Summary
이것은 시간 및 비용 effective 생체 외에서 프로토콜의 타겟된 치료제 인수 저항 메커니즘을 조사 하는 암 관리에 높은 미 충족된 의료 필요 이다.
Abstract
지난 2 년간 의료 종양학에서 타겟된 치료 세포 독성 약물에서 변화를 보았다. 타겟된 치료제 더 인상적인 임상 효능과 전통적인 치료법 보다 부작용 최소화에 표시 하는 있지만 약물 저항 그들의 혜택을 주요 제한 되고있다. 임상 연습에 대상된 에이전트에 저항을 취득된의 여러 전 임상/생체 외에서 또는 vivo에서 모델 두 가지 전략을 사용 하 여 주로 개발 되었습니다: 인수 저항, 및 ii) 생체 외에서 의 genotypes 모델링 i) 유전자 조작 / vivo에서 저항 모델의 선택. 현재 작업에서 우리는 기본 메커니즘의 설명에 약물 내성 세포 subclones의 세대에서 시작 타겟된 치료제에 저항을 취득된에 대 한 책임을 조사 통합 프레임 워크를 제안 입을 절차는 억제 물 감도 복원에 사용. 간단한 시간 그리고 비용 effective 이렇게 광범위 하 게 적용 이며 다른 종양 histotypes에 다른 대상된 치료 약물에 저항 메커니즘을 조사를 쉽게 확장할 수 있습니다.
Introduction
분자와 세포 생물학에 있는 중요 한 발견에 따라, 새로운 합성된 항 암 분자 수 선택적으로 종양 종류의 광범위 한 배열에 종양 신호 경로 대상으로 개발 되었습니다. 특히, 타겟된 치료제 종양학에서 독특한 속성의 두 가지 범주, 즉 합성 화학 화합물 및 재조합 단일 클론 항 체, 임상 성공 및 극적으로 변경 된 암 치료에서 달성 하는 것으로 알려져 있습니다. 최근 수십 년간1,2,3.
그럼에도 불구 하 고, 치료에 그들의 인상적인 초기 대응에도 불구 하 고 암 환자의 대부분 모든 타겟된 치료제, 단일 클론 항 체와 kinase 억제제 약물 저항을 개발 했습니다. 결과적으로, 약물 내성, 고전적인 항 암 약4에 대 한 주요 장애물은 여전히 신흥 표적으로 한 치료5,6에 대 한 큰 도전.
타겟된 치료에 저항을 내장 될 수 있습니다 (즉, 기본) 또는 (즉, 보조)를 인수. 본질적인 저항 보조 저항 약물 치료7응답의 기간 후에 발생 하는 반면 치료, 응답의 드 노 보 부족을 설명 합니다. 후자는 기본 종양의 대부분 내의 종양 세포의 작은 동료의 발생으로 인 한 또는 원심 비밀 해 부 틈새에 자리 잡고 있으며, 최대 90%까지 전시 저항 하나 이상의 타겟 치료제. 기본 타겟된 치료에 저항 개발 주로 분자 메커니즘 대상 유전자 변이 그 이해 완료8멀지는 다른 프로 생존 신호 통로의 중복 활성화에서 유래한 다.
이 작품에서는, 우리는 시간 및 비용 effective 접근의 약물 내성 세포 subclones의 세대에서 시작 하는 침묵의 설명에 타겟된 치료제 인수 저항 메커니즘 체 외에서 조사 제안 사용 감도 억제제, 테스트 작업 가설의 유효성을 검사 하는 사용 되는 중요 한 도구를 복원 하는 절차. 특히, 우리의 접근은 조사, 위 암, trastuzumab (예를 들어, Herceptin), HER2 단백질9의 세포 외 도메인을 대상으로 인간 답게 단일 클론 항 체를 저항 메커니즘에에서 사용 되었다. Trastuzumab + 화학요법 HER2 양성 전이성 유방암에 대 한 표준 첫 줄 치료로 널리 인정 됩니다. 그 안티 HER2 보여주는 최근 전 임상 연구 덕분에 치료에 있는 중요 한 활동 둘 다 생체 외에서 그리고 HER2 양성 vivo에서 위 암 모델10,11, HER2를 표적으로 하는 분자 약물 되었습니다. 임상 시험에서 광범위 하 게 검사, 일부는 여전히 지속적인 환자 위 식도 암12,13,,1415에 있습니다.
이러한 연구 환자 trastuzumab16, 유사 하 게 어떤 다른 타겟된 치료 억제제에 대 한 관찰은 저항을 발생의 상승 수를 강조 했다. 특히, trastuzumab의 응답 속도 47%, 그리고 trastuzumab + 화학요법에 환자에 대 한 평균 전반적인 생존은 불과 2.7 개월 환자 화학 요법 혼자17에 대 한 이상. 이 기본 trastuzumab 저항 유행 이다, 하는 동안 보조 trastuzumab 저항 불가피 하다 제안 했다. 이러한 이유로,이 neoplasia18의 내부 종양 유전자이 주어진 더욱 문제는 위 암에 HER2 타겟 치료 저항을 일으키는 메커니즘을 명확히 하는 긴급 한 필요가 있다.
또한,의 위 암에 trastuzumab 저항 메커니즘 설명 하 고, 부분적으로 신뢰할 수 있는 전 임상 모델 대표가 조건의 취득에 어려움으로 인해 어려운 입증 했다. 오시마 외 는 vivo에서 선택 방법을 trastuzumab 내성 위 암 세포 선, 작은 잔여 복 막 전이의 반복된 문화 trastuzumab19치료 후 구성 된의 보고. 그러나, 필요를, 특정 동물 처리 전문, 그리고 동물 윤리 위원회의 승인의 시간 그리고 비용 소모 메서드에 기여. 우리가이 작품에 설명 하는 방법은 간단 하 고 광범위 하 게 적용 이며 다른 종양 histotypes20에서 다른 치료 약물에 저항 메커니즘을 조사 하기 위해 쉽게 확장할 수 있습니다.
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Protocol
참고:이 프로토콜은 특별히 조정 되었습니다 그녀의 긍정적인 위 암 세포 선의 trastuzumab 인수 저항을 기본 메커니즘의 분석에 대 한. 필요한 모든 실험실 계기는 자료의 테이블에에서 보고 됩니다.
1입니다. 타겟된 치료 저항 Subclones 세대
참고: 이것은 가장 중요 하 고 어려운 사실은 다른 셀 라인 수 전시 하지 다른 감도 타겟된 치료 억제제를 독립적으로 그들의 종양 histotype 또는 약물 농도에서 단계 프로토콜에서을 표준화 하 사용.
- 문화 NCI N87 셀 RPMI 매체 37 ° C에서 단층으로 송아지 태아 혈 청 (10%)와 글루타민 (2 mM, 1%), 보충에 라인 그리고 25 cm2 문화 플라스 크에 씨앗.
- 시작 하는 복용량으로 문화 매체 trastuzumab의 각 플라스 크 10 µ g/ml에서를 추가 합니다. 그들은 성장 하 고 다시 시작할 때까지 시작 하는 복용량에 셀을 표시 합니다.
참고: 대상된 치료 억제제의 시작 하는 복용량의 플라즈마 피크 농도 보다 10 배 낮은 해야 합니다. 플라즈마 피크 농도 약물 농도 일반적으로 다음 표준 치료의 여러 복용량 환자 혈액에서 검출의 가장 높은 수준 이다. 약물 동력 학에 대 한 연구에서이 값을 검색할 수 있습니다. - Trypan 블루 제외 방법; 세포 성장 모니터링 세포 성장 (일반적으로 2 ~ 3 주 기간) 후 다시 시작할 때 셀 trastuzumab의 사진 높은 복용량 농도에 노출.
- 높은 약물 농도 (적어도 2.5-4-fold 플라즈마 피크 보다 높은)의 존재에도 불구 하 고 (약 2 주) 후 성장 세포 유지까지 셀 trastuzumab (400 µ g/mL를 100 µ g/mL)에서 점차적으로 증가 복용량을 노출 합니다.
-
Clonogenic 분석 결과의 문화 매체에서 대상 치료 억제제의 농도 있는 모든 변화에 타겟된 치료 저항 수준을 평가를 수행 하 고 상대 저항 IC50 색인 (RR IC50)를 다음과 같이 정의.
- 24 다 잘 배양 배지에서 500 셀 씨
참고: 5 우물 각 조건 집합에 대 한 준비 되어야 한다. - 400 µ g/mL까지 100 µ g/mL에서 증가 대상 치료 억제제 (trastuzumab) 농도에 세포를 노출 합니다.
- 15 일 동안 37 ° C에서 CO2 배양 기에서 세포를 품 어.
- 부 화, 후 수정 하 고 샘플을 다음과 같이 얼룩.
- 10 mL 1 x PBS 가진 매체와 린스 셀을 제거 합니다. 1 x PBS를 제거 하 고 고정 솔루션 (아세트산 산: 메탄올, 1:7, (vol/vol))의 2-3 mL를 추가 합니다. 고정 솔루션을 제거 하 고 0.5% 크리스탈 바이올렛 솔루션을 추가 합니다. 2 시간에 대 한 실 온에서 품 어
- 피 펫으로 발음 하 여 크리스탈 바이올렛 솔루션을 신중 하 게 제거 하 고 접시 모든 크리스탈 바이올렛 솔루션 잔류물을 씻어 하 수도 물에 담가. 최대 2 일 동안 실 온에서 건조.
- 식민지는 거꾸로 한 현미경 (4 배 확대)를 사용 하 여 50 개 이상의 셀을 계산 합니다.
참고: 두 명의 독립적인 관찰자가 필요 합니다. - RR IC50 대상 치료 저항 subclone 셀의 IC50 값과 원래/순 진 셀의 값 사이 비율로 계산 합니다.
- 24 다 잘 배양 배지에서 500 셀 씨
2. 유효성 검사는 후보에 대 한 프로토콜 타겟 치료 저항 유전자 (R-유전자)
참고: 유전자 발현의 특성, 후 서명 관련 된 대상 치료와 모든 후보 유전자 획득된 저항 저항 드라이버 통해 조사 될 것 이다: a) RT-PCR, 및 b) 서쪽 오 점 분석.
-
실시간 RT-PCR
- 산 guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-혼합물을 사용 하 여 셀 라인에서 총 RNA 추출 ( 재료의 표참조).
- 반전 녹음 방송 (RT) 반응 임의의 hexamer 뇌관을 사용 하 여 수행 하 고 열 cycler를 다음과 같이 설정: 5 분, 20 분, 46 ° C에서 RT와 RT 비활성화 1 분 동안 95 ° C에서 25 ° C에서 못쓰게.
- 20 µ L 반응에 대 한 총 RNA의 사용 400 ng. 다음과 같이 샘플에 대 한 반응 혼합물 준비: 7 µ L RNase 무료 H2O 2 µ L cDNA (10 ng / µ L), 형광 표시 된 특정 대상 조사, x 1 µ L 20 및 10 µ L 2 x 믹스 포함 버퍼, dNTPs, DNA 중 합 효소 ( 재료의 표참조).
- 각 잘 플레이트에 반응 혼합물의 20 µ L을 추가 하 고 다음 프로그램 실행: 2 분, 10 분 (1 사이클); 95 ° C에서 50 ° C에서 무대를 들고 95 ° C에서 15에 대 한 다음 40 주기 s 1 분 동안 60 ° C에서.
-
서쪽 오 점
- 세포 현 탁 액의 0.05 %trypsin / EDTA 용액 2 mL를 추가 하 고 작동 하도록 트립 신에 대 한 2-3 분을 허용 하 여 복구 합니다.
- 2 권 중간 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청의 트립 신 (예를 들어, 각 1 mL의 트립 신에 대 한 매체의 2 개 mL)을 중화 하 고 차가운 1 x PBS 가진 삭제 표면에 뜨는 및 세척 셀 5 분에 대 한 1200 x g에서 원심을 추가 합니다.
- 5 분 동안 1200 x g에서 centrifuge 고 상쾌한 삭제. 세포의 용 해 버퍼 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 30 분 동안 4 ° C에서 로커에 품 어.
- 세포의 용 해 버퍼의 셀 (예를 들어, 1 x 106 셀 100 µ L);의 수에 따라 다릅니다. 매번 신선한 세포의 용 해 버퍼를 준비 해야 합니다. 세포의 용 해 버퍼 준비 (얼음에 두고)의 1 ml: 975 µ M L를 사용 하 여-포유류 lysate 버퍼, 15 µ L 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제, 및 10 µ L 100 µ M PMSF 억제제.
- 15 분 동안 4 ° C에서 13000 x g에 세포 lysate 원심 분리에 의해 표면에 뜨는 단백질을 복구 합니다.
- BCA 단백질 분석 결과 사용 하 여 단백질 농도 결정 합니다.
- 단백질 견본 (적어도 20-30 µ g 단백질)을 3 분 동안 100 ° C에서 열 LaemmLi 샘플 버퍼 x 4를 추가 합니다.
- 캐스트 4-20% 젤을 사용 하 고 부하 LaemmLi 단백질 해결책의 20-30 µ g 및 샘플 당 표준 단백질의 5-10 µ L.
- 서쪽 오 점 링 트리 스/GLICYNE /SDS 1 x 버퍼를 실행 젤 110 V 30-60 분 (시간 중지 염료 젤, 그렇지 않으면 몇 가지 추가 분에 대 한 실행의 끝에 도달 했습니다 확인)
- PVDF 막으로 단백질을 전송 하는 Electroblot ( 재료의 표참조) 세미 건조 시스템을 사용 하 여.
- 막 1 시간 실 온에서 흔드는에 적절 한 단백질 해결책 (우유/BSA 5%)에 몸을 담글 하 여 차단 합니다.
- 5% 우유 솔루션에서 안티-IQGAP1 1 차 항 체로 1:400 솔루션으로 만들기 ( 재료의 표참조).
- 차가운 방에서 밤새 통에 1 차적인 항 체 솔루션에 막 장소.
- 다음 날, 항 체 솔루션을 삭제 하 고 T-큰 술 1 x 솔루션에 흠뻑 젖어 (1 x T-큰 술: 1 x 트리 스 염 분 버퍼 추가 Tween20으로 0.1%) 7 분 동안 실 온에서 통에.
- 솔루션 및 바꾸기 x T-큰 술 1을 삭제 합니다. 3 회 반복 한다.
- 1:10,000 보조 마우스 항 체 솔루션 표준 서에 대 한 항 체를 추가 하 여 감지 되 리 ( 재료의 표참조) 고 막 통;에 2 시간에 대 한 실 온에 둡니다.
- 항 체 솔루션을 삭제 하 고 7 분 동안 실 온에서 통에 T-큰 술 1 x 솔루션에 담근 다.
- 솔루션 및 바꾸기 x T-큰 술 1을 삭제 합니다. 3 회 반복 한다.
- 화학 영상에 막 이미지와 chemiluminescent 솔루션에 막 5 분을 담근 다.
3. 대상-치료 억제제 감도 후보 R 유전자 때 려 눕에 의해 복원
-
세포 준비
- Trypsinization에 의해 단일 세포 현 탁 액을 준비 합니다. 세포는 도금 당일 transfection를 수행 합니다.
- 씻어 NCI N87 PBS로 세포 그리고 5-10 분 RPMI 중간 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청의 트립 신 (예를 들어, 각 1 mL의 트립 신에 대 한 매체의 2 개 mL)을 중화 하 추가 2 볼륨에 대 한 0.05 %trypsin / EDTA 솔루션 37 ° C에서 품 어.
- Trypan 푸른 얼룩을 사용 하 여 hemocytometer와 셀을 계산. 씨 2.5 x 105 셀 (60% 합류) 각 조건에 대해 T25 cm2 플라스 크에.
참고: 적절 한 시드 셀 수 셀 라인의 2 배 시간 및 실험의 기간에 의해 결정 됩니다. 목표 대상 유전자 실험의 전체 기간에 대 한 노크 다운 달성 하는. 9 개의 T25 cm2 플라스 크 transfection 조건 및 clonogenic 분석 결과 (컨트롤, 부정적인 transfection 컨트롤, 유전자-대상 transfection에 대 한 3 플라스 크 3 플라스 크 3 플라스 크)에 이상적입니다.
- Trypsinization에 의해 단일 세포 현 탁 액을 준비 합니다. 세포는 도금 당일 transfection를 수행 합니다.
-
Transfection 역
- 유전자-대상 준비 하 고 다음과 같이 각 T25 cm2 플라스 크에 대 한 제어 transfection 믹스를 부정.
- 각 유전자를 대상으로 siRNA oligonucleotides 또는 최소한의 필수적인 transfection 매체 (비율 1시 55분; 참조 테이블의 재료)에 부정적인 제어 siRNA oligonucleotides의 12.5 µ L를 희석.
- 양이온 liposome transfection 시 (siRNA oligonucleotides 유전자를 대상으로 1:1 비율, 참조 테이블의 재료)를 추가 합니다. 20 분 동안 실 온에서 품 어.
참고: transfection 믹스의 총 볼륨 700 µ L입니다. - 각 T25 cm2 플라스 크를 transfection 믹스의 700 µ L를 추가 합니다. 1-3 일 동안 37 ° C에서 세포를 품 어.
- 유전자를 때 려 눕 RT-PCR 및 서쪽 오 점 분석에 의해 확인 합니다. 상 상속 유전자 R 눕 (반복 단계 1.5) 식민지 형성 실험을 통해 대상된 치료 에이전트에 감도 복원에의 영향을 다시 확인 합니다.
- 유전자-대상 준비 하 고 다음과 같이 각 T25 cm2 플라스 크에 대 한 제어 transfection 믹스를 부정.
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Representative Results
그림 1 실험 절차의 프레임 워크를 설명합니다. 3 위 암 세포-라인 HER2 trastuzumab에 민감한의 높은 수준의 표현 (IC50 < 마약, 그림 2A, 왼쪽된 그래프의 피크 플라즈마 수준) 타겟된 치료 에이전트를 포함 하는 문화 매체에서 성장 했다. 복용량은 10 배 trastuzumab (10 µ g/mL)의 피크 플라즈마 농도 시작 하는 복용량으로 설정 되었고 점차적으로 8-12 개월의 기간 동안 400 µ g/mL로 증가 보다 낮은. 이후에, 우리는 3 subclones를 IC50 값 trastuzumab (그림 2A, 오른쪽 그래프)의 피크 플라즈마 수준 보다 낮은 안정적인 저항 표현 형 특징을 얻었다. 특히, 가장 저항 subclone, HR NCI N87, 28.57 (그림 2B)의 RR IC50 값에 도달 했습니다. IQGAP1 HR NCI N87 하위 라인의 저항 표현 형에서 중추적인 역할을 할 것으로 보인다. 단백질 및 유전자 표현의 분석 지원이 가설: 저항 subclone에 IQGAP1 단백질 수준 부모의 셀에 약 5-fold 이상입니다. 마찬가지로, 특 파 원 IQGAP1 유전자 발현 2.5-fold NCI N87 선 (그림 3A)에 보다 HR NCI N87 하위 라인에서 높은 수준 이다.
IQGAP1 유전자 침묵 trastuzumab 저항 표현 형의 발달에 있는 그것의 역할을 평가 하기 위해 수행 되었다. IQGAP1 유전자 발현을 침묵 하는 데 사용 하는 프로토콜 T25 cm2 셀 문화 술병 (약 105 셀 x 2.5)에서 성장 하는 세포의 거의 모든 IQGAP1 단백질 콘텐츠를 허물고 특히 효능 입증 (그림 3A).
또한, clonogenic 분석 결과 7 µ g/ml (그림 3B) IC50 값을 낮추는 방법으로 입증 시간 NCI N87 셀에 복원 trastuzumab 감도 입을 그 IQGAP1 유전자를 보여주는 작업 가설을 확인 했다.
그림 1: 프레임 워크 기본 메커니즘의 분석 생체 외에서 인수 대상 치료 저항. 3 다른 trastuzumab 저항 subclones 3 개의 다른 trastuzumab 민감한 암 세포 선에서 파생 했다 생성 하 고-세대 시퀀싱, immunohistochemical, HER2 신호 메커니즘에 변경에 대 한 특징 서쪽 오 점, 그리고 RT-PCR 기법입니다. 모든 subclones는 다른 저항 메커니즘을 보여주었다. 타겟 치료 감도 저항의 후보 드라이버 유전자 침묵 했다 때 특정 subclone에 복원 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 위 암 세포 라인에 clonogenic 분석 결과 통해 상대 저항 IC50 색인 (RR IC50)의 결정. (A) 성장 곡선 순진한 (왼쪽된 그래프)와 내성 (오른쪽 그래프) 셀 라인 식민지 형성 실험에 의해 생성 된 데이터를. X 축 trastuzumab 농도를 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. 표준 편차는 결코 5%를 초과 했습니다. (B) NCI N87 방지 subclone의 생성을 지 원하는 clonogenic 분석 결과의 대표 이미지. 타임 라인에 의해 같이 HR trastuzumab NCI N87 세포의 생성 대상된 에이전트에 지속적인 노출의 12 개월 필요 합니다. 이 수치는 Arienti 그 외 여러분 의 일에서 적응 9 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: IQGAP1 유전자 때 려 눕 여 trastuzumab 감도 복원. (A) IQGAP1 단백질 콘텐츠, densitometric 분석 막대 그래프, 부모의 NCI N87 라인, 그리고 그것의 저항 및 침묵 저항 subclone (왼쪽된 그래프)에 의해. MRNA는 IQGAP1 식 수준 또한 RT-PCR 기술 (오른쪽 그래프)에 의해 모든 3 셀-라인에서 확인. 데이터는 부모의 NCI N87 선의 100 µ g/mL trastuzumab의 저항 하 고 침묵 저항 subclone에 다른 감도 보여주으로 평균 ± sd (B). Clonogenic 분석 결과 제시 했다. 식민지는 셀 씨의 14 일 후에 계산 되었다. 축소판 그림 대표적인 식민지 문화를 보여 줍니다. 이 수치는 Arienti 그 외 여러분 의 일에서 적응 9 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 단계 | 프로토콜 | T25 cm2 |
| 씨 셀 60% 합칠 | 부착 세포 | 1.75 x 103 |
| 최소한의 필수적인 Transfection 매체 (비율 1:55)에 siRNA oligonucleotides 희석 | siRNA | 12.5 Μ L |
| Transfection 매체 | 687.5 Μ L | |
| Lipofectamine transfection 시 약 추가 | Lipofectamine 시 약 | 12.5 Μ L |
| 품 어 | 20 분 동안 실 온에서 품 어 | |
| 셀에 혼합물을 추가 | 셀 1-3 d 37 ° C에서 품 어 | |
표 1: 후보 저항 유전자 때 려 눕에 대 한 볼륨 및 시 약 금액을 권장합니다.
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Discussion
맞춤 및 타겟 치료 성장 열정을 elicited 있다, 전통적인 화학 요법 약물, 즉, 약물 내성의 신속 하 고 예측할 수 없는 인수 같은 주요 장애물을 직면 하는이 소위 '스마트' 치료. 타겟된 치료의 결과 개선 하기 위해, 그들을 일으키는 원인이 되는 메커니즘의 더 나은 이해를 통해 약물 저항 문제를 해결 해야 합니다. 여기, 우리는 방법론을 광범위 하 게 액세스할 수 있는 시험관에 암 세포 선 모델에서 타겟된 치료 약물에 저항을 취득된의 메커니즘을 조사을 제시.
타겟된 치료 저항 subclones의 생성은 가장 중요 하 고이 프로토콜을 사용, 셀 라인 사이 고 약 감도의 그들의 다른 학위를 내장 유전이 성분 때문에 단계를 표준화 하기 어렵습니다. 이러한 이유로, 저항 subclones를 얻는 데 필요한 시간이 달라질 수 있습니다. 항 암 분자 에이전트에 만성 노출은 일반적으로 강력한 종양 성장 저해를 발생합니다. 그러나, 기간 후에 가변의 지속적인 약물 노출 (8-12 개월), 세포 치료 제어 셀의 속도와 성장 재개.
또한, 그 유전자 발현 데이터 대상 유전자 관련 치료 저항을 가설 하는 데 사용 되었습니다에 불구 하 고 다른 식 수준 않습니다 항상 부적 절 한 단백질 기능을 반영 하거나 저항 표현 형을 연관. Putative 약물 내성 유전자의 표현과 타겟된 치료에 저항 사이의 관계의 복잡성으로 인하여 더 분자 조사 필요, 유전자/단백질을 포함 한 생물 정보학 분석 등 상호 작용, 생물 프로세스 농축 및 분자 모델링.
또 다른 중요 한 포인트는 특이성 siRNA oligonucleotide 줄이기 위해 대상 식의 정확도 될 수 있습니다. 한 가지 가능한 솔루션 기능 siRNA와 동일한 대상 유전자에 대 한 siRNA의 혼합물을 선택 하기 위한 디자인 도구를 사용 하 여 수 있습니다.
마지막으로, 작은 제한 대상된 치료 억제제 transfection 과도 기간 때문에 감도 복원 하는 데 사용 하는 방법에 관련 되어 있습니다. 최대한 눕의 표적 mRNA (> 85%) 2 일 후 transfection에 알려졌다 고 유지 되었다 > 일 5-7을 통해 80%. 중요 한 노크 다운, 이기는 하지만 낮은 범위, 여전히 제 6 일에 관찰 되었다. 이러한 이유로, 확인 마약 감도의 복원에 대 한 세포 독성 분석 결과 유전자 침묵에서 약 5 일 이내에 수행 되어야 한다.
우리의 프로토콜에 생체 외에서 인수 저항 조사에 대 한 시간 및 비용 effective 방법입니다. 저항 subclones의 생성 항 암 타겟된 에이전트에 저항을 취득된의 새로운 메커니즘을 공개 도움이 될 내 종양이 암 세포의 미러링. 특히, 그들은 더 높은 처리량 genomic 또는 민감한 들 보다 내성 세포에 분자 변경 식별 proteomic 상영에 적합.
이 전 임상 플랫폼 타겟된 치료제 다른 종양 histotypes에 약물 저항을 극복 하기 위해 추가 마약 목표의 발견에 대 한 표준 절차를 제공 하는 일반적인 저항 메커니즘을 조사 하기 위해 쉽게 확장할 수 있는.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 박사 베로니카 Zanoni 원고를 편집 하는 것을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples |
| ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT | Bio-Rad | 1708891 | The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR. |
| TaqMan gene expression assay | Life Technologies | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end. |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells. |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard. |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample. |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 456-1094 | Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis. |
| Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards | Bio-Rad | 1610376 | Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD). |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | 10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE. |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 1704156 | Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane. |
| Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate | Bio-Rad | 1610381 | StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots. |
| Immun-Star WesternC solution | Bio-Rad | 5572 | Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein. |
| Universal Negative Control | Invitrogen | 12935300 | Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology. |
| opti-MEM Glutamax Medium | Thermo Fisher Scientific | 51985026 | Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology. |
| Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA | Ambion | 4390824 | RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types. |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778075 | Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types. |
| Mouse anti-IQGAP1 | Invitrigen | 33-8900 | working concentration: 1:400 in 5% milk solution |
| goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005 | Santa Cruz | sc-2005 | working concentration: 1:10000 in 5% milk solution |
| PMSF | Sigma Aldrich | P 7626 | this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase |
| Thermocycler for RT-PCR | MJ Research | MJ Research PTC-200 Thermal Cycler | it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers |
| Real Time RT-PCR instrument | Applied Biosystems | 7500 RT-PCR system | This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers |
| Microvolume Spectrophotometers | Thermo Scientific | Nanodrop | It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample |
| Blotting system | Bio-Rad | Trans-Blot Turbo system | It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes |
| Image acquisition system and gel documentation | Bio-Rad | Chemidoc image system | It is easy to use for chemiluminescent detection |
References
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