Söker förare vägar av förvärvad resistens till riktad terapi: resistenta Subclone Generation och känslighet återställa av genen Knock-down

Summary

Detta är en tid – och cost effective in vitro- protokoll undersöka mekanismer för förvärvad resistens mot riktade terapeutiska medel, vilket är en mycket medicinska behov i cancer management.

Abstract

De senaste två decennierna har sett en förskjutning från cytostatika till riktad terapi i medicinsk onkologi. Även om riktade terapeutiska medel har visat mer imponerande klinisk effekt och minimerade biverkningar än traditionella behandlingar, har resistens blivit den största begränsningen till deras förmåner. Flera prekliniska/in vitro- / invivo modeller av förvärvad resistens mot riktade agenter i klinisk praxis har utvecklats främst med hjälp av två strategier: i) genmanipulation för modellering genotyper av förvärvad resistens, och ii) in vitro / invivo urval av resistenta modeller. I den nuvarande arbetet föreslår vi en sammanhållande ram, för att undersöka de bakomliggande mekanismerna ansvariga för förvärvad resistens mot riktade terapeutiska medel, start från generationen av resistenta cellulära subkloner till beskrivningen av tysta förfaranden som används för att återställa känsligheten till hämmaren. Denna enkla tid och cost effective strategi är allmänt tillämplig och kunde enkelt utökas till att undersöka resistensmekanismer till andra riktade terapeutiska läkemedel i olika tumör histotypes.

Introduction

Följa upp de avgörande upptäckterna i molekylära och cellulära biologi, har ett antal nya syntetiserade anticancer molekyler utvecklats för att selektivt rikta onkogena signalvägar i ett brett spektrum av tumörtyper. Särskilt två kategorier av riktade terapeutiska medel med unika egenskaper i onkologi, nämligen syntetiska kemiska föreningar och rekombinant monoklonala antikroppar, är kända för att ha uppnått kliniska framgångar och dramatiskt förändrad cancervården i senaste decennierna^1,2,3.

Ändå, trots sin imponerande initialt svar på behandling, majoriteten av cancerpatienter har utvecklat resistens mot alla riktade terapeutiska medel, monoklonala antikroppar såväl kinashämmare. Som en följd är läkemedelsresistens, det stora hindret för klassiska anti-cancer läkemedel⁴, fortfarande en stor utmaning för framväxande riktade terapier^5,6.

Resistens mot riktad terapi kan vara inneboende (dvsprimära) eller förvärvad (dvssekundär). Inneboende resistens beskriver de novo brist på svar på behandling, medan sekundär motstånd uppstår efter en period av svar till drogen behandling⁷. Den senare orsakas av utbrott av små kohorter av tumörceller inom huvuddelen av primitiva tumören eller inbäddat i distala kryptiska anatomiska nischer, motstånd till en eller flera uppvisar upp till 90% och riktade terapeutiska medel. Molekylära mekanismer bakom en resistensutveckling till riktad terapi främst resultera från målet genmutationer och redundant aktivering av andra Pro överlevnad signalvägar, vars förståelse är fortfarande långt ifrån fullständig⁸.

I detta arbete föreslog vi en tid och cost effective metod för att undersöka in vitro- mekanismer av förvärvad resistens mot riktade terapeutiska medel, start från generationen av resistenta cellulära subkloner till beskrivningen av ljuddämpning förfaranden som används för att återställa känsligheten till den-hämmaren, ett viktigt verktyg som används för att testa och validera arbetshypoteser. I synnerhet användes vår strategi för att undersöka, i magsäckscancer, resistensmekanismer för att trastuzumab (t.ex., Herceptin), en humaniserad monoklonal antikropp som inriktning på det extracellulära området av HER2 protein⁹. Trastuzumab + kemoterapi är allmänt accepterade som standard första linjens behandling vid HER2-positiv metastaserad bröstcancer. Tack vare senaste prekliniska studier som visar att anti-HER2 terapier har betydande verksamhet i både in vitro- och in-vivo HER2-positiv ventrikelcancer modeller^10,11, molekylär droger inriktning HER2 har varit utförligt undersökt i kliniska prövningar, är av vilka några fortfarande pågående, på patienter med gastroesofageal cancer^12,13,14,15.

Dessa studier har betonat det ökande antalet patienter som upplever motstånd mot trastuzumab¹⁶, på samma sätt som vad som observerats för andra riktade terapeutiska hämmare. I synnerhet trastuzumab svar var 47% och medianvärdet för total överlevnad för patienter om trastuzumab + kemoterapi var endast 2,7 månader längre än för patienter på kemoterapi ensam¹⁷. Detta föreslog att primära trastuzumab motstånd är förhärskande, sekundära trastuzumab motstånd är oundvikligt. Av denna anledning finns det brådskande behovet av att klargöra de mekanismer som orsakar HER2-riktad terapi motståndet i magsäckscancer, vilket är ännu mer problematiskt ges intra-tumoral genetisk heterogenitet i neoplasi¹⁸.

Dessutom har resistensmekanismer till trastuzumab i magsäckscancer bevisat utmanande att förklara, delvis på grund av svårigheten att erhålla tillförlitlig prekliniska modeller representant för detta tillstånd. Oshima et al. rapporterade en vivo urval inloggningsmetod av trastuzumab-resistenta gastric cancer cellinjer, bestående av en upprepad kultur för en liten kvarstående peritoneal metastaser efter behandling med trastuzumab¹⁹. Dock bidragit behovet av en inhägnad, specifika djurhantering expertis och godkännande av djur etikkommittén till att göra det en tid och kostnad-tidskrävande metod. Den metod som vi beskriver i detta arbete är enkel och allmänt tillämpliga och kunde enkelt utökas till att undersöka resistensmekanismer för att andra terapeutiska läkemedel i olika tumör histotypes²⁰.

Protocol

Obs: Detta protokoll har anpassats specifikt för analys av mekanismerna bakom förvärvad resistens mot trastuzumab HER-positiv ventrikelcancer cellinjer. Alla laboratory instrument behövs redovisas i Tabell för material. 1. generering av riktade behandlingsresistenta subkloner Obs: Detta är den mest kritiska och svåra att standardisera steg i protokollet på grund av att olika cellinjer kan uppvisar olika känslighet till den rikta terapeutiska …

Representative Results

Figur 1 beskriver ramen för experimentella förfarandet. Tre gastric cancer cell-linjer att uttrycka en hög nivå av HER2 och känsliga för trastuzumab (IC50 < peak plasmanivå av drogen, figur 2A, vänstra grafen) odlades i odlingsmedium som innehåller den rikta terapeutisk agenten. En dos 10-faldigt lägre än den maximala plasmakoncentrationen av trastuzumab (10 µg/mL) sattes som startdosen, och gradvis ökas t…

Discussion

Även personlig och riktade terapier har lett till växande entusiasm, dessa så kallade ”smarta” behandlingar står inför samma stora hinder som traditionell kemoterapi droger, dvs, snabba och oförutsägbara förvärv av läkemedelsresistens. För att förbättra resultaten av riktad terapi, måste läkemedelsresistens problem lösas genom en bättre förståelse av de mekanismer som orsakar dem. Vi presenterade här, en lättillgänglig in vitro- Metod för att undersöka mekanismerna av förvä…

Materials

Trizol Reagent	Invitrogen	15596026	TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT	Bio-Rad	1708891	The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR.
TaqMan gene expression assay	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	78501	Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Scientific	78440	Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates.
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard.
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample.
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	Bio-Rad	456-1094	Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards	Bio-Rad	1610376	Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs	Bio-Rad	1704156	Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane.
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate	Bio-Rad	1610381	StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots.
Immun-Star WesternC solution	Bio-Rad	5572	Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein.
Universal Negative Control	Invitrogen	12935300	Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology.
opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology.
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA	Ambion	4390824	RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778075	Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types.
Mouse anti-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	working concentration: 1:400 in 5% milk solution
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	working concentration: 1:10000 in 5% milk solution
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase
Thermocycler for RT-PCR	MJ Research	MJ Research PTC-200 Thermal Cycler	it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Real Time RT-PCR instrument	Applied Biosystems	7500 RT-PCR system	This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Microvolume Spectrophotometers	Thermo Scientific	Nanodrop	It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample
Blotting system	Bio-Rad	Trans-Blot Turbo system	It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes
Image acquisition system and gel documentation	Bio-Rad	Chemidoc image system	It is easy to use for chemiluminescent detection