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Cancer Research

लक्षित थेरेपी के लिए अधिग्रहीत प्रतिरोध के चालक रास्ते के लिए खोज: दवा प्रतिरोधी उपक्लोन पीढ़ी और संवेदनशीलता जीन दस्तक नीचे से बहाल

Published: December 11, 2017 doi: 10.3791/56583
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS

Summary

यह एक समय है और लागत प्रभावी इन विट्रो प्रोटोकॉल लक्षित चिकित्सकीय एजेंटों, जो कैंसर प्रबंधन में एक उच्च unmet चिकित्सा की जरूरत है के लिए अधिग्रहण प्रतिरोध के तंत्र की जांच ।

Abstract

पिछले दो दशकों चिकित्सा ऑन्कोलॉजी में लक्षित चिकित्सा के लिए साइटोटोक्सिक दवाओं से एक बदलाव देखा है. हालांकि लक्षित चिकित्सकीय एजेंटों और अधिक प्रभावशाली नैदानिक प्रभावकारिता दिखाया गया है और पारंपरिक उपचार से कम प्रतिकूल प्रभाव, दवा प्रतिरोध उनके लाभ के लिए मुख्य सीमा बन गया है । कई इन विट्रो में/ नैदानिक अभ्यास में लक्षित एजेंटों को अधिग्रहण प्रतिरोध के मॉडल में मुख्य रूप से दो रणनीतियों का उपयोग करके विकसित किया गया है: i) अधिग्रहण प्रतिरोध के पादी मॉडलिंग के लिए आनुवंशिक हेरफेर, और द्वितीय) इन विट्रो/ प्रतिरोधी मॉडल के चयन में वीवो । वर्तमान काम में, हम एक एकीकृत ढांचे का प्रस्ताव है, लक्षित चिकित्सीय एजेंटों के लिए अधिग्रहण प्रतिरोध के लिए जिंमेदार अंतर्निहित तंत्र की जांच के लिए, दवा प्रतिरोधी सेलुलर उपक्लोनों के विवरण के लिए पीढ़ी से शुरू मुंह बंद करने प्रक्रियाओं अवरोधक करने के लिए संवेदनशीलता बहाल करने के लिए इस्तेमाल किया. यह सरल समय और लागत प्रभावी दृष्टिकोण व्यापक रूप से लागू है, और आसानी से विभिन्न ट्यूमर histotypes में अन्य लक्षित चिकित्सकीय दवाओं के लिए प्रतिरोध तंत्र की जांच करने के लिए बढ़ाया जा सकता है ।

Introduction

आणविक और सेलुलर जीव विज्ञान, उपंयास संश्लेषित विरोधी अणुओं के एक नंबर में महत्वपूर्ण खोजों पर निंनलिखित चुनिंदा ट्यूमर प्रकार की एक व्यापक सरणी में रास्ते संकेत oncogenic लक्ष्य को विकसित किया गया है । विशेष रूप से, कैंसर विज्ञान, अर्थात् सिंथेटिक रासायनिक यौगिकों और रिकॉमबिनेंट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी में अद्वितीय गुणों के साथ लक्षित चिकित्सकीय एजेंटों की दो श्रेणियों, नैदानिक सफलताओं को प्राप्त किया है और नाटकीय रूप हाल के दशकों1,2,3।

फिर भी, उपचार के लिए अपने प्रभावशाली प्रारंभिक प्रतिक्रिया के बावजूद, कैंसर रोगियों के बहुमत सभी लक्षित चिकित्सकीय एजेंटों, दोनों मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और कळेनासे अवरोधकों के लिए दवा प्रतिरोध विकसित किया है । एक परिणाम के रूप में, दवा प्रतिरोध, क्लासिक विरोधी कैंसर दवाओं के लिए प्रमुख बाधा4, अभी भी उभरते लक्षित चिकित्सा के लिए एक बड़ी चुनौती है5,6।

लक्षित थेरेपी के लिए प्रतिरोध आंतरिक (यानी, प्राथमिक) या (यानी, माध्यमिक) का अधिग्रहण किया जा सकता है । आंतरिक प्रतिरोध चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया के एक de नोवो कमी का वर्णन है, जबकि माध्यमिक प्रतिरोध दवा उपचार7की प्रतिक्रिया की अवधि के बाद होता है । बाद ट्यूमर कोशिकाओं के छोटे साथियों के आदिम ट्यूमर के थोक के भीतर या बाहर की गुप्त संरचनात्मक niches में बसे के प्रकोप के कारण होता है, एक या एक से अधिक लक्षित चिकित्सकीय एजेंटों के लिए ९०% प्रतिरोध करने के लिए प्रदर्शन । आणविक लक्षित चिकित्सा के लिए एक प्रतिरोध विकास अंतर्निहित तंत्र मुख्य रूप से लक्ष्य जीन उत्परिवर्तनों और अन्य समर्थक के निरर्थक सक्रियण से परिणाम अस्तित्व संकेतन रास्ते, जिनकी समझ अभी भी पूरा8से दूर है ।

इस काम में, हम एक समय का प्रस्ताव है और लागत प्रभावी दृष्टिकोण को लक्षित चिकित्सीय एजेंटों के लिए अधिग्रहण प्रतिरोध के विट्रो तंत्र में जांच, मुंह बंद करने के विवरण के लिए दवा प्रतिरोधी सेलुलर उपक्लोनों की पीढ़ी से शुरू अवरोध करनेवाला संवेदनशीलता बहाल करने के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं, एक महत्वपूर्ण उपकरण के परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया और काम कर रहे परिकल्पनाओं मान्य. विशेष रूप से, हमारे दृष्टिकोण की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, गैस्ट्रिक कैंसर में, trastuzumab के लिए प्रतिरोध तंत्र (जैसे, Herceptin), एक मानवतावादी मोनोक्लोनल extracellular प्रोटीन के HER2 डोमेन लक्ष्यीकरण एंटीबॉडी9. Trastuzumab + कीमोथेरेपी व्यापक रूप से HER2 पॉजिटिव मेटास्टेटिक स्तन कैंसर के लिए मानक प्रथम पंक्ति उपचार के रूप में स्वीकार कर लिया है । हाल ही में नैदानिक दिखा रहा है कि विरोधी HER2 उपचार दोनों विट्रो में और vivo में HER2-सकारात्मक गैस्ट्रिक कैंसर मॉडल10,11, आणविक ड्रग्स लक्ष्यीकरण HER2 में महत्वपूर्ण गतिविधि है अध्ययन करने के लिए धंयवाद बड़े पैमाने पर नैदानिक परीक्षणों में जांच की, जिनमें से कुछ अभी भी चल रहे हैं, एसिडिटी कैंसर12,13,14,15के साथ रोगियों पर ।

इन अध्ययनों से trastuzumab के लिए प्रतिरोध का सामना कर रहे रोगियों की बढ़ती संख्या पर बल दिया है16, अन्य लक्षित चिकित्सीय अवरोधकों के लिए क्या मनाया जाता है इसी तरह. विशेष रूप से, trastuzumab की प्रतिक्रिया की दर ४७% थी, और trastuzumab पर रोगियों के लिए औसत समग्र अस्तित्व + कीमोथेरेपी केवल २.७ महीने अब कीमोथेरेपी अकेले पर रोगियों के लिए17से अधिक था । यह सुझाव दिया है कि जब प्राथमिक trastuzumab प्रतिरोध प्रचलित है, माध्यमिक trastuzumab प्रतिरोध अपरिहार्य है । इस कारण से, वहां तत्काल HER2 के कारण तंत्र को स्पष्ट करने की जरूरत है गैस्ट्रिक कैंसर में चिकित्सा प्रतिरोध लक्षित है, जो और भी अधिक समस्याग्रस्त इस neoplasia18के अंतर ट्यूमर आनुवंशिक विविधता दिया है ।

इसके अलावा, गैस्ट्रिक कैंसर में trastuzumab प्रतिरोध के तंत्र को समझाने के लिए चुनौतीपूर्ण साबित किया है, आंशिक रूप से इस हालत के विश्वसनीय नैदानिक मॉडल प्रतिनिधि प्राप्त करने में कठिनाई के कारण. ओशिमा एट अल. trastuzumab के साथ उपचार के बाद एक छोटे अवशिष्ट पेरिटोनियल मेटास्टेसिस की एक दोहराया संस्कृति से मिलकर, trastuzumab प्रतिरोधी गैस्ट्रिक कैंसर सेल लाइनों की vivo चयन विधि में एक की सूचना दी । हालांकि, एक बाड़े की जरूरत है, विशिष्ट पशु हैंडलिंग विशेषज्ञता का, और पशु नैतिकता समिति के अनुमोदन के लिए यह एक समय और लागत लेने वाली विधि बनाने के लिए योगदान दिया । दृष्टिकोण हम इस काम में वर्णन सरल और व्यापक रूप से लागू है, और आसानी से अलग ट्यूमर में अंय चिकित्सीय दवाओं के लिए प्रतिरोध तंत्र की जांच करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है histotypes20।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से उसके सकारात्मक गैस्ट्रिक कैंसर सेल लाइनों के trastuzumab के लिए प्रतिरोध का अधिग्रहण अंतर्निहित तंत्र के विश्लेषण के लिए समायोजित किया गया है । सभी प्रयोगशाला उपकरणों की जरूरत सामग्री की तालिकामें सूचित कर रहे हैं ।

1. लक्षित थेरेपी प्रतिरोधी उपक्लोनों की जनरेशन

नोट: यह सबसे महत्वपूर्ण है और इस तथ्य के कारण प्रोटोकॉल में कदम मानकीकरण करने के लिए मुश्किल है कि अलग सेल लाइनों अपने ट्यूमर histotype या दवा एकाग्रता से स्वतंत्र रूप से लक्षित चिकित्सीय अवरोधक के लिए अलग संवेदनशीलता प्रदर्शन कर सकते हैं इस्तेमाल.

  1. संस्कृति NCI-N87 RPMI माध्यम में सेल लाइन भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक (10%) और glutamine (2 मिमी, 1%), ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक monolayer के रूप में, और यह बीज पर 25 सेमी2 संस्कृति कुप्पी ।
  2. प्रारंभिक खुराक के रूप में trastuzumab के प्रत्येक कुप्पी 10 µ g/एमएल में संस्कृति माध्यम में जोड़ें । शुरू खुराक के लिए कोशिकाओं को बेनकाब जब तक वे फिर से शुरू बढ़ रही है ।
    नोट: लक्षित थेरेपी अवरोधक की शुरुआत खुराक 10 गुना अपने प्लाज्मा पीक एकाग्रता की तुलना में कम होना चाहिए. प्लाज्मा पीक एकाग्रता रोगी रक्त में पाया दवा एकाग्रता के उच्चतम स्तर आमतौर पर मानक चिकित्सा के कई खुराक निम्नलिखित है । यह मान फार्माकोकाइनेटिक्स पर अध्ययनों से प्राप्त किया जा सकता है ।
  3. trypan नीले अपवर्जन विधि के साथ सेल विकास की निगरानी; जब सेल विकास (आमतौर पर दो से तीन सप्ताह की अवधि के बाद) फिर से शुरू है, एक 10 गुना उच्च खुराक एकाग्रता trastuzumab के लिए कोशिकाओं को बेनकाब ।
  4. कोशिकाओं को बेनकाब धीरे trastuzumab की खुराक में वृद्धि (से १०० µ जी/एमएल करने के लिए ४०० µ g/एमएल) जब तक कोशिकाओं (के बारे में 2 सप्ताह के बाद) एक उच्च दवा एकाग्रता की उपस्थिति के बावजूद बढ़ रखने के लिए (कम से २.५-4-गुना उच्च प्लाज्मा पीक से) ।
  5. एक clonogenic परख प्रदर्शन संस्कृति माध्यम में लक्ष्य चिकित्सा अवरोधक की एकाग्रता में हर परिवर्तन पर लक्षित थेरेपी के लिए प्रतिरोध के स्तर का मूल्यांकन, और सापेक्ष प्रतिरोध आईसी५० सूचकांक (आरआर आईसी५०) को परिभाषित निंनानुसार ।
    1. बीज ५०० 24 बहु में अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों कोशिकाओं ।
      नोट: प्रत्येक शर्त सेट के लिए 5 कुओं को तैयार किया जाना चाहिए ।
    2. लक्ष्य चिकित्सा अवरोधक (trastuzumab) सांद्रता १०० µ g/ml से ४०० µ g/ml तक बढ़ाने के लिए कक्षों को अरक्षित करें ।
    3. 15 दिनों के लिए ३७ ° c में एक सह2 मशीन में कोशिकाओं की मशीन ।
    4. मशीन के बाद, ठीक है और दाग नमूने के रूप में इस प्रकार है ।
      1. 10 मिलीलीटर 1x पंजाबियों के साथ मध्यम और कुल्ला कोशिकाओं को हटा दें । 1x पंजाबियों निकालें और निर्धारण समाधान (एसिटिक एसिड: मेथनॉल, 1:7, (vol/vol)) के 2-3 मिलीलीटर जोड़ें । निर्धारण समाधान निकालें और ०.५% क्रिस्टल वायलेट समाधान जोड़ें । 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मशीन
      2. एक पिपेट के साथ aspirating द्वारा ध्यान से क्रिस्टल वायलेट समाधान निकालें और नल के पानी में प्लेटें विसर्जित करने के लिए किसी भी क्रिस्टल वायलेट समाधान अवशेषों कुल्ला । एयर-2 दिनों तक के लिए कमरे के तापमान पर सूखी ।
    5. एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर ५० से अधिक कोशिकाओं की कालोनियों गिनती (4x बढ़ाई).
      नोट: इसके लिए दो स्वतंत्र प्रेक्षकों की जरूरत है ।
    6. की गणना आरआर आईसी५० के बीच अनुपात के रूप में लक्ष्य-थेरेपी प्रतिरोधी उपक्लोन कोशिकाओं के आईसी५० मूल्य और मूल/भोली कोशिकाओं का मूल्य ।

2. उंमीदवार के लिए मांयता प्रोटोकॉल लक्षित थेरेपी प्रतिरोध जीन (आर जीन)

नोट: जीन अभिव्यक्ति के लक्षण वर्णन के बाद, लक्ष्य थेरेपी और प्रतिरोध के चालक के रूप में किसी भी उंमीदवार जीन के लिए अधिग्रहण प्रतिरोध के साथ जुड़े हस्ताक्षर के माध्यम से जांच की जाएगी: एक) आर टी-पीसीआर, और ख) पश्चिमी ब्लाट विश्लेषण ।

  1. रीयल-टाइम RT-पीसीआर
    1. एसिड guanidinium thiocyanate-phenol-क्लोरोफॉर्म मिश्रण का उपयोग कर सेल लाइनों से कुल आरएनए निकालें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    2. प्रदर्शन रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी) यादृच्छिक hexamer प्राइमरों का उपयोग प्रतिक्रियाओं और इस प्रकार के रूप में थर्मल साइकिल चालक सेट: 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर भड़काना, ४६ ° c पर 20 मिनट के लिए आर टी, और 1 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर आरटी निष्क्रियण ।
    3. एक 20 µ एल प्रतिक्रिया के लिए कुल आरएनए के ४०० एनजी का प्रयोग करें । नमूना के लिए रिएक्शन मिक्सचर निम्नानुसार तैयार करें: 7 µ l RNase नि H2O, 2 µ एल सीडीएनए (10 एनजी/µ एल), 1 µ एल 20x फ्लोरोसेंट-लक्ष्य विशेष जांच लेबल, और 10 µ एल 2x मिश्रण बफर, dNTPs युक्त, और डीएनए पोलीमरेज़ ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    4. एक अच्छी तरह से प्लेट के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण के 20 µ एल जोड़ें और निंनलिखित कार्यक्रम चलाने: 2 मिनट के लिए ५० ° c पर चरण होल्डिंग 10 मिनट (1 चक्र) के लिए ९५ ° c पर; फिर 15 एस के लिए ९५ ° c पर ४० चक्र और 1 मिनट के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर ।
  2. पश्चिमी ब्लाटर
    1. ०.०५% trypsin/EDTA समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़कर सेल निलंबन की वसूली और trypsin काम करने के लिए 2-3 मिनट की अनुमति ।
    2. trypsin बेअसर करने के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त मध्यम के 2 खंड जोड़ें (उदा., trypsin के प्रत्येक 1 मिलीलीटर के लिए मध्यम के 2 मिलीलीटर) और 5 मिनट के लिए १,२०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें और कोल्ड 1x पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धोएं ।
    3. 5 मिनट के लिए १,२०० x g पर केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । lysis बफर के साथ सेल गोली reसस्पेंड और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक झूली कुरसी पर गर्मी ।
      1. lysis बफ़र की मात्रा कक्षों की संख्या पर निर्भर करताहै (उदा., १०० µ l 1 x 106 कक्षों के लिए); ताजा lysis बफर हर बार तैयार करने के लिए सुनिश्चित करें । 1 मिलीलीटर के लिए lysis बफर तैयारी (बर्फ पर छोड़ दें): उपयोग ९७५ µ l M-प्रति स्तनधारी lysate बफर, 15 µ l को छेड़ो और फॉस्फेट अवरोधकों, और 10 µ l १०० µ मीटर PMSF अवरोधकों.
    4. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १३,००० x g पर सेल lysate केंद्रापसारक द्वारा supernatant प्रोटीन की वसूली ।
    5. एक बीसीए प्रोटीन परख का उपयोग करके प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करें ।
    6. प्रोटीन के नमूनों के लिए 4x LaemmLi नमूना बफर जोड़ें (प्रोटीन के कम से 20-30 µ ग्राम) और गर्मी १०० डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए ।
    7. कास्ट 4-20% जैल का उपयोग करें और नमूना प्रति प्रोटीन मानक के LaemmLi प्रोटीन समाधान और 5-10 µ एल के 20-30 µ जी लोड ।
    8. TRIS के साथ पश्चिमी दाग अंगूठी भरें/GLICYNE/SDS 1x बफर और चलाने के लिए ११० V पर जेल 30-60 मिनट के लिए (जब समय बंद हो जाता है कि डाई जेल के अंत तक पहुंच गया है की जांच करें, अंयथा कुछ अतिरिक्त मिनट के लिए चला)
    9. Electroblot एक अर्द्ध शुष्क प्रणाली का उपयोग करके एक PVDF झिल्ली में प्रोटीन हस्तांतरण ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    10. उपयुक्त प्रोटीन समाधान में भिगोने से झिल्ली ब्लॉक (दूध/BSA 5%) 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर शेखर पर ।
    11. एक 5% दूध समाधान में एंटी-IQGAP1 प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ एक 1:400 समाधान करें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    12. एक शेखर पर एक ठंडे कमरे में रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में झिल्ली प्लेस ।
    13. अगले दिन, एंटीबॉडी समाधान छोड़ें और T-टीबीएस 1x समाधान में लेना (1x t-टीबीएस: 1x Tris खारा बफर Tween20 ०.१%) द्वारा एक शेखर पर कमरे के तापमान पर 7 मिनट के लिए जोड़ा ।
    14. छोड़ें T-टीबीएस 1x समाधान और बदलें । दोहराएं 3 बार ।
    15. मानक पश्चिमी दाग का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी जोड़कर एक 1:10000 द्वितीयक माउस-एंटीबॉडी समाधान करें ( सामग्री की तालिकादेखें) और झिल्ली को एक शेखर पर रखें; 2 एच के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें ।
    16. एंटीबॉडी समाधान त्यागें और 7 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक शेखर पर टी-टीबीएस 1x समाधान में लेना ।
    17. छोड़ें T-टीबीएस 1x समाधान और बदलें । दोहराएं 3 बार ।
    18. एक chemiluminescent समाधान में 5 मिनट के लिए झिल्ली सोख, और एक chemiluminescence imager पर झिल्ली छवि ।

3. उंमीदवार आर-जीन दस्तक नीचे से लक्ष्य-चिकित्सा अवरोधक संवेदनशीलता बहाल

  1. सेल की तैयारी
    1. trypsinization द्वारा सिंगल सेल सस्पेंशन तैयार करें । जिस दिन कोशिकाओं को चढ़ाया जाता है उस पर अभिकर्मक परफॉर्म करें ।
      1. पंजाब के साथ NCI-N87 कोशिकाओं को धो लें और ०.०५% trypsin/5-10 मिनट के लिए EDTA समाधान के साथ ३७ ° c में मशीन । RPMI(उदा, trypsin के प्रत्येक 1 मिलीलीटर के लिए मध्यम के 2 मिलीलीटर) को बेअसर करने के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त के 2 खंड जोड़ें ।
      2. trypan नीले दाग का उपयोग कर एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं की गणना । बीज २.५ x 105 कोशिकाओं (६०% संगम) प्रत्येक शर्त के लिए एक T25 सेमी2 कुप्पी पर ।
        नोट: सीडिंग के लिए कक्षों की उचित संख्या कक्ष रेखा के दोहरीकरण समय और प्रयोग की अवधि द्वारा निर्धारित की जाती है. उद्देश्य प्रयोग की पूरी अवधि के लिए लक्ष्य जीन दस्तक-नीचे प्राप्त करने के लिए है । नौ T25 सेमी2 कुप्पी अभिकर्मक स्थितियों और clonogenic परख (नियंत्रण के लिए 3 कुप्पी, नकारात्मक अभिकर्मक नियंत्रण के लिए 3 कुप्पी, जीन-लक्ष्य अभिकर्मक के लिए 3 कुप्पी) के लिए आदर्श होते हैं ।
  2. रिवर्स अभिकर्मक
    1. इस प्रकार के रूप में प्रत्येक T25 सेमी2 कुप्पी के लिए जीन लक्ष्य और नकारात्मक नियंत्रण अभिकर्मक मिश्रण तैयार करें ।
      1. प्रत्येक जीन लक्ष्यीकरण के १२.५ µ एल सिरना oligonucleotides या नकारात्मक नियंत्रण सिरना oligonucleotides ंयूनतम आवश्यक अभिकर्मक माध्यम में (अनुपात 1:55; सामग्री की तालिकादेखें) ।
      2. एक cationic liposome अभिकर्मक रिएजेंट (जीन-लक्ष्यीकरण सिरना oligonucleotides के साथ 1:1 अनुपात जोड़ें; सामग्री की तालिकादेखें) । 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
        नोट: अभिकर्मक मिश्रण का कुल वॉल्यूम ७०० µ l है ।
      3. प्रत्येक T25 सेमी2 कुप्पी को अभिकर्मक मिश्रण के ७०० µ l जोड़ें । 1-3 दिनों के लिए ३७ ° c पर कोशिकाओं की मशीन ।
    2. आर टी-पीसीआर और पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा जीन दस्तक नीचे की पुष्टि करें । डबल ख्यात आर के प्रभाव की जांच-जीन दस्तक नीचे कालोनी गठन प्रयोगों के माध्यम से लक्षित चिकित्सकीय एजेंट को संवेदनशीलता बहाली पर (दोहराएं १.५ कदम) ।

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Representative Results

चित्रा 1 प्रयोगात्मक प्रक्रिया के ढांचे की रूपरेखा । तीन गैस्ट्रिक कैंसर कोशिका-लाइनों HER2 और trastuzumab के प्रति संवेदनशील के एक उच्च स्तर व्यक्त (आईसी५० < पीक प्लाज्मा स्तर की दवा, चित्रा 2a, वाम ग्राफ) संस्कृति मध्यम लक्षित चिकित्सीय एजेंट से युक्त में उगाया गया । एक खुराक 10-trastuzumab की चोटी प्लाज्मा एकाग्रता की तुलना में कम गुना (10 µ g/एमएल) प्रारंभिक खुराक के रूप में स्थापित किया गया था, और 8-12 महीने की अवधि में ४०० µ g/mL की वृद्धि हुई । बाद में, हम तीन उपक्लोनों आईसी५० मूल्यों trastuzumab के शिखर प्लाज्मा स्तर (चित्रा 2a, सही ग्राफ) से कम के साथ एक स्थिर प्रतिरोध phenotype द्वारा लक्षण प्राप्त की । विशेष रूप से, सबसे प्रतिरोधी उपक्लोन, एचआर NCI N87, २८.५७ (चित्रा बी) के एक आरआर आईसी५० मूल्य तक पहुंच गया । IQGAP1 मानव संसाधन NCI N87 उप लाइन के प्रतिरोध phenotype में एक निर्णायक भूमिका निभाने के लिए प्रकट होता है । प्रोटीन और जीन के भाव का विश्लेषण इस परिकल्पना का समर्थन किया: प्रतिरोधी उपक्लोन में IQGAP1 प्रोटीन स्तर के बारे में माता-पिता की कोशिकाओं की तुलना में 5 गुना अधिक है । इसी तरह, संवाददाता IQGAP1 जीन अभिव्यक्ति है २.५-NCI N87 लाइन (चित्रा 3) में से मानव संसाधन NCI N87 उप लाइन में उच्च गुना ।

IQGAP1 जीन मुंह बंद करने trastuzumab प्रतिरोधी phenotype के विकास में अपनी भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था । IQGAP1 जीन अभिव्यक्ति मौन के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल विशेष रूप से साबित प्रभावोत्पादक लगभग सभी एक T25 सेमी2 सेल संस्कृति कुप्पी (के बारे में २.५ x 105 कोशिकाओं) (चित्रा 3) में हो कोशिकाओं के सभी पर IQGAP1 प्रोटीन सामग्री दस्तक ।

इसके अलावा, clonogenic परख काम परिकल्पना की पुष्टि की है, दिखा रहा है कि IQGAP1 जीन मुंह बंद करने trastuzumab NCI N87 कोशिकाओं को आईसी 7 µ जी/एमएल (चित्र 3) के लिए कम के रूप में सबूत के रूप में संवेदनशीलता को पुनर्स्थापित करता है ।

Figure 1
1 चित्रा: इन विट्रो के लिए फ्रेमवर्क अंतर्निहित तंत्र के विश्लेषण लक्षित चिकित्सा प्रतिरोध का अधिग्रहण किया । तीन अलग अलग trastuzumab-संवेदनशील कैंसर सेल लाइनों से व्युत्पंन विभिंन trastuzumab प्रतिरोधी उपक्लोन उत्पंन किया गया और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, immunohistochemical द्वारा HER2 संकेत तंत्र में परिवर्तन के लिए विशेषता है, वेस्टर्न ब्लाट, और आरटी-पीसीआर तकनीक । सभी उपक्लोनों ने एक अलग प्रतिरोधक तंत्र दिखाया । लक्षित थेरेपी संवेदनशीलता एक विशिष्ट उपक्लोन में बहाल किया गया था जब उंमीदवार प्रतिरोध की जीन ड्राइवर खामोश था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: सापेक्ष प्रतिरोध का निर्धारण आईसी५० सूचकांक (आरआर आईसी५०) गैस्ट्रिक कैंसर सेल लाइनों में clonogenic परख के माध्यम से । (एक) भोली (वाम ग्राफ) और प्रतिरोधी (सही ग्राफ) सेल लाइनों कॉलोनी बनाने के प्रयोगों के द्वारा उत्पंन के लिए विकास घटता डेटा । x-अक्ष trastuzumab एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन (SD) का प्रतिनिधित्व करती हैं । मानक विचलन 5% से अधिक कभी नहीं । (ख) clonogenic परख के प्रतिनिधि छवियां एक NCI-N87 प्रतिरोधी उपक्लोन की पीढ़ी का समर्थन । के रूप में समय रेखा से दिखाया, मानव संसाधन trastuzumab NCI N87 कोशिकाओं की पीढ़ी के लक्षित एजेंट को निरंतर जोखिम के 12 महीने की आवश्यकता है । यह आंकड़ा Arienti एट अल के काम से अनुकूलित है । 9 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: IQGAP1 जीन दस्तक नीचे से trastuzumab संवेदनशीलता बहाल । (क) IQGAP1 प्रोटीन सामग्री, densitometric विश्लेषण द्वारा बार ग्राफ में दिखाया गया है, पैतृक NCI N87 लाइन में, और इसके प्रतिरोधी और मौन में प्रतिरोधी उपक्लोन (बाएं ग्राफ) । आरटी-पीसीआर तकनीक (right ग्राफ) द्वारा सभी तीनों सेल-लाइनों में mRNA IQGAP1 एक्सप्रेशन लेवल का भी सत्यापन किया गया । डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत किया गया । (ख) Clonogenic परख माता पिता का NCI N87 लाइन के विभिंन संवेदनशीलता दिखाया और इसके प्रतिरोधी और खामोश-१०० µ जी/एमएल trastuzumab को प्रतिरोधी उपक्लोन में । कॉलोनी को सेल सीड के 14 दिन बाद गिना गया । थंबनेल आंकड़े प्रतिनिधि कॉलोनी संस्कृतियों दिखाते हैं । यह आंकड़ा Arienti एट अल के काम से अनुकूलित है । 9 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चरणों प्रोटोकॉल T25 cm2
बीज कोशिकाओं ६०% धाराप्रवाह अनुयाई कक्ष १.७५ एक्स 103
पतला सिरना oligonucleotides में न्यूनतम आवश्यक अभिकर्मक मध्यम (अनुपात 1:55) सिरना १२.५ µ l
अभिकर्मक माध्यम ६८७.५ µ l
Lipofectamine अभिकर्मक रिएजेंट जोड़ें Lipofectamine रिएजेंट १२.५ µ l
सेते 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन
कक्षों में मिश्रण जोड़ना 1-3 d के लिए ३७ ° c पर कोशिकाओं की मशीन

तालिका 1: अनुशंसित एजेंट मात्रा और वॉल्यूम के लिए उंमीदवार प्रतिरोध जीन दस्तक-डाउन ।

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Discussion

जबकि व्यक्तिगत और लक्षित चिकित्सा उत्साह बढ़ रही है, इन तथाकथित ' स्मार्ट ' चिकित्सा पारंपरिक कीमोथेरेपी दवाओं के रूप में ही बड़ी बाधा का सामना, यानी, दवा प्रतिरोध के तेजी से और अप्रत्याशित अधिग्रहण । लक्षित चिकित्सा के परिणामों में सुधार करने के लिए, दवा प्रतिरोधक समस्याओं का एक बेहतर समझ के माध्यम से हल किया जाना चाहिए कि उनके कारण तंत्र. यहां, हम इन विट्रो पद्धति में एक व्यापक रूप से सुलभ प्रस्तुत कैंसर सेल लाइन मॉडल में लक्षित चिकित्सा दवाओं के लिए अधिग्रहण प्रतिरोध के तंत्र की जांच ।

लक्षित चिकित्सा प्रतिरोधी उपक्लोनों की पीढ़ी के सबसे महत्वपूर्ण है और इस प्रोटोकॉल में कदम मानकीकरण मुश्किल है, के कारण सेल लाइनों के बीच आंतरिक आनुवंशिक विविधता के लिए इस्तेमाल किया, और दवा संवेदनशीलता के अपने विभिंन डिग्री के लिए । इन कारणों के लिए, प्रतिरोधी उपक्लोनों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय भिंन हो सकते हैं । विरोधी आणविक एजेंटों के लिए पुरानी जोखिम आम तौर पर एक मजबूत ट्यूमर विकास अवरोध का कारण बनता है । हालांकि, लगातार दवा जोखिम (8-12 महीने) की एक चर अवधि के बाद, कोशिकाओं अनुपचारित नियंत्रण कोशिकाओं के समान एक दर के साथ विकास फिर से शुरू ।

इसके अलावा, कि जीन अभिव्यक्ति डेटा परिकल्पना जीन से संबंधित लक्ष्य थेरेपी प्रतिरोध करने के लिए इस्तेमाल किया गया है के बावजूद, एक अलग अभिव्यक्ति स्तर हमेशा एक अनुचित प्रोटीन समारोह को प्रतिबिंबित नहीं करता है या प्रतिरोध phenotype के साथ सहसंबंधी बनाना । ख्यात दवा प्रतिरोधी जीन की अभिव्यक्ति और लक्षित चिकित्सा के लिए प्रतिरोध के बीच संबंधों की जटिलता के कारण, आगे आणविक जांच, जैसे bioinformatics विश्लेषण के रूप में की जरूरत है, जीन सहित/ संपर्क, जैविक प्रक्रिया संवर्धन, और आणविक मॉडलिंग ।

एक और महत्वपूर्ण बात विशिष्टता और सिरना oligonucleotide की सटीकता के लिए लक्ष्य अभिव्यक्ति को कम किया जा सकता है । एक संभव समाधान कार्यात्मक सिरना का चयन करने के लिए डिजाइन उपकरणों का उपयोग हो सकता है, और एक ही लक्ष्य जीन के लिए सिरना का मिश्रण ।

अंत में, एक छोटी सी सीमा अभिकर्मक के क्षणिक अवधि के कारण लक्षित चिकित्सा अवरोधक करने के लिए संवेदनशीलता को बहाल करने के लिए इस्तेमाल किया विधि से संबंधित है. लक्ष्य mRNA के अधिक से अधिक दस्तक-नीचे (> 85%) 2 दिन के बाद अभिकर्मक और बनाए रखा गया था > 80% दिनों 5-7 के माध्यम से । महत्वपूर्ण दस्तक नीचे, हालांकि हद तक कम है, अभी भी 6 दिन पर मनाया गया । इस कारण से, दवा संवेदनशीलता की बहाली की पुष्टि करने के लिए cytotoxicity परख जीन मुंह बंद करने से लगभग 5 दिनों के भीतर प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।

हमारे प्रोटोकॉल एक समय है और लागत के इन विट्रो में जांच के लिए प्रतिरोध प्राप्त करने के लिए प्रभावी तरीका है । प्रतिरोधी उपक्लोनों की पीढ़ी, कैंसर कोशिकाओं के अंतर ट्यूमर विविधता मिरर, विरोधी लक्षित एजेंटों के लिए अधिग्रहण प्रतिरोध के उपंयास तंत्र अनावरण में मदद कर सकता है । विशेष रूप से, वे अपने संवेदनशील समकक्षों की तुलना में प्रतिरोधी कोशिकाओं में आणविक परिवर्तन की पहचान के लिए उच्च प्रवाह जीनोमिक या proteomic की जांच के लिए और अधिक उपयुक्त हैं ।

इस नैदानिक मंच आसानी से विभिन्न ट्यूमर histotypes में लक्षित चिकित्सकीय एजेंटों के लिए सामान्य प्रतिरोध तंत्र की जांच करने के लिए बढ़ाया जा सकता है, दवा प्रतिरोध को दूर करने के लिए आगे दवा लक्ष्य की खोज के लिए एक मानक प्रक्रिया प्रदान.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक पांडुलिपि के संपादन के लिए डॉ वेरोनिका Zanoni शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trizol Reagent Invitrogen 15596026 TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT Bio-Rad 1708891 The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR.
TaqMan gene expression assay Life Technologies 4331182 Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent Thermo Scientific 78501 Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Scientific 78440 Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard.
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample.
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 456-1094 Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards Bio-Rad 1610376 Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS Bio-Rad 1610732 10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs Bio-Rad 1704156 Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane.
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate Bio-Rad 1610381 StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots.
Immun-Star WesternC solution Bio-Rad 5572 Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein.
Universal Negative Control Invitrogen 12935300 Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology.
opti-MEM Glutamax Medium Thermo Fisher Scientific 51985026 Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology.
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA Ambion 4390824 RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent Invitrogen 13778075 Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types.
Mouse anti-IQGAP1 Invitrigen 33-8900 working concentration: 1:400 in 5% milk solution
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005 Santa Cruz sc-2005 working concentration: 1:10000 in 5% milk solution
PMSF Sigma Aldrich P 7626 this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase
Thermocycler for RT-PCR MJ Research MJ Research PTC-200 Thermal Cycler it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Real Time RT-PCR instrument Applied Biosystems 7500 RT-PCR system This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Microvolume Spectrophotometers Thermo Scientific Nanodrop It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample
Blotting system Bio-Rad Trans-Blot Turbo system It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes
Image acquisition system and gel documentation Bio-Rad Chemidoc image system It is easy to use for chemiluminescent detection

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References

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लक्षित थेरेपी के लिए अधिग्रहीत प्रतिरोध के चालक रास्ते के लिए खोज: दवा प्रतिरोधी उपक्लोन पीढ़ी और संवेदनशीलता जीन दस्तक नीचे से बहाल
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Arienti, C., Pignatta, S., Zanoni,… More

Arienti, C., Pignatta, S., Zanoni, M., Cortesi, M., Zamagni, A., Piccinini, F., Tesei, A. Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down. J. Vis. Exp. (130), e56583, doi:10.3791/56583 (2017).

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