Summary
זהו פרוטוקול זמן cost effective במבחנה חוקרים על מנגנוני ההתנגדות רכשה סוכני טיפולית ממוקד, ובגלל זה צורך רפואי קליניות מאוד בניהול סרטן.
Abstract
בעשרים השנים האחרונות ראינו משמרת של תרופות ציטוטוקסיות לטיפול ממוקד לאונקולוגיה רפואית. למרות יישוב סוכני טיפולית הראו יעילות קלינית מרשים יותר תופעות לוואי ממוזער טיפולים מסורתיים, תרופתיים הפך המגבלה העיקרית היתרונות שלהם. מספר מודלים פרה/במבחנה/ויוו של ההתנגדות רכשה סוכני ממוקד בטיפול קליני פותחו בעיקר באמצעות שתי אסטרטגיות: מניפולציה גנטית i) להכנת דגמים אחרים של ההתנגדות רכשה, ii) במבחנה / אין ויוו מבחר דגמים עמיד. בשנת העבודה הנוכחית, אנו מציעים מסגרת המאחד, על חקירת המנגנון הבסיסי אחראי על ההתנגדות רכשה סוכני טיפולית ממוקד, החל מהדור של subclones הסלולר עמידים לתרופות על תיאור של להשתיק הליכים המשמשים עבור שחזור הרגישות לחומר המדכא. פשוט הזמן cost effective בגישה זו הוא החלים נרחב, אפשרות להאריך בקלות לחקור את מנגנוני ההתנגדות לסמים אחרים טיפולית יישוב בגידול שונים histotypes.
Introduction
עוקב אחרי התגליות מכריע בביולוגיה מולקולרית, תאית, מספר מולקולות נגד סרטן מסונתז הרומן פותחו באופן סלקטיבי היעד oncogenic איתות המסלולים במגוון רחב של סוגי גידולים. בפרט, שתי קטגוריות של יישוב סוכני טיפולית עם מאפיינים ייחודיים באונקולוגיה, תרכובות כימיות כלומר סינתטי של נוגדנים חד-שבטיים רקומביננטי, ידועים השיגו הצלחות קליני וטיפול בסרטן שינו באופן דרמטי העשורים האחרונים1,2,3.
ובכל זאת, למרות התגובה הראשונית שלהם מרשים לטיפול, הרוב המכריע של חולי סרטן פיתחו עמידות לתרופות לכל הסוכנים טיפולית יישוב, נוגדנים חד-שבטיים והן מעכבי קינאז. כתוצאה מכך, תרופתיים, המשוכה העיקריים תרופות נגד סרטן קלאסי4, הוא עדיין אתגר גדול עבור טיפולים ממוקדים המתעוררים5,6.
עמידות לטיפול ממוקד עשוי להיות מהותי (קרי, ראשי) או רכשה (קרי, משני). התנגדות פנימית מתאר דה נובו חוסר תגובה לטיפול, בעוד התנגדות משני מתרחשת לאחר תקופת בתגובה סמים טיפול7. האחרון הוא הנגרמת על ידי התפרצויות של גדודים קטן של תאים סרטניים בתוך עיקר הגידול פרימיטיבי או בנויים דיסטלי נישות אנטומי נסתר, מפגין עד 90% עמידות לתרופה אחת או יותר ממוקד סוכני טיפולית. המנגנונים המולקולריים שבבסיס פיתוח עמידות לטיפול ממוקד בעיקר תוצאה של מוטציות היעד והפעלה מיותר של אחרים פרו-הישרדות איתות המסלולים, ההבנה של מי הוא עדיין רחוק מלהיות שלם8.
בעבודה זאת, הצענו זמן cost effective בגישה לחקור מנגנונים במבחנה של ההתנגדות רכשה סוכני טיפולית ממוקד, החל מהדור של subclones הסלולר עמידים לתרופות על תיאור של שתיקת הליכים המשמשים עבור שחזור הרגישות לחומר המדכא, כלי חיוני המשמש עבור בדיקה ואימות של בהנחות עבודה. בפרט, הגישה שלנו שימש לחקור, סרטן קיבה, מנגנוני ההתנגדות הרצפטין (למשל, הרצפטין), מואנשים חד-שבטיים מיקוד המחשבים חוץ-תאי של החלבון HER29. הרצפטין + כימותרפיה מקובל כטיפול רגיל קו ראשון לסרטן שד גרורתי HER2 חיובי. בזכות מחקרים פרה מציג את האנטי-HER2 טיפולים יש פעילות משמעותית בשני במבחנה , ויוו HER2 חיובי סרטן קיבה מודלים10,11, היה מולקולרית שהתרופות המתוות HER2 בחן בהרחבה בניסויים קליניים, חלקם עדיין בעיצומה, על חולים עם גסטרו סרטן12,13,14,15.
מחקרים אלה הדגישו את המספר העולה מהמטופלים חווים התנגדות הרצפטין16, בדומה אל תצפית על מעכבי טיפולית יישוב אחרים. בפרט, קצב התגובה של הרצפטין היה 47%, חציון ההישרדות הכוללת של חולים על הרצפטין + כימותרפיה היה ארוך יותר לחולים על כימותרפיה לבד172.7 חודשים בלבד. זה הציע כי בעוד הרצפטין העיקרי ההתנגדות היא שכיחה, הרצפטין משני ההתנגדות היא בלתי נמנעת. מסיבה זו, יש צורך דחוף כדי להבהיר את מנגנוני גרימת טיפול ממוקד-HER2 עמידות סרטן קיבה, אשר הוא בעייתי עוד יותר בהתחשב הטרוגניות גנטית אינטרה-tumoral את זה neoplasia18.
בנוסף, מנגנוני עמידות הרצפטין בסרטן קיבה הוכיחו מאתגר להסביר, חלקית עקב הקושי בהשגת במודלים פרה אמין נציג של מצב זה. אושימה. et al. דיווח על שיטת הבחירה ויוו של שורות תאים עמידים הרצפטין סרטן קיבה, המורכב תרבות חוזרות ונשנות של גרורות קטנות הצפק שיורית לאחר הטיפול עם הרצפטין19. עם זאת, הצורך של זיווד, ההתמחות לטיפול בבעלי חיים ספציפיים ועל האישור של ועדת האתיקה חיה תרמו הפיכתה לפעולת לצרוך זמן עלות. הגישה שנתאר בעבודה זו פשוט וקל החלים נרחב, אפשרות להאריך בקלות לחקור את מנגנוני ההתנגדות לסמים אחרים טיפולית גידול שונים histotypes20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה במיוחד הותאם לניתוח של המנגנונים ההתנגדות רכשה הרצפטין של שורות תאים של סרטן קיבה וורויקשייר-חיוביות. כל מכשירי מעבדה הצורך מדווחים בטבלה של חומרים.
1. דור של Subclones עמידים לטיפול ממוקד
הערה: זה הכי קריטי, קשה לתקנן את שלב בפרוטוקול בשל העובדה כי שורות תאים שונים עשוי להפגין רגישויות שונות לחומר המדכא טיפולית יישוב עצמאי של התרכזות histotype או התרופה שלהם הגידול בשימוש.
- תרבות NCI-N87 תא קו בינוני RPMI בתוספת סרום עגל עוברית (10%) וגלוטמין (2 מ מ, 1%), כמו טפט ב 37 מעלות צלזיוס, זרע זה על 25 ס מ2 תרבות מבחנות.
- הוסף למדיום תרבות ב כל הבקבוק 10 µg/mL של הרצפטין המינון ההתחלתי. חושפים את התאים המינון ההתחלתי עד שהם לחדש גדל.
הערה: המינון ההתחלתי של החומר המדכא טיפול ממוקד צריך להיות 10-fold נמוך יותר ריכוז שיא פלזמה שלה. ריכוז שיא פלזמה היא הרמה הגבוהה ביותר של ריכוז התרופה זוהה דם החולה בדרך כלל בעקבות מספר מינונים של טיפול סטנדרטי. ערך זה ניתן יהיה לאחזר ממחקרים על פרמקוקינטיקה. - לעקוב אחר גדילת תאים עם השיטה הדרה trypan blue; כאשר יתחדש צמיחת תאים (בדרך כלל לאחר תקופה של שבועיים עד שלושה שבועות), חושפים את התאים 10-fold ריכוז מינון גבוה יותר של הרצפטין.
- לחשוף לתאים מנה בהדרגה גדל והולך של הרצפטין (מתוך 100 µg/mL כדי µg 400/mL) עד לשמור תאים הגדלים (לאחר כשבועיים) למרות נוכחותם של ריכוז סמים גבוהה (לפחות 2.5 - 4-fold גבוה יותר מאשר הפסגה פלזמה).
-
ביצוע וזמינותו של clonogenic כדי להעריך את רמת ההתנגדות לטיפול ממוקד-כל שינוי של הריכוז של החומר המדכא טיפול המטרה בטווח הבינוני תרבות, ולהגדיר עמידות יחסית IC50 אינדקס (RR IC50) כדלקמן.
- זרע 500 תאים 24 צלחות תרבות רב טוב.
הערה: בארות 5 צריך להיות מוכן לכל ערכת תנאים. - לחשוף תאים הגדלת יעד טיפול מעכב (הרצפטין) ריכוזים של µg/mL 100 עד 400 µg/mL.
- דגירה בתאים חממה2 CO ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 ימים.
- לאחר דגירה, לתקן, כתם דגימות כדלקמן.
- להסיר תאים בינונית ולאחר מכן לשטוף עם PBS 1 x 10 מ"ל. 1 x PBS להסיר ולהוסיף 2-3 מ"ל של פתרון קיבעון (חומצה אצטית: מתנול, 1:7, (כרך/כרך)). להסיר את הפתרון קיבוע ולהוסיף הפתרון קריסטל ויולט 0.5%. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים
- להסיר את הפתרון קריסטל ויולט בקפידה על-ידי כ רפה בעברית עם פיפטה ומשקיעים לוחות במי ברז לשטיפה מכל משקעים הפתרון קריסטל ויולט. מילה נהדרת בטמפרטורת החדר עד 2 ימים.
- לספור מושבות של יותר מ- 50 תאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה (4 X הגדלה).
הערה: שני משקיפים עצמאיים נדרשים עבור זה. - לחשב RR IC50 כיחס בין ערך50 IC תאי היעד-טיפול עמידים subclone, הערך של התאים המקורי/נאיבי.
- זרע 500 תאים 24 צלחות תרבות רב טוב.
2. אימות פרוטוקול עבור המועמד ממוקד בטיפול ההתנגדות ג'ין (R-גן)
הערה: לאחר אפיון גנים, חתימות המשויך ההתנגדות רכשה יעד טיפול וג'ין כל מועמד כמו נהג של התנגדות ייחקר באמצעות: א) RT-PCR, ומערבי ב) כתם ניתוח.
-
בזמן אמת RT-PCR
- לחלץ RNA הכולל שורות תאים באמצעות תערובת thiocyanate-פנול-כלורופורם חומצה guanidinium (ראה טבלה של חומרים).
- לבצע תגובות שעתוק במהופך (RT) באמצעות תחל hexamer אקראיים ולהגדיר הצנטרפוגה תרמי כדלקמן: הטרמה 25 ° c במשך 5 דקות, RT ב 46 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ו- RT איון ב 95 ° C עבור 1 דקות.
- שימוש 400 ננוגרם של RNA הכולל עבור ריאקציה 20 µL. להכין לתערובת תגובה עבור מדגם כדלקמן: 7 µL RNase חינם H2א, 2 µL cדנ א (10 ng/µL), µL 1 20 x התווית על-ידי פלורסנט בדיקה במטרה ולאחר 10 µL 2 x Mix המכילה מאגר dNTPs, ה-DNA פולימראז (ראה טבלה של חומרים).
- להוסיף 20 µL של תערובת התגובה כל צלחת היטב ולהפעיל את התוכנית הבאה: מחזיקים את הבמה ב 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (מחזור 1); אז 40 מחזורי ב 95 ° C 15 s ו ב 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה.
-
תספיג חלבון
- לשחזר המתלים תא על-ידי הוספת 2 מ"ל של 0.05% טריפסין/EDTA פתרון ומאפשר 2-3 דקות עבור טריפסין לעבודה.
- להוסיף 2 כרכים בינוני המכיל 10% עוברית שור סרום כדי לנטרל טריפסין (למשל, 2 מ ל בינונית עבור כל 1 מ"ל של טריפסין) ואת צנטריפוגה-g x 1,200 עבור 5 דק להשליך supernatant ותאי תשטוף עם PBS קר 1 x.
- תגובת שיקוע צנטריפוגה-g x 1,200 עבור 5 דקות וזורקים. Resuspend בגדר תא עם פירוק מאגר, דגירה על כיסא נדנדה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- הכמות של פירוק מאגר תלויה מספר התאים (למשל, µL 100 עבור 1 x 106 תאים); הקפד להכין מאגר פירוק טריים בכל פעם. עבור 1 מ"ל של פירוק מאגר הכנה (להשאיר על קרח): שימוש 975 µL M-לכל מאגר lysate בתרבית של מעכבי פרוטאז, פוספטאז µL 15, 10 µL 100 מיקרומטר PMSF מעכבי.
- לשחזר את החלבון supernatant על ידי צנטריפוגה lysate תא ב g x 13,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- לקבוע ריכוז חלבון באמצעות שיטת של BCA.
- להוסיף 4 x LaemmLi מדגם מאגר דגימות חלבון (לפחות 20-30 µg של חלבון) וחום ב 100 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
- השתמש precast 4-20% ג'ל וטען µg 20-30 של פתרון חלבון LaemmLi ו- 5-10 µL של חלבון סטנדרטית עבור דגימה.
- למלא את הטבעת תספיג טריס/GLICYNE /SDS 1 x מאגר ולהפעיל ג'ל-110 V למשך 30-60 דקות (עצירת הזמן בדוק כי לצבוע הגיע לסוף של הג'ל, אחרת להפעיל לכמה דקות נוספות)
- Electroblot להעביר את החלבון לתוך קרום PVDF (ראה טבלה של חומרים) באמצעות מערכת חצי יבש.
- לחסום את הקרום על-ידי לספוג את הפתרון המתאים חלבון (חלב/BSA 5%) על ניעור בטמפרטורת החדר מאובטח.
- להפוך את פתרון 1:400 עם נוגדן anti-IQGAP1 העיקרי בפתרון חלב 5% (ראה טבלה של חומרים).
- מקם את הקרום פתרון נוגדן ראשוני על מטרף בחדר קר בן לילה.
- למחרת, לבטל את הפתרון נוגדן ומשרים בפתרון 1 x T-TBS (1 x T-TBS: 1 x טריס מלוחים מאגר שנוספו על-ידי Tween20 0.1%) על מטרף בטמפרטורת החדר במשך 7 דקות.
- להתעלם T-TBS 1 x והחלפה של פתרון. חזור על 3 פעמים.
- להפוך את פתרון העכבר המשני-נוגדן 1:10,000 על-ידי הוספת נוגדן המערבי הסטנדרטי כתם זיהוי (ראה טבלה של חומרים) ומניחים את הקרום על מטרף; יוצאים בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
- לבטל את הפתרון נוגדן ומשרים בפתרון 1 x T-TBS על מטרף בטמפרטורת החדר במשך 7 דקות.
- להתעלם T-TBS 1 x והחלפה של פתרון. חזור על 3 פעמים.
- להשרות קרום עבור 5 דקות פתרון chemiluminescent ולאחר תמונה הקרום על imager chemiluminescence.
3. שחזור רגישות מעכב היעד-טיפול על ידי המועמד R-גן דפיקה למטה
-
הכנה תא
- הכן תא בודד השעיה על ידי trypsinization. לבצע תרביות תאים ביום בו התאים אינם מצופים.
- לשטוף NCI-N87 תאים עם PBS, דגירה ב 37 ° C עם פתרון טריפסין/EDTA 0.05% 5-10 דקות להוסיף 2 נפח של RPMI בינוני המכיל 10% עוברית שור סרום לנטרל טריפסין (למשל, 2 מ ל בינונית עבור כל 1 מ"ל של טריפסין).
- ספירת תאים hemocytometer באמצעות צביעת trypan blue. זרע 2.5 10x5 תאים (60% הנהרות) לתוך בקבוקון2 ס מ T25 עבור כל תנאי.
הערה: מספר מתאים של תאים עבור זריעה נקבעת לפי זמן ההכפלה של הקו הסלולרי וכן את משך הזמן של הניסוי. המטרה היא להשיג את היעד גן דפיקה למטה משך כל זמן הניסוי. תשעה T25 ס מ2 מבחנות הינם אידיאליים עבור תנאים תקנים ואת וזמינותו clonogenic (3 מבחנות עבור פקדים, 3 מבחנות עבור פקדים שלילי תרביות תאים, 3 מבחנות עבור ג'ין-יעד תרביות תאים).
- הכן תא בודד השעיה על ידי trypsinization. לבצע תרביות תאים ביום בו התאים אינם מצופים.
-
תרביות תאים הפוכה
- הכן ג'ין-מטרה ושלילי שליטה מיקס תרביות תאים עבור כל הבקבוק2 ס מ T25 כדלקמן.
- לדלל µL 12.5 כל פילוח ג'ין oligonucleotides siRNA או שליטה שלילי oligonucleotides siRNA במדיום תרביות תאים חיוניים מינימלי (יחס 1:55; ראה טבלה של חומרים).
- הוספת ריאגנט תרביות תאים ליפוזום cationic (יחס 1:1 עם פילוח ג'ין oligonucleotides siRNA; ראה טבלה של חומרים). דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
הערה: הנפח הכולל של המיקס תרביות תאים הוא 700 µL. - להוסיף 700 µL של תרביות תאים לערבב את הבקבוק2 ס מ לכל T25. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-3 ימים.
- ודא ג'ין דפיקה למטה על-ידי ה-RT-PCR וניתוח תספיג חלבון. בדוק היטב את השפעת בשם R-גן הדפיקה למטה על שחזור רגישות לסוכן טיפולי ממוקד באמצעות ניסויים היווצרות המושבה (חזור על שלב 1.5).
- הכן ג'ין-מטרה ושלילי שליטה מיקס תרביות תאים עבור כל הבקבוק2 ס מ T25 כדלקמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מתווה במסגרת ההליך ניסיוני. שלושה סרטן קיבה-שורות תאים המבטאים רמה גבוהה של HER2, רגישות הרצפטין (IC50 < שיא רמת הפלסמה של התרופה, 2A איור, גרף השמאלי) גדלו במדיום תרבות המכיל את הסוכן טיפולית יישוב. מנה 10-fold נמוכים מריכוז הפלסמה שיא של הרצפטין (10 µg/mL) היה לקבוע את המינון ההתחלתי, בהדרגה ל 400 µg/mL על פני תקופה של 8-12 חודשים. לאחר מכן, השגנו שלוש subclones מאופיין הפנוטיפ ההתנגדות יציב עם IC50 ערכים נמוכים יותר רמות פלזמה שיא של הרצפטין (2A איור, גרף נכון). בפרט, subclone עמיד ביותר, HR NCI N87, להגיע אל הערך50 RR IC 28.57 (איור 2B). IQGAP1 מופיע לשחק תפקיד מרכזי פנוטיפ ההתנגדות של קו תת HR NCI N87. הניתוחים של ביטויים חלבון וג'ין נתמך השערה זו: רמת חלבון IQGAP1 subclone עמיד הוא בערך 5 פי גבוה יותר מאשר בתאי הורים. באופן דומה, כתב ביטוי גנים IQGAP1 הוא גבוה 2.5-fold בשורה HR NCI N87 משנה מאשר הקו NCI N87 (איור 3 א).
IQGAP1 ג'ין להחרשת בוצעה כדי להעריך את תפקידו בהתפתחות פנוטיפ עמיד הרצפטין. פרוטוקול שמשמש להשתקת ביטוי גנים IQGAP1 הוכיח אפקטיבי במיוחד כדי להפיל את תכולת החלבון של IQGAP1 על כמעט כל התאים גדל בבקבוקון T25 ס מ2 תא תרבות (כ 2.5 x 105 תאים) (איור 3 א).
יתר על כן, וזמינותו clonogenic אישר את ההשערה עבודה, מציג את הגן IQGAP1 הזה להשתיק משחזר רגישות הרצפטין בתאים HR NCI N87 כמו evidenced על-ידי הנמכת חשיבות IC-50 -µg/mL 7 (איור 3B).
איור 1: מסגרת לניתוח במבחנה של המנגנונים רכשה ממוקד ההתנגדות טיפול. שלושה subclones עמידים הרצפטין שונים שמקורם שלוש שורות תאים סרטן הרגישים הרצפטין שונים היו שנוצר, המאופיינת עבור שינויים מנגנוני איתות HER2 הדור הבא רצפי, immunohistochemical, כתם המערבי, וטכניקות RT-PCR. כל subclones הראה מנגנון התנגדות שונים. טיפול ממוקד רגישות שוחזר בשנת subclone מסוים כאשר המועמד ג'ין הנהג של התנגדות הושתק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: קביעת עמידות יחסית IC50 אינדקס (RR IC50) באמצעות clonogenic assay בשורות תאים סרטן קיבה. (א) צמיחה ' עקומות '-נתונים תמימה (הגרף השמאלי) עמיד (גרף נכון)-שורות תאים שנוצרו על-ידי המושבה ויוצרים ניסויים. ציר ה-x מייצג את ריכוז הרצפטין. קווי שגיאה לייצג סטיית תקן (SD). סטיית התקן של חריגה לא 5%. (B) להחליפן בתמונות של וזמינותו clonogenic תומך דור NCI N87-עמידים subclone. כפי שמוצג על ידי קו הזמן, הדור של HR הרצפטין NCI N87 תאים נדרש 12 חודשים של חשיפה מתמשכת לסוכן יישוב. נתון זה מותאם מעבודה של. Arienti et al. 9 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: שחזור הרצפטין רגישות מאת IQGAP1 ג'ין דפיקה למטה. (א) תכולת החלבון IQGAP1, על ידי ניתוח densitometric מוצג הגרף, בתור הורים NCI N87, וב subclone שלה-עמיד, עמידים מושתק (הגרף השמאלי). MRNA רמת הביטוי IQGAP1 אומתה גם בשורות כל שלושה התאים-בטכניקת RT-PCR (נכון גרף). הנתונים הוצגו רשע ± SD. (B) Clonogenic assay הראה את רגישות שונה של הורים NCI N87 קו, שלה subclone עמיד, עמידים מושתקים על הרצפטין µg/mL 100. המושבה הייתה בספירה אחרי 14 ימי תא זרע. תמונות ממוזערות מנתונים המושבה נציג תרבויות. נתון זה מותאם מעבודה של. Arienti et al. 9 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| צעדים | פרוטוקול | T25 ס מ2 |
| Confluent 60% תאי זרע | תאים חסיד | 1.75 x 103 |
| לדלל siRNA oligonucleotides במדיום תרביות תאים חיוניים מינימלי (יחס 1:55) | siRNA | 12.5 ΜL |
| תרביות תאים בינוני | 687.5 ΜL | |
| הוספת ריאגנט תרביות תאים Lipofectamine | ריאגנט Lipofectamine | 12.5 ΜL |
| דגירה | דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות | |
| להוסיף תערובת לתאים | דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-3 יח | |
טבלה 1: מומלץ כמויות ריאגנט ואמצעי אחסון עבור המועמד ההתנגדות ג'ין דפיקה למטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד אישית ממוקדת טיפולים יש elicited ההתלהבות גוברת, אלה טיפולים "חכם" כביכול עם הפנים את המשוכה הגדולות באותה תרופות כימותרפיות המסורתי, כלומר, רכישת תרופתיים מהירה ובלתי צפויים. כדי לשפר את התוצאות של טיפול ממוקד, צריך יהיה לפתור בעיות תרופתיים דרך הבנה טובה יותר של המנגנונים שגורמים להם. כאן, הצגנו מתודולוגיה נגישים נרחב במבחנה כדי לחקור את מנגנוני ההתנגדות רכשה לסמים טיפול ממוקד במודלים קו תאי סרטן.
הדור של יישוב subclones עמידים לטיפול הוא הכי קריטי, קשה לתקנן בשלב של פרוטוקול זה, בשל הטרוגניות גנטית מהותי בין השורות תא בשימוש, וכדי מידת הרגישות סמים שונים. מסיבות אלו, הזמן הנדרש כדי לקבל subclones עמידים עשויים להשתנות. חשיפה כרונית סוכנים מולקולרית נגד סרטן בדרך כלל גורם עיכוב גדילה של הגידול חזקה. עם זאת, לאחר תקופה המשתנה של חשיפה מתמשכת סמים (8-12 חודשים), תאים לחדש את הצמיחה, בקצב דומה לזה של תאים שליטה ללא טיפול.
בנוסף, למרות את הנתונים שימשו משערים היעד גנים הקשורים בטיפול ההתנגדות ביטוי גנים, רמת ביטוי שונה לא תמיד משקפות פונקצית החלבון לא תקין או לתאם עם פנוטיפ התנגדות. בשל המורכבות של מערכת היחסים בין הביטוי של הגן עמידים לתרופות בשם ההתנגדות לטיפול ממוקד, בהמשך המולקולרי חקירות נדרשים, כגון ניתוח ביואינפורמטיקה, כולל גנים/חלבון אינטראקציה תהליך ביולוגי העשרה, מידול מולקולרית.
עוד נקודה קריטית יכול להיות יחודיות הדיוק של siRNA oligonucleotide כדי להפחית את הביטוי היעד. פתרון אחד אפשרי יכול להיות שימוש בכלים עיצוב לבחירת siRNA פונקציונלי, ותערובת של siRNA עבור גן המטרה זהה.
לבסוף, מגבלה קטנה קשורה השיטה שבה נעשה שימוש כדי לשחזר את הרגישות לחומר המדכא טיפול ממוקד בשל משך הזמן חולף של תרביות תאים. דפיקה למטה מקסימלי של יעד ה-mRNA (> 85%) נמסר על תרביות תאים שלאחר יום 2, ונשתמרה > 80% דרך ימים 5-7. משמעותי דפיקה למטה, אם כי במידה פחותה בתוך נצפתה עדיין ביום 6. מסיבה זו, וזמינותו cytotoxicity עבור אימות של השיקום של סמים רגישות צריכה להתבצע בתוך כ- 5 ימים מג'ין להחרשת.
פרוטוקול שלנו הוא הזמן cost effective שיטה עבור חוקרים במבחנה רכשה ההתנגדות. הדור של subclones עמיד, שיקוף של הטרוגניות אינטרה-גידול של תאים סרטניים, יכול לעזור לחשוף את הרומן מנגנוני ההתנגדות רכשה סוכני ממוקד נגד סרטן. בפרט, הם מתאימים יותר עבור תפוקה גבוהה גנומית או הקרנות פרוטיאומיה מבנית לזיהוי שינויים מולקולריים בתאים עמידים מאשר מקביליהם רגיש.
פלטפורמה זו פרה אפשרות להאריך בקלות לחקור את מנגנוני ההתנגדות כללי סוכני טיפולית ממוקד ב histotypes גידול שונים, מתן תהליך סטנדרטי עבור גילוי נוסף סמים מטרות כדי להתגבר על עמידות לתרופות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות ד ר ורוניקה זאנוני לעריכת כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples |
| ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT | Bio-Rad | 1708891 | The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR. |
| TaqMan gene expression assay | Life Technologies | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end. |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells. |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard. |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample. |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 456-1094 | Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis. |
| Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards | Bio-Rad | 1610376 | Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD). |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | 10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE. |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 1704156 | Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane. |
| Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate | Bio-Rad | 1610381 | StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots. |
| Immun-Star WesternC solution | Bio-Rad | 5572 | Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein. |
| Universal Negative Control | Invitrogen | 12935300 | Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology. |
| opti-MEM Glutamax Medium | Thermo Fisher Scientific | 51985026 | Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology. |
| Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA | Ambion | 4390824 | RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types. |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778075 | Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types. |
| Mouse anti-IQGAP1 | Invitrigen | 33-8900 | working concentration: 1:400 in 5% milk solution |
| goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005 | Santa Cruz | sc-2005 | working concentration: 1:10000 in 5% milk solution |
| PMSF | Sigma Aldrich | P 7626 | this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase |
| Thermocycler for RT-PCR | MJ Research | MJ Research PTC-200 Thermal Cycler | it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers |
| Real Time RT-PCR instrument | Applied Biosystems | 7500 RT-PCR system | This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers |
| Microvolume Spectrophotometers | Thermo Scientific | Nanodrop | It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample |
| Blotting system | Bio-Rad | Trans-Blot Turbo system | It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes |
| Image acquisition system and gel documentation | Bio-Rad | Chemidoc image system | It is easy to use for chemiluminescent detection |
References
- Gerber, D. E. Targeted therapies: a new generation of cancer treatments. Am Fam Physician. 77 (3), 311-319 (2008).
- Zhang, J., Yang, P. L., Gray, N. S. Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nat Rev Cancer. 9 (1), 28-39 (2009).
- Nelson, A. L., Dhimolea, E., Reichert, J. M. Development trends for human monoclonal antibody therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 767-774 (2010).
- Chabner, B. A., Roberts, T. G. Timeline: Chemotherapy and the war on cancer. Nat Rev Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
- Gilbert, L. A., Hemann, M. T. Chemotherapeutic resistance: surviving stressful situations. Cancer Res. 71 (15), 5062-5066 (2011).
- Izar, B., Rotow, J., Gainor, J., Clark, J., Chabner, B. Pharmacokinetics, clinical indications, and resistance mechanisms in molecular targeted therapies in cancer. Pharmacol Rev. 65, 1351-1395 (2013).
- Ellis, L. M., Hicklin, D. J. Resistance to Targeted Therapies: Refining Anticancer Therapy in the Era of Molecular Oncology. Clin Cancer Res. 15 (24), 7471-7478 (2009).
- Asić, K. Dominant mechanisms of primary resistance differ from dominant mechanisms of secondary resistance to targeted therapies. Crit Rev Oncol Hematol. 97, 178-196 (2016).
- Arienti, C., et al. Preclinical evidence of multiple mechanisms underlying trastuzumab resistance in gastric cancer. Oncotarget. 7 (14), 18424-18439 (2016).
- Tanner, M., et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol. 16 (2), 273-278 (2005).
- Bang, Y. J., et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet. 376 (9742), 687-697 (2010).
- ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01130337. A Study of Capecitabine [Xeloda] in Combination With Trastuzumab [Herceptin] and Oxaliplatine in Patients With Resectable Gastric Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01130337 (2017).
- ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01748773. A Study of the Combination of Oxaliplatin, Capecitabine and Herceptin (Trastuzumab) and Chemoradiotherapy in The Adjuvant Setting in Operated Patients With HER2+ Gastric or Gastro-Esophageal Junction Cancer (TOXAG Study). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/show/NCT01748773 (2017).
- ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01472029. Explorative Phase II Study of Perioperative Treatment in Patients With Adenocarcinoma of the Gastroesophageal Junction or Stomach (HerFLOT). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029 (2017).
- ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01196390. Radiation Therapy, Paclitaxel, and Carboplatin With or Without Trastuzumab in Treating Patients With Esophageal Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01196390 (2017).
- Shimoyama, S. Unraveling trastuzumab and lapatinib inefficiency in gastric cancer: Future steps (Review). Mol Clin Oncol. 2 (2), 175-181 (2014).
- Kelly, C. M., Janjigian, Y. Y. The genomics and therapeutics of HER2-positive gastric cancer-from trastuzumab and beyond. J Gastrointest Oncol. 7 (5), 750-762 (2016).
- Wong, S. S., et al. Genomic landscape and genetic heterogeneity in gastric adenocarcinoma revealed by whole-genome sequencing. Nat Commun. 5, 5477 (2014).
- Oshima, Y., et al. Lapatinib sensitivities of two novel trastuzumab-resistant HER2 gene-amplified gastric cancer cell lines. Gastric Cancer. 17 (3), 450-462 (2014).
- Pignatta, S., et al. Prolonged exposure to (R)-bicalutamide generates a LNCaP subclone with alteration of mitochondrial genome. Mol Cell Endocrinol. 382 (1), 314-324 (2014).
