Summary

Buscando vías de controlador de adquirir resistencia a la terapia dirigida: sensibilidad restaurar por Gene Knock-down y generación Subclone resistente a los medicamentos

Published: December 11, 2017
doi:

Summary

Se trata de un protocolo de tiempo y costo efectiva en vitro investigando los mecanismos de resistencia adquirida a agentes terapéuticos dirigidos, que es una gran necesidad médica en el manejo del cáncer.

Abstract

Las últimas dos décadas han visto un cambio de fármacos citotóxicos a terapia dirigida en oncología médica. Aunque agentes terapéuticos dirigidos han demostrado eficacia clínica más impresionante y minimizado los efectos adversos de los tratamientos tradicionales, resistencia a las drogas se ha convertido en la principal limitación para sus beneficios. Han desarrollado varios modelos preclínicos/in vitro/in vivo de resistencia adquirida a agentes dirigidos en la práctica clínica principalmente mediante el uso de dos estrategias: i) genética manipulación para el modelado de genotipos de resistencia adquirida y ii) en vitro / vivo en selección de modelos resistentes. En el presente trabajo, proponemos un marco unificador para la investigación de los mecanismos subyacentes responsables de la resistencia adquirida a agentes terapéuticos dirigidos, a partir de la generación de subclones celulares resistente a los medicamentos a la descripción de procedimientos utilizados para restaurar la sensibilidad a los inhibidores de silenciamiento. Este tiempo y costo efectiva enfoque simple es ampliamente aplicable y podría ampliarse fácilmente para investigar mecanismos de resistencia a otras drogas terapéuticas específicas en diferentes tumor histotypes.

Introduction

Después de los cruciales descubrimientos en biología molecular y celular, se han desarrollado una serie de novela sintetizadas moléculas contra el cáncer para atacar selectivamente las vías de señalización oncogénicas en una amplia gama de tipos de tumores. En particular, compuestos de químicos sintéticos es decir, de dos categorías de agentes terapéuticos dirigidos con propiedades únicas en oncología, y anticuerpos monoclonales recombinantes, se sabe que han logrado éxitos clínicos y atención del cáncer dramáticamente alterada en las últimas décadas1,2,3.

Sin embargo, a pesar de su impresionante respuesta inicial al tratamiento, la mayoría de los pacientes con cáncer ha desarrollado resistencia a los medicamentos a todos los agentes terapéuticos específicos, anticuerpos monoclonales y los inhibidores de la cinasa. Como consecuencia, resistencia a las drogas, el gran obstáculo para medicamentos contra el cáncer clásico4, sigue siendo un gran desafío para nuevas terapias dirigidas5,6.

Resistencia a la terapia dirigida puede ser intrínseca (es decir, primario) o adquirido (es decir, secundaria). Resistencia intrínseca describe de nuevo la falta de respuesta a la terapia, mientras que resistencia secundaria se produce después de un período de respuesta a drogas tratamiento7. Esta última es causada por brotes de cohortes pequeñas de las células del tumor dentro de la mayor parte del tumor primitivo o ubicada en lugares anatómicos crípticos distales, exhibiendo hasta el 90% resistencia a uno o más dirigidos a agentes terapéuticos. Mecanismos moleculares que subyacen a un desarrollo de la resistencia a la terapia dirigida principalmente resultan de mutaciones en el gen blanco y redundante activación de otras vías de señalización de supervivencia Pro, cuya comprensión todavía está lejos de completo8.

En este trabajo, propone un enfoque de tiempo y costo efectiva para investigar en vitro los mecanismos de resistencia adquirida a agentes terapéuticos dirigidos, a partir de la generación de subclones celulares resistente a los medicamentos a la descripción de silenciamiento procedimientos utilizados para la restauración de la sensibilidad al inhibidor, una herramienta crucial para probar y validar las hipótesis de trabajo. En particular, nuestro acercamiento fue utilizado para investigar, en el cáncer gástrico, los mecanismos de resistencia al trastuzumab (por ejemplo, Herceptin), un anticuerpo monoclonal humanizado contra el dominio extracelular de HER2 proteína9. Trastuzumab + quimioterapia es ampliamente aceptado como el tratamiento estándar de primera línea para cáncer de mama metastásico HER2-positivo. Gracias a recientes estudios preclínicos demostrando anti-HER2 terapias tienen actividad significativa en ambos en vitro y en vivo positivo para HER2 cáncer de estómago modelos10,11, fármacos moleculares dirigidas a HER2 han sido examinado extensamente en ensayos clínicos, algunos de los cuales están todavía en curso, en pacientes con cáncer gastroesofágico12,13,14,15.

Estos estudios han hecho hincapié en el creciente número de pacientes que experimentan resistencia a trastuzumab16, similar a lo observado por otros inhibidores de la terapéuticas específicas. En particular, la tasa de respuesta de trastuzumab fue de 47% y la mediana de supervivencia global para pacientes con trastuzumab + quimioterapia fue superior para los pacientes en quimioterapia solo17sólo 2,7 meses. Esto sugiere que mientras que la resistencia al trastuzumab primaria predomina, la resistencia al trastuzumab secundaria es inevitable. Por esta razón, hay necesidad urgente de aclarar los mecanismos que causan la resistencia de la terapia dirigida HER2 en cáncer gástrico, que es aún más problemático dada la heterogeneidad genética intra tumoral de esta neoplasia18.

Además, mecanismos de resistencia al trastuzumab en el cáncer gástrico han probado difíciles de explicar, parcialmente debido a la dificultad en la obtención de representante de modelos preclínicos confiable de esta condición. Oshima et al reportó un método de selección en vivo de líneas celulares de cáncer gástrico trastuzumab-resistente, que consiste en una cultura repetida de una pequeña metástasis peritoneal residual después del tratamiento con trastuzumab19. Sin embargo, la necesidad de un recinto, de conocimientos específicos manejo de animales y de la aprobación del Comité de ética Animal contribuyó a lo que es un método de consumo de tiempo y costo. El enfoque se describe en este trabajo es simple y ampliamente aplicables y podría ampliarse fácilmente para investigar los mecanismos de resistencia a otras drogas terapéuticas en el tumor diferentes histotypes20.

Protocol

Nota: Este protocolo ha sido ajustada específicamente para el análisis de los mecanismos subyacentes de resistencia adquirida a trastuzumab de líneas de células de cáncer gástrico HER positivo. Todos los instrumentos de laboratorio necesitados son informados en la Tabla de materiales. 1. generación de Subclones resistentes a terapia específicas Nota: Este es el más crítico y difícil de estandarizar el paso en el protocolo debido a que difer…

Representative Results

Figura 1 describe el marco del procedimiento experimental. Tres cáncer gástrico-líneas celulares expresan un alto nivel de HER2 y sensible al trastuzumab (IC50 < nivel del plasma del pico del gráfico izquierdo drogas, figura 2A,) fueron cultivadas en medio de cultivo que contiene el agente terapéutico específico. Una dosis 10 veces menor que la concentración máxima del plasma de trastuzumab (10 μg/mL) como dos…

Discussion

Personalizado y dirigido terapias han suscitado entusiasmo creciente, estas supuestas terapias ‘inteligentes’ enfrentan el mismo obstáculo importante como drogas de la quimioterapia tradicional, es decir, la adquisición rápida e impredecible de la farmacorresistencia. Para mejorar los resultados de la terapia dirigida, deben resolverse problemas de resistencia a los fármacos a través de una mejor comprensión de los mecanismos que las causan. Aquí, presentamos una metodología ampliamente accesible en …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a Dr. Verónica Zanoni por editar el manuscrito.

Materials

Trizol Reagent Invitrogen 15596026 TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT Bio-Rad 1708891 The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR.
TaqMan gene expression assay Life Technologies 4331182 Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent Thermo Scientific 78501 Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Scientific 78440 Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard.
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample.
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 456-1094 Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards Bio-Rad 1610376 Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS Bio-Rad 1610732 10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs Bio-Rad 1704156 Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane.
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate Bio-Rad 1610381 StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots.
Immun-Star WesternC solution Bio-Rad 5572 Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein.
Universal Negative Control Invitrogen 12935300 Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology.
opti-MEM Glutamax Medium Thermo Fisher Scientific 51985026 Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology.
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA Ambion 4390824 RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent Invitrogen 13778075 Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types.
Mouse anti-IQGAP1 Invitrigen 33-8900 working concentration: 1:400 in 5% milk solution
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005 Santa Cruz sc-2005 working concentration: 1:10000 in 5% milk solution
PMSF Sigma Aldrich P 7626 this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase
Thermocycler for RT-PCR MJ Research MJ Research PTC-200 Thermal Cycler it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Real Time RT-PCR instrument Applied Biosystems 7500 RT-PCR system This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Microvolume Spectrophotometers Thermo Scientific Nanodrop It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample
Blotting system Bio-Rad Trans-Blot Turbo system It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes
Image acquisition system and gel documentation Bio-Rad Chemidoc image system It is easy to use for chemiluminescent detection

References

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Cite This Article
Arienti, C., Pignatta, S., Zanoni, M., Cortesi, M., Zamagni, A., Piccinini, F., Tesei, A. Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down. J. Vis. Exp. (130), e56583, doi:10.3791/56583 (2017).

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