Summary
Dit is een tijd - en goedkoop cost-effective in vitro protocol van het onderzoek naar de mechanismen van verworven resistentie aan gerichte therapeutische agenten, dat is een zeer onvervulde medische noodzaak in kanker beheer.
Abstract
De afgelopen twee decennia hebben gezien een verschuiving van cytotoxische medicatie naar gerichte therapie in de medische oncologie. Hoewel gerichte therapeutische agenten hebben aangetoond indrukwekkender klinische werkzaamheid en geminimaliseerde bijwerkingen dan traditionele behandelingen, is resistentie de belangrijkste beperking op hun uitkeringen geworden. Verschillende preklinische/in vitro/in vivo modellen van verworven resistentie aan gerichte agentia in de klinische praktijk hebben ontwikkeld voornamelijk met behulp van twee strategieën: i) genetische manipulatie voor de modellering van genotypen van verworven resistentie, en ii) in vitro / in vivo selectie van resistente modellen. In het huidige werk stellen wij een verenigende raamwerk, voor het onderzoeken van de onderliggende mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de verworven resistentie aan gerichte therapeutische agenten, uitgaande van de generatie van resistente cellulaire subklonen naar de beschrijving van Silencing procedures gebruikt voor het herstellen van de gevoeligheid aan de Inhibitor van de omwenteling. Deze eenvoudige tijd en goedkoop cost-effective benadering is breed inzetbaar en kan gemakkelijk worden uitgebreid voor het onderzoek naar resistentie-mechanismen tot andere drugs gerichte therapeutische in verschillende tumor histotypes.
Introduction
In aansluiting op de cruciale ontdekkingen in de moleculaire en cellulaire biologie, zijn een aantal nieuwe gesynthetiseerde antikanker moleculen ontwikkeld om te selectief richten oncogene signaalroutes in een breed scala van soorten van de tumor. Met name twee categorieën van gerichte therapeutische agenten met unieke eigenschappen in oncologie, namelijk synthetische chemische verbindingen en recombinant monoclonal antilichamen, bekend is dat hebben bereikt klinische successen en drastisch veranderde kanker zorg in afgelopen decennia1,2,3.
Niettemin, ondanks hun indrukwekkende eerste reactie op behandeling, het merendeel van de patiënten met kanker hebben ontwikkeld resistentie aan alle gerichte therapeutische agenten, monoklonale antilichamen zowel kinase-remmers. Dientengevolge, is resistentie, de grote hindernis voor de klassieke anti-kanker medicijnen4, nog steeds een grote uitdaging voor opkomende gerichte therapieën5,6.
Weerstand tegen gerichte therapie mogelijk intrinsieke (d.w.z., primaire) of verworven (d.w.z., secundair). Intrinsieke resistentie beschrijft een DOVO gebrek aan respons op therapie, terwijl secundaire weerstand na een periode van reactie op drug behandeling7 optreedt. De laatste is veroorzaakt door uitbraken van kleine cohorten van tumorcellen binnen het grootste deel van de primitieve tumor of genesteld in de distale cryptische anatomische niches, tentoonstellen tot 90% weerstand aan één of meer gerichte therapeutische agenten. Moleculaire mechanismen ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van een resistentie aan gerichte therapie vooral gevolg van doel genmutaties en redundante activering van andere pro-overleving signaalroutes, waarvan begrip nog verre van compleet8 is.
In dit werk voorgesteld hebben wij een aanpak op tijd en goedkoop cost-effective om te onderzoeken in vitro mechanismen van verworven resistentie aan gerichte therapeutische agenten, de generatie van resistente cellulaire subklonen vanaf de beschrijving monddood maken procedures voor het herstellen van de gevoeligheid aan de Inhibitor van de omwenteling, een cruciaal instrument dat wordt gebruikt voor het testen en valideren van de werkhypotheses gebruikt. In het bijzonder werd onze aanpak gebruikt om te onderzoeken, in maagkanker, de resistentie-mechanismen voor trastuzumab (bijvoorbeeldHerceptin), een gehumaniseerd monoklonaal antilichaam gericht op het extracellulaire domein van HER2 eiwitten9. Trastuzumab + chemotherapie algemeen aanvaard wordt als de standaardbehandeling van de eerste regel voor HER2-positieve uitgezaaide borstkanker. Dankzij recente Preklinische studies waaruit blijkt dat anti-HER2 therapieën hebben belangrijke activiteit in beide in vitro en in vivo HER2-positieve maagkanker modellen10,11, moleculaire drugs gericht op HER2 geweest uitgebreid onderzocht in klinische proeven, zijn waarvan sommige nog niet afgerond, bij patiënten met gastro-oesofageale kanker12,13,14,15.
Deze studies hebben gewezen op het stijgende aantal patiënten ervaren weerstand tegen trastuzumab16, ook bij wat voor andere gerichte therapeutische remmers is waargenomen. In het bijzonder de respons van trastuzumab was 47% en de gemiddelde totale overleving voor patiënten op trastuzumab + chemotherapie was slechts 2.7 maanden langer dan voor patiënten op chemotherapie alleen17. Dit suggereerde dat terwijl primaire trastuzumab weerstand heerst, secundaire trastuzumab weerstand onvermijdelijk is. Daarom is er dringend behoefte aan het verduidelijken van de mechanismen waardoor HER2-gerichte therapie resistentie in maagkanker, wat nog problematischer gezien de intra-tumoral genetische heterogeniteit van deze neoplasie18.
Mechanismen van resistentie aan trastuzumab in maagkanker gebleken Daarnaast uitdagend om te verklaren, gedeeltelijk als gevolg van de moeilijkheden bij het verkrijgen van betrouwbare preklinische modellen vertegenwoordiger van deze aandoening. Oshima et al. rapporteerde een selectiemethode in vivo van trastuzumab-resistente maagkanker cellijnen, bestaande uit een herhaalde cultuur van een klein residueel peritoneale metastase na behandeling met trastuzumab19. Echter de noodzaak van een behuizing, specifieke dierlijke behandeling deskundigheid, en de goedkeuring van de dier-ethische Commissie toe bijgedragen dat het een methode en kosten-tijdrovend. De aanpak die we in dit werk beschrijven is eenvoudig en breed inzetbaar, en kan gemakkelijk worden uitgebreid tot het onderzoeken van de mechanismen van de weerstand tot andere therapeutische drugs in verschillende tumor histotypes20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Dit protocol is specifiek afgesteld voor de analyse van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de verworven resistentie aan trastuzumab van HER-positieve maagkanker cellijnen. Alle laboratoriuminstrumenten die nodig zijn worden gemeld in de Tabel van materialen.
1. generatie van gerichte therapie resistente subklonen
Nota: Dit is de meest kritische en moeilijk te standaardiseren stap in het protocol wijten aan het feit dat verschillende cellijnen verschillende gevoeligheden aan de gerichte therapeutische remmer onafhankelijk van hun histotype of drug-concentratie van de tumor vertonen kunnen gebruikt.
- Cultuur NCI-N87 cel lijn in RPMI medium aangevuld met foetaal kalfsserum (10%) en glutamine (2 mM, 1%), als een enkelgelaagde bij 37 ° C, en het zaad op 25 cm2 cultuur kolven.
- Als de startdosis aan het kweekmedium in elke kolf 10 µg/mL trastuzumab toevoegen. De cellen aan de startdosis bloot totdat zij weer gaan groeien.
Opmerking: De startdosis van de gerichte therapie-remmer moet 10-fold lager zijn dan de concentratie ervan plasma piek. Plasma piek concentratie is het hoogste niveau van concentratie van de drug gevonden in patiënt bloed meestal na meerdere doses van standaard therapie. Deze waarde kan worden opgehaald uit studies over farmacokinetiek. - Celgroei controleren met de trypan blauwe uitsluiting methode; celgroei (meestal na een periode van twee tot drie weken) wordt hervat, worden blootgesteld cellen tot een 10-fold hogere dosis concentratie van trastuzumab.
- Bloot cellen aan een geleidelijk aan stijgende dosis van trastuzumab (van 100 µg/mL tot 400 µg/mL) tot cellen blijven groeien (na ongeveer 2 weken) ondanks de aanwezigheid van een hoge drug concentratie (ten minste 2.5 - 4-fold hoger dan de plasma piek).
-
Uitvoeren van een clonogenic-test om te beoordelen van het niveau van weerstand tegen gerichte therapie bij elke wijziging in de concentratie van de doelgroep therapie-remmer in het kweekmedium en relatieve weerstand IC50 index (RR IC50) als volgt definiëren.
- Zaad 500 cellen in 24 multi goed cultuur platen.
Opmerking: 5 putten moeten worden voorbereid voor elke voorwaardenset. - Bloot cellen aan toenemende doel therapie remmer (trastuzumab) concentraties van 100 µg/mL tot 400 µg/mL.
- Incubeer de cellen in een CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 15 dagen.
- Na incubatie, repareren en vlek monsters als volgt.
- Medium en spoelen cellen met 10 mL 1 x PBS verwijderen. Neem 1 x PBS en voeg 2-3 mL van fixatie oplossing (1:7, acetic acid: methanol, (vol/vol)). De fixatie-oplossing verwijderen en toevoegen van 0,5% kristalvioletoplossing. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur
- De Kristalvioletoplossing zorgvuldig verwijderen door met een pipet zuigen en platen in leidingwater te spoelen uit elke kristalviolet oplossing residuen onder te dompelen. Drogen bij kamertemperatuur maximaal 2 dagen.
- Telling kolonies van meer dan 50 cellen met behulp van een omgekeerde Microscoop (4 X vergroting).
Opmerking: De twee onafhankelijke waarnemers zijn hiervoor nodig. - RR IC50 berekend als de verhouding tussen de waarde50 IC van doel-therapie-resistente subclone cellen en de waarde van de oorspronkelijke/naïef cellen.
- Zaad 500 cellen in 24 multi goed cultuur platen.
2. validatieprotocol voor de kandidaat-lidstaten gerichte therapie resistentie gen (R-gen)
Opmerking: Na de karakterisatie van genexpressie, handtekeningen die samenhangen met de verworven resistentie aan target therapie en elke kandidaat-gen als bestuurder van weerstand worden via onderzocht zal: a) RT-PCR, en b) de westelijke analyse van de vlek.
-
RT-PCR in real time
- Uittreksel totaal RNA van cellijnen, met behulp van zuur guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroform mengsel (Zie Tabel van materialen).
- Het uitvoeren van omgekeerde transcriptie (RT) Reacties met behulp van willekeurige hexamer inleidingen en de thermische cycler als volgt instellen: priming bij 25 ° C gedurende 5 minuten, RT bij 46 ° C gedurende 20 min, en RT inactivatie bij 95 ° C gedurende 1 min.
- Gebruik 400 ng van totale RNA voor een 20 µL reactie. Voorbereiden op het reactiemengsel monster als volgt: 7 µL RNase gratis H2O, 2 µL cDNA (10 ng/µL), 1 µL 20 x TL-geëtiketteerden doelgroepen gerichte sonde, en 10 µL 2 x Mix met buffer dNTPs en polymerase van DNA (Zie Tabel van materialen).
- 20 µL van het reactiemengsel toevoegen aan elke goed plaat en start het volgende programma: houden van de fase bij 50 ° C gedurende 2 minuten, bij 95 ° C gedurende 10 min (1 cyclus); dan 40 cycli bij 95 ° C voor 15 s en bij 60 ° C gedurende 1 minuut.
-
Westelijke vlek
- Schorsingen van de cel herstellen door toevoeging van 2 mL trypsine/EDTA-oplossing 0,05% en 2-3 min voor trypsine te werken.
- 2 delen van gemiddeld met 10% foetale runderserum te neutraliseren trypsine (bv2 mL medium voor elk 1 mL trypsine) samen en centrifugeer bij 1.200 x g gedurende 5 min. Discard supernatant en wassen cellen met koude 1 x PBS toevoegen.
- Centrifugeer bij 1.200 x g gedurende 5 min en weggeworpen. Resuspendeer de pellet cel met lysis-buffermengsel en incubeer op een rocker bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
- Het bedrag van lysis buffer is afhankelijk van het aantal cellen (bijvoorbeeld, 100 µL voor 1 x 106 cellen); Zorg ervoor om te bereiden verse lysis-buffermengsel telkens. Voor 1 mL lysis buffer voorbereiding (verlof op ijs): gebruiken van 975 µL M-PER zoogdieren lysate buffer, 15 µL protease en phosphatase inhibitors en 10 µL 100 µM PMSF remmers.
- Herstellen het supernatant eiwit door cel lysate centrifugeren bij 13.000 x g bij 4 ° C gedurende 15 minuten.
- De eiwit-concentraties bepalen met behulp van een BCA eiwit bepaling.
- 4 x LaemmLi monster Buffer toevoegen aan EiwitSteekproeven (minimaal 20-30 µg van eiwit) en warmte bij 100 ° C gedurende 3 minuten.
- Gebruik van geprefabriceerd 4-20% gels en laden van 20-30 µg LaemmLi eiwit oplossing en 5-10 µL van eiwit standaard per monster.
- Vul de westelijke vlek ring met TRIS/GLICYNE /SDS 1 x buffer en uitvoeren van gel bij 110 V voor 30-60 min (wanneer tijd Controleer de kleurstof bereikt het einde van de gel stopt, anders lopen voor een paar extra minuten)
- Electroblot eiwit overbrengen naar een membraan PVDF (Zie Tabel van materialen) met behulp van een semi-droge systeem.
- Het membraan door onderdompelen in de juiste eiwit oplossing (melk/BSA 5%) in het roteerapparaat bij kamertemperatuur gedurende 1 uur geblokkeerd.
- Maak een oplossing van de 1:400 met anti-IQGAP1 primair antilichaam in een melk-oplossing van 5% (Zie Tabel van materialen).
- Plaats het membraan in primair antilichaam oplossing op een shaker in een koude kamer 's nachts.
- De volgende dag, het negeren van de antilichaam-oplossing en geniet in T-TBS 1 x oplossing (1 x T-TBS: 1 x Tris Saline Buffer toegevoegd door Tween20 0,1%) in een roteerapparaat bij kamertemperatuur gedurende 7 minuten.
- Gooi T-TBS 1 x oplossing en vervangen. Herhaal dit 3 keer.
- Maak een 1:10,000 secundaire muis-antilichamen oplossing door toevoeging van antilichaam voor standaard Western blot detectie (Zie Tabel van materialen) en plaats het membraan op een shaker; laat bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Negeren van de antilichaam-oplossing en geniet in T-TBS 1 x oplossing in een roteerapparaat bij kamertemperatuur gedurende 7 minuten.
- Gooi T-TBS 1 x oplossing en vervangen. Herhaal dit 3 keer.
- Membraan voor 5 minuten weken in een chemiluminescentie oplossing, en beeld van het membraan op een chemiluminescentie imager.
3. herstel Target-therapie-remmer gevoeligheid door kandidaat-R-gen Knock-down
-
Voorbereiding van de cel
- Maak eencellige suspensie door trypsinebehandeling. Transfectie uitvoeren op de dag dat de cellen zijn verguld.
- Wassen NCI-N87 cellen met PBS en Incubeer bij 37 ° C met trypsine/EDTA-oplossing 0,05% voor 5-10 min. 2 toevoegen volume van RPMI gemiddeld met 10% foetale runderserum te neutraliseren trypsine (bv2 mL medium voor elk 1 mL trypsine).
- Cellen tellen met een hemocytometer met trypan blauw kleuring. Zaad 2.5 x 105 cellen (60% samenvloeiing) in een maatkolf van T25-cm-2 voor elke voorwaarde.
Opmerking: Het juiste aantal cellen voor het zaaien wordt bepaald door de verdubbeling tijd van de cellijn en de duur van het experiment. Het doel is te bereiken van het doel-gen knock-down voor de gehele duur van het experiment. Negen T25 cm2 flacons zijn ideaal voor Transfectie voorwaarden en de clonogenic assay (3 flacons voor besturingselementen, 3 flacons voor negatieve transfectie besturingselementen, 3 flacons voor gen-target transfectie).
- Maak eencellige suspensie door trypsinebehandeling. Transfectie uitvoeren op de dag dat de cellen zijn verguld.
-
Omgekeerde transfectie
- Bereiden van gen-target en negatieve controle transfectie mix voor elke kolf T25 cm2 als volgt.
- Verdun 12,5 µL van elk gen-targeting siRNA oligonucleotides of negatieve controle siRNA oligonucleotides in minimale essentiële transfectie medium (verhouding 1:55; Zie Tabel van materialen).
- Voeg een transfectiereagens kationische liposoom (1:1 verhouding met gentargeting siRNA oligonucleotides; Zie Tabel van materialen). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
Opmerking: Het totale volume van de transfectie mix is 700 µL. - 700 µL van het mengsel van de Transfectie aan elke T25 cm2 kolf toevoegen. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 1-3 dagen.
- Controleer of de gene knock-down door RT-PCR en westelijke vlekkenanalyse. Controleer of de impact van de vermeende R-gen knock-down op de restauratie van de gevoeligheid aan de gerichte therapeutische agent door kolonie vorming experimenten (Herhaal stap 1.5).
- Bereiden van gen-target en negatieve controle transfectie mix voor elke kolf T25 cm2 als volgt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 schetst het kader van de experimentele procedure. Drie maagkanker-cellijnen uiting van een hoog niveau van HER2 en gevoelig voor trastuzumab (IC50 < piek plasma niveau van drug, figuur 2A, linker grafiek) waren gegroeid in kweekmedium dat de gerichte therapeutische agent. Een dosis 10-fold lager dan de piek plasma concentratie van trastuzumab (10 µg/mL) werd ingesteld als de startdosis, en geleidelijk verhoogd naar 400 µg/mL gedurende een periode van 8-12 maanden. Daarna kregen we drie subklonen gekenmerkt door een stabiel weerstand fenotype met IC50 waarden lager dan de pieken van het plasma van trastuzumab (figuur 2A, juiste grafiek). In het bijzonder bereikt de meest resistente subclone, HR NCI N87, een RR IC50 waarde van 28.57 (figuur 2B). IQGAP1 lijkt te spelen een centrale rol in het fenotype van de weerstand van de HR NCI N87 subactielijn. De analyses van eiwitten en gene expressies ondersteund deze hypothese: de IQGAP1 eiwit in de resistente subclone is ongeveer 5-voudig hoger dan in de ouderlijke cellen. Ook is de correspondent IQGAP1 genexpressie 2.5-fold hoger in de HR NCI N87 subactielijn dan in de lijn van de NCI N87 (figuur 3A).
IQGAP1 gen zwijgen werd uitgevoerd om te evalueren van haar rol in de ontwikkeling van het resistente trastuzumab fenotype. Het protocol dat wordt gebruikt om te zwijgen IQGAP1 genexpressie bleek bijzonder doeltreffend aan het neerhalen van het eiwitgehalte van de IQGAP1 op bijna alle cellen in een T25 cm2 cel cultuur kolf (ongeveer 2.5 x 105 cellen) is gegroeid (figuur 3A).
Bovendien is de bepaling van de clonogenic bevestigd de werkhypothese, waaruit blijkt dat IQGAP1 gen tot zwijgen brengen herstelt trastuzumab gevoeligheid in HR NCI N87 cellen zoals blijkt door de verlaging van de IC50 waarde tot 7 µg/mL (figuur 3B).
Figuur 1: kader voor de in vitro analyse van de mechanismen die ten grondslag liggen aan verworven gerichte therapie resistentie. Drie verschillende trastuzumab-resistente subklonen afgeleid van drie verschillende trastuzumab-gevoelige kanker cellijnen werden gegenereerd en voor wijzigingen in de HER2-signalering mechanismen gekenmerkt door next-generation sequencing, immunohistochemische, Western Blot, en RT-PCR technieken. Alle subklonen toonde een verschillende resistentie mechanisme. Gerichte therapie gevoeligheid werd gerestaureerd in een specifieke subclone wanneer de kandidaat-bestuurder gen van weerstand werd het zwijgen opgelegd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Bepaling van de relatieve weerstand IC50 -index (RR IC50) via clonogenic assay in cellijnen van maagkanker. (A) groei curven gegevens voor naïef (linker grafiek) en resistente (juiste grafiek)-cellijnen gegenereerd door kolonievormende experimenten. De x-as vertegenwoordigt trastuzumab concentratie. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie (SD). De standaarddeviatie is nooit meer dan 5%. (B) representatieve beelden van de bepaling van de clonogenic ter ondersteuning van de generatie van een NCI-N87-resistant subclone. Zoals blijkt uit de tijdlijn, vereist de generatie van HR trastuzumab NCI N87 cellen 12 maanden van continue blootstelling aan de gerichte agent. Dit percentage is aangepast van het werk van Arienti et al. 9 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: herstellen trastuzumab gevoeligheid door IQGAP1 gen verpletterende. (A) IQGAP1 gehalte aan proteïnen, door densitometric analyse weergegeven in het staafdiagram in ouderlijke NCI N87 lijn, en in haar resistent en het zwijgen opgelegd-resistente subclone (linker grafiek). De mRNA IQGAP1 expressie niveau werd ook gecontroleerd in alle drie cellijnen door RT-PCR techniek (juiste grafiek). Gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. (B) Clonogenic assay toonde de verschillende gevoeligheid van ouderlijke NCI N87 lijn en in haar resistent en het zwijgen opgelegd-resistente subclone aan 100 µg/mL trastuzumab. De kolonie werd na 14 dagen cel zaad geteld. Miniatuur cijfers blijkt representatief kolonie culturen. Dit percentage is aangepast van het werk van Arienti et al. 9 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Stappen | Protocol | T25 cm2 |
| Zaad cellen 60% heuvels | Adherente cellen | 1.75 x 103 |
| Verdunde siRNA oligonucleotides in minimale essentiële transfectie medium (verhouding 1:55) | siRNA | 12.5 ΜL |
| Transfectie medium | 687.5 ΜL | |
| Toevoegen van Lipofectamine transfectiereagens | Lipofectamine-reagens | 12.5 ΜL |
| Incubeer | Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten | |
| Mengsel aan cellen toevoegen | Incubeer bij 37 ° C gedurende 1-3 d cellen | |
Tabel 1: Aanbevolen reagens bedragen en volumes voor kandidaat-resistentie gen knock-down.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Terwijl de persoonlijke en gerichte therapieën hebben ontlokte groeiend enthousiasme, deze zogenaamde 'slimme' therapieën gezicht de dezelfde grote hindernis als traditionele chemotherapie drugs, dat wil zeggen, de snelle en onvoorspelbare verwerving van medicamenteuze resistentie. Ter verbetering van de resultaten van gerichte therapie, moeten-resistentie problemen worden opgelost door middel van een beter begrip van de mechanismen die ze veroorzaken. Hier voorgesteld hebben we een algemeen toegankelijk in vitro -methodologie voor het onderzoek naar de mechanismen van verworven resistentie aan doelgerichte therapie drugs in kanker cel line-modellen.
De generatie van gerichte therapie-resistente subklonen is de meest kritische en moeilijk te standaardiseren stap in dit protocol, als gevolg van de intrinsieke genetische heterogeniteit tussen de regels van de cel gebruikt, en aan hun verschillende mate van gevoeligheid van de drug. Om deze redenen variëren de benodigde tijd voor het verkrijgen van resistente subklonen. Chronische blootstelling aan antikanker moleculaire agenten meestal veroorzaakt een sterke tumor groeiremming. Echter na een variabele periode van continu drug blootstelling (8-12 maanden) hervatten cellen groei met een tarief vergelijkbaar met die van onbehandeld controlegewas cellen.
Bovendien, ondanks dat genexpressie gegevens zijn gebruikt om het veronderstellen van gen-gerelateerde target therapie resistentie, een andere expressie niveau niet altijd weerspiegelen een onjuiste eiwitfunctie of correleren met het fenotype van de weerstand. Als gevolg van de complexiteit van de relatie tussen de expressie van het vermeende resistente gen en de weerstand tegen de gerichte therapie, zijn verder moleculaire onderzoeken nodig, zoals bioinformatics analyse, met inbegrip van gene/eiwit interactie, biologisch proces verrijking en moleculaire modellering.
Een ander kritisch punt zou de specificiteit en de nauwkeurigheid van siRNA oligonucleotide om doel expressie. Een mogelijke oplossing zou kunnen zijn het gebruik van ontwerpgereedschappen voor functionele siRNA, en een mengsel van siRNA voor hetzelfde doel gen te selecteren.
Tot slot is een kleine beperking gerelateerd aan de gebruikte methode voor het herstellen van de gevoeligheid aan de gerichte therapie-remmer te wijten aan de tijdelijke duur van transfectie. Maximale knock-down van target mRNA (> 85%) werd gemeld op dag 2 na transfectie en bleef > 80% door 5-7 dagen. Belangrijke knock-down, zij het in mindere mate nog steeds werd waargenomen op dag 6. Om deze reden moet de bepaling van de cytotoxiciteit voor het verifiëren van het herstel van de gevoeligheid van de drug worden uitgevoerd binnen ongeveer 5 dagen van gen tot zwijgen brengen.
Ons protocol is een tijd - en goedkoop cost-effective methode voor het onderzoeken van in vitro verworven resistentie. De generatie van resistente subklonen, zou kunnen spiegeling van de intra-tumor heterogeniteit van kankercellen, helpen onthullen nieuwe mechanismen van verworven resistentie aan antikanker gerichte agentia. In het bijzonder, zijn ze meer geschikt voor high-throughput genomic of proteomic vertoningen voor de identificatie van moleculaire veranderingen in resistente cellen dan hun gevoelige tegenhangers.
Deze preklinische platform kan eenvoudig worden uitgebreid om te onderzoeken van algemene weerstand mechanismen om gerichte therapeutische agenten in verschillende tumor histotypes, verstrekken van een standaardprocedure voor de ontdekking van verder drug targets te overwinnen van resistentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedank Dr. Veronica Zanoni voor het bewerken van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples |
| ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT | Bio-Rad | 1708891 | The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR. |
| TaqMan gene expression assay | Life Technologies | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end. |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells. |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard. |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample. |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 456-1094 | Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis. |
| Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards | Bio-Rad | 1610376 | Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD). |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | 10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE. |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 1704156 | Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane. |
| Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate | Bio-Rad | 1610381 | StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots. |
| Immun-Star WesternC solution | Bio-Rad | 5572 | Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein. |
| Universal Negative Control | Invitrogen | 12935300 | Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology. |
| opti-MEM Glutamax Medium | Thermo Fisher Scientific | 51985026 | Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology. |
| Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA | Ambion | 4390824 | RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types. |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778075 | Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types. |
| Mouse anti-IQGAP1 | Invitrigen | 33-8900 | working concentration: 1:400 in 5% milk solution |
| goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005 | Santa Cruz | sc-2005 | working concentration: 1:10000 in 5% milk solution |
| PMSF | Sigma Aldrich | P 7626 | this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase |
| Thermocycler for RT-PCR | MJ Research | MJ Research PTC-200 Thermal Cycler | it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers |
| Real Time RT-PCR instrument | Applied Biosystems | 7500 RT-PCR system | This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers |
| Microvolume Spectrophotometers | Thermo Scientific | Nanodrop | It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample |
| Blotting system | Bio-Rad | Trans-Blot Turbo system | It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes |
| Image acquisition system and gel documentation | Bio-Rad | Chemidoc image system | It is easy to use for chemiluminescent detection |
References
- Gerber, D. E. Targeted therapies: a new generation of cancer treatments. Am Fam Physician. 77 (3), 311-319 (2008).
- Zhang, J., Yang, P. L., Gray, N. S. Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nat Rev Cancer. 9 (1), 28-39 (2009).
- Nelson, A. L., Dhimolea, E., Reichert, J. M. Development trends for human monoclonal antibody therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 767-774 (2010).
- Chabner, B. A., Roberts, T. G. Timeline: Chemotherapy and the war on cancer. Nat Rev Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
- Gilbert, L. A., Hemann, M. T. Chemotherapeutic resistance: surviving stressful situations. Cancer Res. 71 (15), 5062-5066 (2011).
- Izar, B., Rotow, J., Gainor, J., Clark, J., Chabner, B. Pharmacokinetics, clinical indications, and resistance mechanisms in molecular targeted therapies in cancer. Pharmacol Rev. 65, 1351-1395 (2013).
- Ellis, L. M., Hicklin, D. J. Resistance to Targeted Therapies: Refining Anticancer Therapy in the Era of Molecular Oncology. Clin Cancer Res. 15 (24), 7471-7478 (2009).
- Asić, K. Dominant mechanisms of primary resistance differ from dominant mechanisms of secondary resistance to targeted therapies. Crit Rev Oncol Hematol. 97, 178-196 (2016).
- Arienti, C., et al. Preclinical evidence of multiple mechanisms underlying trastuzumab resistance in gastric cancer. Oncotarget. 7 (14), 18424-18439 (2016).
- Tanner, M., et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol. 16 (2), 273-278 (2005).
- Bang, Y. J., et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet. 376 (9742), 687-697 (2010).
- ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01130337. A Study of Capecitabine [Xeloda] in Combination With Trastuzumab [Herceptin] and Oxaliplatine in Patients With Resectable Gastric Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01130337 (2017).
- ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01748773. A Study of the Combination of Oxaliplatin, Capecitabine and Herceptin (Trastuzumab) and Chemoradiotherapy in The Adjuvant Setting in Operated Patients With HER2+ Gastric or Gastro-Esophageal Junction Cancer (TOXAG Study). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/show/NCT01748773 (2017).
- ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01472029. Explorative Phase II Study of Perioperative Treatment in Patients With Adenocarcinoma of the Gastroesophageal Junction or Stomach (HerFLOT). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029 (2017).
- ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01196390. Radiation Therapy, Paclitaxel, and Carboplatin With or Without Trastuzumab in Treating Patients With Esophageal Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01196390 (2017).
- Shimoyama, S. Unraveling trastuzumab and lapatinib inefficiency in gastric cancer: Future steps (Review). Mol Clin Oncol. 2 (2), 175-181 (2014).
- Kelly, C. M., Janjigian, Y. Y. The genomics and therapeutics of HER2-positive gastric cancer-from trastuzumab and beyond. J Gastrointest Oncol. 7 (5), 750-762 (2016).
- Wong, S. S., et al. Genomic landscape and genetic heterogeneity in gastric adenocarcinoma revealed by whole-genome sequencing. Nat Commun. 5, 5477 (2014).
- Oshima, Y., et al. Lapatinib sensitivities of two novel trastuzumab-resistant HER2 gene-amplified gastric cancer cell lines. Gastric Cancer. 17 (3), 450-462 (2014).
- Pignatta, S., et al. Prolonged exposure to (R)-bicalutamide generates a LNCaP subclone with alteration of mitochondrial genome. Mol Cell Endocrinol. 382 (1), 314-324 (2014).
