerie de 6,4 x 4,6 mm2. Illumination de longueurs d’onde multiples est assurée par un multichip diode (LED) dispositif électroluminescent, qui offre un éclairage rouge, vert et bleu. Les longueurs d’onde sont centrés, 636, 521 et 452 nm respectivement, avec une largeur de bande spectrale de 25, 45 et 25 nm respectivement. Les rouge-vert-bleu (RVB) LED sont situés au-dessus d’un trou de 150 µm à une distance d’environ 5 cm des cellules. La puissance lumineuse mesurée à proximité de la LED est aussi basses que 10 µW à chaque longueur d’onde et le temps d’illumination est seulement une seconde par acquisition. Par conséquent, aucun problème de toxicité-photo n’est attendus lorsque des cultures de cellules sont observés au microscope vidéo sans lentille.
  5. Mettre le récipient de culture cellulaire mis en contact avec le capteur CMOS (Figure 1). Utiliser un récipient avec une lamelle de verre au fond, ce qui est important pour la qualité de l’acquisition de lentille-free. Contenants en plastique peuvent également être utilisés, mais l’acquisition de lentille-libre sera dégradée en raison de la mauvaise qualité optique de ces conteneurs.
  6. Contrôler l’exempte d’objectif microscope video avec le logiciel d’acquisition (disponible dans le commerce), qui effectue une fois l’acquisition de Time-lapse et la reconstruction holographique. Les paramètres qui doivent être saisies par l’utilisateur dans l’interface du logiciel sont la cadence, la durée de l’expérience et le type de culture de cellules, cellules c.-à-d. adhérentes ou cellules flottantes.
  7. Définissez les paramètres d’entrée du logiciel acquisition. Définissez la cadence définie sur une acquisition toutes les 10 minutes et le type de culture cellulaire à « adherent ».
    Remarque : Une cadence d’un acquisition toutes les 10 minutes est un bon compromis car il garantit une cellule fiable de suivi alors que la taille de l’ensemble de données qui en résulte à analyser est encore raisonnable. La fréquence d’images plus rapide réalisable avec cette configuration de microscopie exempte d’objectif est une acquisition toutes les 5 minutes. Ce qui augmente la framerate se traduit par un réchauffement excessif du capteur CMOS qui peut affecter la viabilité des cellules en culture.
  8. Démarrer l’acquisition de Time-lapse, et l’algorithme de reconstruction holographique (disponible dans le commerce) traitera automatiquement l’acquisition exempt de lentille pour obtenir l’image de phase de la culture cellulaire. L’algorithme de reconstruction holographique est issu d’une phase de longueurs d’onde multiples récupération algorithme17 et fournit une image RVB de phase reconstruit dans la plage de [-π, + π] pour chaque cellule unique sur un grand champ de vision de 29,4 mm2. Le principe de l’holographie en ligne exempt de lentille est pour éclairer un échantillon mince (z = 0) avec une onde plane (d’amplitude 1 après normalisation) et de détecter sur un capteur CMOS de l’image d’intensité de diffraction ultérieure à une courte distance z = Z, généralement 1 mm après la échantillon. Dans notre configuration, l’éclairage est séquentiellement en 3 longueurs d’onde (λ1= 0,450 µm, λ2= 0.540 µm, λ3= 0,647 µm) pour mesurer les trois patrons de diffraction du même échantillon.

2. analyse de données de Culture cellulaire

  1. Pour cellule-tracking, utiliser l’algorithme de Trackmate, un plugin OpenSource de Fidji le suivi automatisé des particules unique18. At a tout d’abord, chargez l’acquisition complète de Time-lapse dans Fidji (commande de séquence de chargement image). En raison de la grande taille des ensembles de données, qui comporte généralement 400 images RVB de 29,7 Mo, il est plus rapide de les charger au format 8 bits. Ensuite le plugin Trackmate Fidji guide l’utilisateur à travers plusieurs étapes de l’algorithme de la cellule de suivi, à savoir une étape de détection de cellules, un stade de traqueur de cellules et plusieurs filtres appliqués à la détection de la cellule et les pistes calculées. À chaque étape, configurez les algorithmes et afficher les résultats immédiatement afin que, si nécessaire, on peut facilement naviguer en arrière pour réajuster les paramètres. Les différents menus de l’interface de Trackmate sont indiqués dans la Figure 2 avec les réglages utilisés pour l’expérience de cellules HeLa.
  2. Définir les paramètres d’entrée du logiciel acquisition comme suit (voir Figure 2). Définir le diamètre estimé blob à 15 pixels, le seuil de détecteur à 0.25, la distance maximale de liaison de 15 pixels, la distance max écart-fermeture 15 pixels et le nombre de places dans les titres à 3,5.
    Remarque : Ces paramètres différeront évidemment d’une expérience à l’autre, en particulier le « blob estimée diamètre » qui correspond à la taille des cellules (ici donnée en pixels du µm 1.67). La même remarque s’applique à la « distance max relie » qui représentent la distance maximale parcourue par une cellule au sein de deux images consécutives (ici donnée en pixels du µm 1.67). Sa valeur optimale dépendra sur la motilité cellulaire, mais aussi sur la densité des cellules.
  3. À la fin du processus de suivi des cellules, générer les résultats sous la forme de trois fichiers texte (« Analyse » bouton, voir Figure 2). Le fichier plus utile, nommé « Points dans les statistiques de titres », consistant en un tableau énumérant les cellules détectées tout avec leurs positions respectives (x, y) dans l’acquisition, leur numéro d’image et leur numéro de piste. Sur la base de ces données, effectuer la segmentation cellulaire et détecter des divisions cellulaires à l’aide des algorithmes dédiés (voir les fichiers de code supplémentaire). Les deux autres fichiers sont nommés « Liens statistiques de titres » et « Suivi statistique » et inclure tous les résultats portant sur les titres, par exemple les durées de piste, certaines lacunes détectées, suivre la trame initiale, etc..
  4. Utiliser l’algorithme de segmentation cellulaire (voir le dossier de code supplémentaires) pour extraire automatiquement plusieurs paramètres décrivant la morphologie des cellules de l’image de la phase de reconstruction. Ces mesures sont la surface de la cellule (S), la longueur d’axe majeur de cellule (L), la longueur d’axe mineur de cellule (l) et les proportions de la cellule (L/l). La phase Récupérée de microscopie exempt de lentille est proportionnelle à la densité et l’épaisseur de la couche de spécimen tel que discuté auparavant15.
  5. En plus des caractéristiques morphologiques de la cellule, extrait secs mesures de (CDM) de masse cellulaire quantitative la phase reconstituées13,19,20
    Equation 1Équation (1)
    où φ(x,y) est la phase reconstituées MAJ19, λ la longueur d’onde et α = 1,8 x 10-4 m3/kg l’indice de réfraction spécifique qui concerne la variation de l’indice de réfraction pour sécher la masse1, 19.
  6. Évaluer l’épaisseur de la cellule en utilisant une estimation de la différence entre l’indice de réfraction de cellule et les milieux de culture. La relation entre la cellule épaisseur h(x,y) et le déphasage mesurée est donnée par20:
    Equation 2EQ. (2.1)
    Equation 3EQ. (2.2)
    avec Δn(x,y) = ncellule (x,y) - nmoyen (x,y), la différence d’indice de réfraction entre la cellule et les milieux de culture. Dans ce qui suit, supposons une valeur constante de Δn = 0,025, qui est estimée à partir de l’indice de réfraction mesuré dans les noyaux des cellules HeLa (n = 1.35511) et celle des milieux de culture de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (n = 1,33). Bien que la valeur d’épaisseur cellulaire est seulement indicative car elle repose sur une hypothèse, ses variations relatives sont significatives et peuvent être exploitées pour détecter les cellules en division.
  7. Utiliser l’algorithme dédié (voir le dossier de code supplémentaires) pour détecter la présence de divisions cellulaires et puis extraire les pistes de cellule qui sont associés aux détection des divisions cellulaires, afin de détecter une division cellulaire, des cellules avec une épaisseur mesurée supérieure à 8 µm sont identifiés tout d’abord, puis vérifiez si une nouvelle cellule apparaît étroitement dans l’espace et temps. De cette façon, la détection des divisions cellulaires s’appuie sur deux critères robustes. Alternative et des méthodes plus élaborées pour la détection de la division cellulaire peuvent être appliqués au lensfree acquisition Time-lapse21,22,23.

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Representative Results

Pour le processus de reconstruction holographique, le terrain de la lumière est décrite par un champ scalaire A (où Equation 4 est la valeur complexe de A dans l’avion à distance z de la position de l’échantillon et latérale Equation 5 et à la longueur d’onde λ). Rayon est modelé par la théorie de Huygens-Fresnel qui fournit un noyau propagateur Equation 6 . Par conséquent, l’amplitude du champ dans le plan du détecteur, unz est liée à l’amplitude de lumière un0 par la relation suivante :
Equation 7c'est-à-direEquation 8
avec Equation 9 , où i est le nombre complexe (j’ai2=-1)

La mesure de l’intensité est simplement modélisée par Equation 10 . Le but de l’algorithme de reconstruction est de trouver un « bons » champ A0, associé à l’échantillon observé, lequel diffraction correspond à l’intensité mesurée Iz. La stratégie consiste à considérer la phase de champ d’amplitude sur le détecteur plan φz comme étant inconnu du problème et d’optimiser un critère multispectral variation totale de l’objet. Plus précisément, étant donné les champs
Equation 11

Equation 12c'est-à-direEquation 13
pour les phases champ φz, Equation 14 correspondent parfaitement aux données depuis Equation 15 . Afin que le champ ultérieur Equation 16 est un champ d’amplitude possible dans le plan de l’échantillon, compte tenu de l’image de l’intensité observée. C’est la raison pourquoi un critère sur A0 est utilisé pour spécifier une solution unique parmi toutes les possibilités de couplage de données. Le critère pour réduire au minimum a été choisi comme :
Equation 17
où x et y sont les coordonnées de l’avion, c'est-à-dire Equation 18 . En utilisant ce critère permet de sélectionner, parmi tous les domaines possibles, un exemple de champ affichant des arêtes à la même position pour toutes les longueurs d’onde, qui est physiquement significative. Cette méthode réduit la présence de « twin-images » dans le champ reconstruit un0. Le « double-image » est un artefact important qui résulte d’un manque d’informations de phase au cours du processus d’acquisition.

Pour le calcul pratique, les intégrales sont discrétisées avec un échantillonnage spatial correspondant à la résolution du détecteur, les dérivés sont remplacés par les opérateurs Sobel et circonvolutions par le propagateur de Huygens-Fresnel Equation 19 sont effectuées en allant à l’espace de Fourier où Equation 20 a une expression simple : Equation 21 . Minimisation de le ε (real) critère en ce qui concerne les variables (véritable) set Equation 22 est abordée à l’aide de la méthode du gradient conjuguée non linéaire, qui exige que le gradient de ε doit être calculée pour n’importe quelle phase associée à chaque pixel du détecteur pour chacun longueur d’onde.

Déballer les Phase de reconstruction/cellule
La figure 3 montre les résultats de la reconstruction holographique d’une trame d’une acquisition accélérée des cellules HeLa dans la culture. Figure 3 a montre le champ de vision complet d’une acquisition brute dans la couche bleue sur une zone de 29,4 mm2 . Basé sur cette image et celles acquises dans les canaux rouge et verts, la reconstruction holographique produit une image RVB de phase des cellules comme indiqué dans les Figures 3 b et 3C. L’image reconstituée phase expose les objets localement enveloppé phase correspondant aux cellules qui induisent un décalage de phase dépassant + π. Afin d’effectuer une phase simple déballage, nous avons mis en place un moyen heuristique, à savoir nous détecter les pixels avec la valeur Equation 23 excédant 0,3 et définir ces pixels pour + π. Cette méthode simple est basée sur une propriété des images RVB reconstruit phase. En théorie chaque pixel nous devrions mesurer un rapport Equation 24 égal à Equation 25 . Mais dans le cas de cellules mitotiques, en cas d’emballage de phase, cette relation n’est plus maintenue à l’image de phase de reconstitution RGB (Figure 3f). La méthode heuristique mentionnée ci-dessus tire parti de cette propriété, afin qu’un simple seuillage permet de détecter les pixels présentant emballage de phase. Les résultats de l’image de phase reconstruit avant et après déballage est montré dans les Figures 3f et 3 g, respectivement. Ces images de phase non emballés sont ensuite introduits dans l’algorithme de la cellule de suivi. Sans cette étape unwrapping, l’algorithme de la cellule de suivi manquerait détecter les cellules en division et cellules de grande épaisseur, ce qui compromettrait les résultats définitifs. La résolution de l’image reconstruite de phase a été estimée à environ 5 µm15 (pas plein de résolution spatiale), qui est relativement grossier. Il est néanmoins possible d’observer des détails tels que lamellipodia et cellule cytoplasme (Figures 3f et 3 g). Plus important encore, l’image obtenue au microscope à lentille-free affiche un grand contraste et est exempte d’artefacts de halo. Cela facilite la détection automatique de cellule et cellule-tracking.

Analyse de données de culture cellulaire
Pour extraire le cycle cellulaire pistes, l’analyse des données repose sur une série d’algorithmes différents, à savoir la cellule de suivi effectué avec le plugin Trackmate Fidji, la détection des divisions et finalement l’extraction de cellule de pistes cyclables, c'est-à-dire la séquence entre deux divisions cellulaires. Dans ce qui suit, nous examinons la qualité des résultats de ces algorithmes par rapport aux mesures manuelles.

La figure 4 montre des captures d’écran différente des résultats de la cellule de suivi, les résultats de l’algorithme de détection de cellules et les résultats de l’analyse de la cellule de suivi. La détection des cellules dans l’acquisition d’objectif-gratuit (Figures 4 a-4 c) est la première étape de l’algorithme de la cellule de suivi. Afin de valider l’algorithme de détection de cellules, nous avons annoté manuellement une petite partie de l’acquisition de lentille-free time-lapse (214 trames de 663 x 663 µm2). Nous manuellement sélectionné un total de 5365 cellule postes et comparé ces résultats avec ceux obtenus par le plugin Trackmate Fidji. La figure 5 montre les résultats en termes de détection vraie, faux positifs et faux négatifs. La sensibilité qui en résulte est d’environ 96 % et la valeur prédictive positive aussi grande que 99,7 %. Ces valeurs élevées reflètent la bonne qualité des images reconstruites phase obtenues avec l’installation de microscopie vidéo sans lentille. Après la détection de la cellule, un algorithme de segmentation cellulaire permet de mesurer, pour chaque cellule — plusieurs différents indicateurs, par exemple la zone de la cellule, la cellule poids sec et l’épaisseur de la cellule. Figure 6 a décrit le principe de l’algorithme de segmentation et Figure 6f montre des images segmentées dans une séquence temporelle d’une région d’intérêt de 663 x 663 µm2 (le même que la Figure 5). L’algorithme initie la segmentation par seuillage de l’image de phase (voir la Figure 6 b), puis il applique une procédure d’amorçage (voir Figure 6C). À savoir les pixels du Centre des cellules détectées sont définies sur la valeur de la piste correspondante. Les positions XY des cellules et leur numéro de piste correspondant sont fournies par le fichier « Points dans les statistiques de titres » obtenu après avoir suivi de la cellule. Puis, une procédure itérative de remplissage est mis en œuvre qui s’étend de la graine, aux limites de la cellule (Figures 6 c-e), déterminée par le seuillage initiale (Figure 6 b). Cette procédure de remplissage s’appuie sur des opérations de base de la morphologie mathématique, par exemple, une dilatation et érosion. Le résultat de la segmentation, il est alors possible de calculer plusieurs mesures au niveau de la cellule unique, c'est-à-dire des caractères morphologiques comme la longueur de la cellule, la zone de cellule et le format de cellule, mais aussi, plus important encore, la cellule de matière sèche selon Équation 1. Afin d’évaluer la fiabilité de la microscopie exempt de lentille masse sèche de mesure de la cellule, nous avons comparé l’image de la lentille-free reconstituées phase de cellules HeLa fixes (Figure 6 g) avec la même région acquise au moyen d’un appareil photo numérique holographique microscope avec un objectif de X 5 (Figure 6 h). 6i la figure montre la cellule sèche masse mesurée par moyenne de microscopie exempt de lentille comme une fonction de la masse sèche mesurée avec DHM pour 302 segmenté les cellules HeLa. Il y a une bonne corrélation entre les deux mesures (coefficient de détermination R2 est de 0,86, pente = 0,9, décalage = pg-17). De Figure 6i, nous pouvons estimer la précision de la mesure de masse sèche de cellule obtenue au moyen de la microscopie exempt de lentille. La précision, mesurée comme l’erreur quadratique moyenne entre les données sans lentille et l’ajustement linéaire, est environ 16 pg.

Lorsque vous compilez toutes les mesures de la cellule unique sur l’acquisition complète de Time-lapse, il est alors possible d’obtenir des diagrammes de dispersion de plusieurs paramètres en fonction du temps, comme illustré à la Figure 7. Ces diagrammes de dispersion des informations sur la cinétique des cellules cultivées sur une population très importante. Le nombre de cellules dans le champ de vision augmente de 2 000 à 15 000 (Figure 7 a). Multiplié par le nombre de points dans le temps, ce qui conduit à un grand ensemble de données 2.2 x 106 détecté des cellules, chacun d’eux se caractérise par ses coordonnées et les caractéristiques morphologiques, c'est-à-dire une masse sèche cellulaire (Figure 7 b) et zone de cellules (Figure 7 c) , cellule épaisseur moyenne (Figure 7D), longueur de l’axe principal (Figure 7e) et rapport l / h (Figure 7f).

Ce qui est important, la combinaison du suivi de la cellule et des algorithmes de segmentation cellulaire permet de mesurer la cinétique au niveau de la cellule unique. À titre d’exemple, la Figure 8 montre l’analyse d’une cellule de suivi d’une durée d’environ 66 heures et présentant quatre divisions cellulaires à T0 + 4,1 h, T0 + 20,5 h, T0 + 36,7 h et T0 + 53,3 h. Figure 8 a montrer les résultats de l’algorithme de segmentation de cellule automatique qui permet de Nous à délimiter efficacement la surface de cette cellule. À l’aide de la segmentation de la cellule, il est alors possible de calculer plusieurs métriques en fonction du temps, par exemple la surface de la cellule (Figure 8 b), la cellule sèche masse (Figure 8C), l’épaisseur moyenne de cellules (Figure 8 d) et la cellule motilité (Figure 8F). De ces graphiques, on peut clairement mesurer la cinétique de ces paramètres cellulaires entre les divisions cellulaires. En particulier, on peut observer l’augmentation de la zone de cellule et de la masse sèche durant un cycle cellulaire. En outre, en utilisant la détection automatique des divisions cellulaires, trois pistes différentes cycle cellulaire peuvent être extraites de cette piste et la durée du cycle cellulaire, c'est-à-dire la période entre deux divisions, peut être estimée. Sur la piste de la cellule unique illustrée à la Figure 8, nous avons mesuré trois durées de cycle cellulaire, à savoir h 16,4, h 16,2 et 16,7 h. compiler tout le cycle de la cellule de pistes de l’analyse d’un 2,7 jours résultats de Time-lapse acquisition dans la détection de 16725 divisions cellulaires et la description de 10 584 pistes du cycle cellulaire. Il est alors possible de mesurer la moyenne et la variabilité de la durée du cycle cellulaire avec statistiques sonore. Nous avons trouvé que la répartition de la durée du cycle cellulaire est proche de distribution gaussienne (Fig. 9 a) avec une moyenne de 16,5 h et un écart type relatif de 12,4 % (écart mesuré sur le pic gaussien divisé par la moyenne de la distribution ). La moyenne de temps de 16,5 h de doublement est conforme à la longueur du cycle cellulaire mesurée manuellement sur la piste présentée sur la Figure 8. Il se trouve cependant dans la plage inférieure des valeurs publiées pour HeLa doublement du temps qui sont généralement entre 20 et 30 h24,25,26,27. Toutefois, dans la référence28, un court temps de doublement de 16,2 ± 1,7 h est également mentionné. Afin de valider nos mesures du cycle cellulaire et confirment la fiabilité de notre technique de microscopie exempt de lentille davantage, nous avons effectué un suivi manuel de 100 titres de cycle cellulaire (10 148 postes de cellule). Sur la cellule cycle titres obtenus manuellement (N = 100) la longueur mesurée de cycle cellulaire est 16.7±1.9 h (N = 100, Figure 9 b). C’est très proche de la mesure de la 16.5±2.1 h (N = 10 584) obtenues avec la cellule automatique de suivi, ce qui démontre la validité de l’analyse globale. Quand, en comparant le repérage manuel du cycle cellulaire des trajectoires à celui déterminé automatiquement, nous avons découvert que 67 % des pistes cyclables de la cellule ont été détectés avec succès et que les cycle de longueurs mesurées automatiquement sont bien corrélées à celles mesurées manuellement (Figure 9 b). L’efficacité de la détection des trajectoires cycle cellulaire a été mesurée dans les 32 premières heures de l’expérience, à une densité inférieure à 150 cellules/mm2. Ce taux de détection est évidemment diminue avec le temps, comme la cellule densité augmente jusqu'à environ 500 cellules/mm2. Le nombre de pistes cyclables de cellules détectées plafonne à T0 + 32 h (Figure 9c) tandis que le nombre de cellules augmente encore d’un facteur 3 entre T0 et T0 + 32 h, 72 h (Figure 7 a). Étant donné le taux de fausses détections positives et négatives, Figure 9 b présente 5 valeurs aberrantes points : 4 d'entre eux sont en raison de fausses détections négative (durée du cycle > 25 h) et 1 à une détection de fausse positif (durée du cycle < 10 h). Pour obtenir ce résultat, nous avons utilisé un seuil élevé sur l’épaisseur (8 µm) dans l’algorithme de détection de la division cellulaire, afin de favoriser un faible taux de faux positifs. En outre, les titres présentant des incohérences ont été filtrés dehors, c'est-à-dire le cycle cellulaire dont la durée est inférieure à 6 h et suit une trajectoire de masse sèche qui n’augmente pas de façon linéaire en fonction du temps. Ils sont seulement 3 % du nombre total de pistes cyclables de la cellule. En conséquence, la distribution de longueur de cycle de cellules obtenue automatiquement est bien approchée par une gaussienne (Figure 9 a) avec un faible nombre de pistes courtes (longueur de cycle cellulaire < 10 h, 5,1 % du nombre total de pistes) qui résulterait de la faux détections positives de division. De même, les titres affichant un long cycle de cellules, qui serait partiellement les résultats de détections de faux négatifs division, sont également rares (longueur de cycle cellulaire > 25 h, 2,4 % du nombre total de pistes). Suivi manuel des trajectoires cycle cellulaire a été également utilisée afin d’évaluer davantage le suivi de la cellule effectué avec le plugin. Nous avons mesuré sur 6693 cellules une précision de localisation globale de 1,6 µm sur les points correspondants, qui se trouve à un pas de pixel (1,67 µm).

Autres paramètres peuvent être examinés, tels que la masse sèche initiale de cellules (juste après une division), le poids sec final (juste avant la division cellulaire), ainsi que le taux de croissance moyen au cours du cycle cellulaire. Figure 9D parcelles les masses sèches cellule initiale et finale en fonction du temps. Il montre que les deux masses sèches de la cellule initiale et finale diminuent avec le temps. La valeur médiane de la cellule initiale sèche masse diminue de 223 pg jusqu'à 130 pg et la dernière cellule sèche masse de 460 pg jusqu'à 220 pg. Le rapport entre les deux demeure stable à 1,89 ± 0,12 pendant l’expérience entière (Figure 9 d-e). Enfin, 9f Figure montre l’évolution du taux de croissance de masse sèche cellulaire en fonction du temps sur les pistes de cycle cellulaire 10 584 et nous avons constaté que la diminution des taux de croissance de cellules est une tendance commune à la population de la cellule entière dans cette expérience particulière.

Figure 1
Figure 1 : microscopie Lens-gratuit. (a) schéma de l’installation d’acquisition de microscopie exempt de lentille. (b), photo de la vidéo exempt de lentille de 6 puits microscope. Il utilise un capteur d’image CMOS avec une pente de pixel de 1,67 µm et une zone d’imagerie de 6,4 mm x 4,6 mm = 29,4 mm2. Illumination est fournie par une LED RGB multicolore avec un trou d’épingle placé à une distance de 5 cm environ de l’échantillon. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : interface de Trackmate. Les menus principaux du plugin montré avec les paramètres réels utilisés pour les cellules HeLa experiment. Le diamètre estimé blob a été fixé à 15 pixels, le seuil de détecteur était fixé à 0,25, la distance maximale de liaison a été fixée à 15 pixels, la distance max écart-fermeture a été fixée à 15 pixels et le nombre de places dans les titres a été fixé à 3,5. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : processus de reconstruction holographique. uneacquisition brute des cellules HeLa dans culture exempte d’objectif en microscopie (plein champ de vision de 29,4 mm2). (b) détail de (a). (c) détail de (b). image de phase reconstituées (d), RVB (plein champ de vision de 29,4 mm2). Détail (d) (e). (f) détail de (e). (g) Phase image obtenue après la phase de déballage pour être comparé à (f), avant de déballer. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : captures d’écran des résultats cellule de suivi effectuées en utilisant le plugin Fidji Trackmate. (un) résultats de l’algorithme de détection de cellules qui repose sur un laplacien de détecteur de Gauss (LoG). La photo montre le champ de vision complet de l’acquisition de lentille libres à T0 + 16h40min dont 2 451 cellules sont détectés. Ces derniers sont entourés d’un cercle violet. (b) les résultats de l’algorithme de la cellule de suivi. Toutes les photos Flickr de cellule sont affichés plus de 50 cadres (~ 8 heures) avec un code de couleur correspondant à la vitesse médiane. (c, d) Détail image de (a) et (b) respectivement (rectangle jaune). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Validation de l’étape de détection de cellules de l’algorithme de suivi cellulaire. (un) Cropped image de HeLa cellules en culture (663 x 663 µm2) où la cellule sélectionnée à la main sont marqués d’une croix bleue et ceux détectés avec l’algorithme de suivi des cellules sont marquées d’une croix rouge. Ceci permet la détermination des fausses détections positives (cercle rouge) et fausses détections négatives (cercle orange). (b) le taux de détection vrai (ligne verte), faux positif (ligne rouge) et la détection de faux-négatifs (orange) sont tracées en fonction de la durée de l’expérience. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : résultats de la segmentation cellulaire. (a) image de phase de reconstruction d’une région d’intérêt de l’acquisition de Time-lapse T0 + 7 h (663 x 663 µm2). (b) l’algorithme initie la segmentation par seuillage de que l’image de phase (c) la segmentation commence par une procédure d’amorçage, c'est-à-dire les pixels du centre des cellules détectées sont définies sur la valeur de la piste correspondante. (d-e) Ensuite et de manière itérative une procédure de remplissage est mis en place qui s’étend de l’amorçage initial aux limites de la cellule déterminée par le seuillage initiale (b). (f) le résultat de l’algorithme de segmentation est montré pour une séquence de temps sur une région de2 663 x 663 µm (identique à la Figure 5). La segmentation est montrée comme une surface colorée, placée au-dessus de l’image de la phase de reconstruction. Notez que le signal exempt de lentille est principalement venus de la région nucléaire et segmentés sont à proximité du noyau. (g), à la reconstruction phase obtenue par microscopie exempt de lentille en fixe les cellules HeLa. Il s’agit d’une image recadrée du champ de vision complet de 29,4 mm2. image (h), à la Phase de la région indiquée en (g) obtenus par microscopie holographique digitale avec un objectif de X 5 (NA 0,12) éclairée par un laser à 647 nm. (j’ai) terrain de la cellule sèche masse obtenue au moyen de la microscopie exempte d’objectif en fonction de la masse sèche mesurée par DHM. Le diagramme de dispersion compile 302 Mensurations de cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : analyse des données d’une acquisition de lentille-free time-lapse 2,7 jours de cellules HeLa. (a) Total Nombre de cellules comptées dans le champ de vision complet de 29,4 mm2 en fonction du temps. (b), à la dispersion de la cellule sèche masse en fonction du temps. Sur chaque boîte, correspondant à un bac de 6 heures, la marque centrale rouge indique la médiane et les bords bas et en haut de la boîte indiquent les 25e et 75e centiles, respectivement. Les moustaches s’étendent à des points de données plus extrêmes ne pas considérés comme des valeurs aberrantes. (c-f) Diagramme de dispersion de la cellule segmenté zone (c), l’épaisseur moyenne de cellule (d), la longueur des cellules axe majeur (e) et le format de cellule (f) en fonction du temps. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : analyse des données d’une trajectoire de cellule de 2,7 jours (intervalle de trame de 10 min). (un) cellule segmentation effectuée sur l’acquisition de Time-lapse d’une plage de cellule durée environ 66 h. La cellule d’intérêt est montrée avec une surcouche bleue. Chaque image recadrée est 53 x 53 µm2. Les divisions cellulaires sont affichées avec les cercles jaunes. (b) terrain de la zone de cellule en fonction du temps. évolution temporelle (c) de la cellule sèche masse calculée de l’intégrale de la phase sur la zone de cellule segmentés selon l’équation (1). épaisseur de cellule (d) terrain de la moyenne calculée en fonction du temps selon l’équation (2). L’épaisseur de la cellule présente des pics correspondant aux divisions cellulaires (lignes en (a) et rouges (b-c-d-e) des cercles jaunes). (e) terrain de la motilité cellulaire en fonction du temps. (f), à la Segmentation des résultats correspondant à la dernière image de la piste à T0 + 66h20min lorsque la densité cellulaire est environ 475 cellules/mm2. L’image est de 200 x 200 µm2 centré sur les cellules d’intérêt. Les taches blanches (astérisques rouges) correspondent à des débris de cellules qui apparaissent après une journée de culture cellulaire. (g), 800 x 800 µm2 cropped image de phase de reconstitution de la dernière image de cette piste de la cellule. La cellule d’intérêt est entourée d’un cercle jaune. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : cycle cellulaire analyse. (un) répartition de la durée du cycle cellulaire d’une observation de 2,7 jours de culture HeLa cellules (N = 10, 584 cycles cellulaires). La répartition de la durée du cycle cellulaire se trouve à proximité d’une gaussienne avec une moyenne de 16,5 heures et un écart type relatif de 12,3 % (écart mesuré sur le pic gaussien divisé par la moyenne de la distribution). (b) Comparaison entre le manuel et automatique cellule de suivi pour la détermination de la durée du cycle cellulaire. Le repérage manuel comporte 100 trajectoires du cycle cellulaire (10 148 postes de cellule). (c), à la Distribution de la mise en marche de temps des trajectoires automatiquement détecté cycle cellulaire. (d) terrain de la cellule initiale mesurée sèche masse (juste après les points de division cellulaire, noir) et sèche masse cellulaire finale (juste avant la division cellulaire, rouge points), en fonction du temps. Sur chaque boîte, correspondant à un bac de 6 h, la marque centrale rouge indique la médiane et les bords bas et en haut de la boîte indiquent les 25e et 75e centiles, respectivement. Les moustaches s’étendent à des points de données plus extrêmes ne pas considérés comme des valeurs aberrantes. masse (e), à la dispersion de la dernière cellule sèche en fonction de la masse sèche initiale. (f) évolution du taux de croissance de masse sèche cellulaire en fonction de la durée de l’expérience. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire 1 fichier : Code « segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m ». Ce code Matlab utilise le jeu de données « trackmate » pour effectuer la segmentation de la cellule de l’acquisition de Time-lapse complète dont les images de phase reconstituées sont enregistrées dans le dossier « folder_out ». S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

2 fichier supplémentaire : Code « lineage_Version_Jove.m ». Copiez le code suivant utilise le tableau « trackmate » traitée avec l’algorithme de segmentation cellulaire (segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m), pour extraire les trajectoires du cycle cellulaire et de déterminer les différents paramètres d’intérêt, par exemple., la cellule durée du cycle, la cellule initiale de matière sèche et la dernière cellule de masse sèche. Ce code est en deux parties, la première partie traite de la détection des Division des cellules et la deuxième partie de l’analyse des trajectoires cycle cellulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Dans cet article, nous montrons que microscopie vidéo sans lentille peut être utilisée à l’intérieur d’un incubateur pour capturer la cinétique de milliers de cellules. Afin de décrire la méthodologie globale, nous a expliqué comment une acquisition Time-lapse 2,7 jours de culture, les cellules HeLa peut être analysée avec des algorithmes de suivi de cellule standard. Le résultat est un ensemble de données mettant en vedette 2.2 x 10 mesures de cellule de6 et 10 584 pistes du cycle cellulaire. Les acquisitions ont été réalisées sur une culture de cellules Hela avec une distance relativement grande de cellule-cellule (densité de cellules < 500 cellules/mm2) et la morphologie qui peut être fixée à un disque de cellules. Ces deux caractéristiques facilitent l’application d’une analyse cellulaire-suivi automatique qui permet de recueillir un dataset tel grand. Autres lignées cellulaires avec la plus petite distance de cellule-cellule ou avec des morphologies plus complexes serait plus difficiles à suivre et des ensembles de données subséquente serait moindre.

Nous croyons que cette approche est intéressante pour de nombreuses études, par exemple la prolifération cellulaire et études de taille des cellules. Ces derniers sont un domaine important de recherche en biologie fondamentale et de nombreuses questions restent sans réponses aussi bien discutés dans une revue par Ginzberg et al. 29. le protocole proposé dans cet ouvrage fournit donc un moyen de mesurer des paramètres importants requis pour les études de prolifération de cellules, c'est-à-dire la durée du cycle cellulaire, la masse sèche de cellule, le rapport de masse sèche cellulaire entre la fin et le début du cycle et la cellule taux de croissance de masse sèche. Outre l’étude de la prolifération cellulaire, cette méthode sera d’intérêt pour l’étude de la migration cellulaire, car il peut produire un grand nombre de pistes, chacun d’eux plusieurs heures. Le présent protocole va au-delà de l’état de l’art14,30 en démontrant pour la première fois l’acquisition de milliers de titres de la cellule pendant plus de 10 h.

En conclusion, nous avons développé une technique de lentille-libres facile à utiliser qui permet de suivre simultanément des milliers de cellules sans étiquette sur plusieurs jours de culture.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs n’ont rien à reconnaître.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytonote lens-free video microscope  Iprasense
Horus acquisition software Iprasense
6-well glass bottom culture plates MatTek corporation Part No: P06G-0-14-F 
DMEM + GlutaMAX medium  Gibco
heat-inactivated fetal calf serum  Eurobio
penicillin and streptomycin  Gibco
Fibronectin  Sigma Aldrich
Matlab, image processing toolbox  Mathworks

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